da arte abstracta
Durante a quimioterapia, a resistência aos medicamentos causada pela autofagia continua sendo um grande desafio para o sucesso do tratamento de pacientes com câncer. O objetivo deste estudo é mostrar que Ulinastatin (ITU), um inibidor da tripsina, pode reduzir a resistência das células de câncer de fígado de epirubicina agente quimioterapêutico (EPI). Conseguimos essa conclusão ao analisar o efeito da EPI sozinho ou UTI além de EPI em células de câncer de fígado MHCC-LM3 SMMC-7721 e. Também gerou uma linha de células de cancro do fígado resistente EPI (células MHCC-LM3er), e descobriu que UTI poderia sensibilizar as células LM3er à EPI. Autofagia normalmente funciona para proteger células cancerosas durante a quimioterapia. O nosso estudo mostrou que a ITU inibiu a autofagia induzida por EPI em células de cancro do fígado, o qual promoveu a apoptose e, por conseguinte, reduzidas a resistência das células cancerosas à EPI. Outros estudos mostraram que a inibição mediada pelo ITU em autofagia foi conseguida por inibição do factor de transcrição via de sinalização de factor nuclear-kB (NF-kB). Para verificar os nossos resultados in vivo, injectou MHCC-LM3 fígado células cancerosas ou células LM3er resistentes-EPI em ratos, e verificaram que o PAV só poderia inibir eficazmente o crescimento de tumores em ratinhos injectados com células MHCC-LM3, mas não em células LM3er camundongos -injected. No entanto, quando ITU também foi administrada, o crescimento de tumor foi inibido nos ratos injectados com células MHCC-LM3er bem. Nossos resultados sugerem que UTI pode ser usado em combinação com drogas anti-câncer, como EPI, para melhorar o resultado da terapia do cancro
Citation:. Canção B, Bian Q, Shao CH, Li G, Liu AA , Jing W, et al. (2015) Ulinastatin Reduz a resistência das células do cancro do fígado para Epirrubicina inibindo autofagia. PLoS ONE 10 (3): e0120694. doi: 10.1371 /journal.pone.0120694
Editor do Academic: Ying-Jan Wang, da Universidade Nacional Cheng Kung, TAIWAN
Recebido: 27 de setembro de 2014; Aceito: 26 de janeiro de 2015; Publicação: 27 de março de 2015
Direitos de autor: © 2015 Song et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
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financiamento:.. os autores não receberam qualquer financiamento específico para este trabalho
CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declaram que não há interesses concorrentes existem
Introdução
a autofagia é um processo celular essencial responsável pela degradação de organelas celulares danificadas e disfuncionais e agregados de proteínas. Este é um processo conservada entre fungos, plantas e células animais e é importante para fornecer fontes de energia em resposta ao estresse de nutrientes e em momentos críticos no desenvolvimento [1]. Em geral, a autofagia é um mecanismo de supressão tumoral em células normais e durante a transformação oncogénica inicial, mas pode também actuar como um caminho crítico para a sobrevivência de tumores estabelecidos. Desenvolvimento e tumores estabelecidos têm necessidades metabólicas elevadas devido ao aumento da proliferação e altos limiares apoptóticos. Neste caso, a autofagia serve como um mecanismo de sobrevivência em muitas células tumorais, o que lhes permite escapar da morte por apoptose em resposta à crise metabólica. Muitas drogas anti-câncer são projetados para imitar quimicamente privação de nutrientes e fome, mas a autofagia é muitas vezes sobre-regulada em resposta ao tratamento, eliminando a organela danificado para escapar da morte, e, portanto, gera resistência terapêutica [2-4]. Demonstrou-se que, ao aumentar a produção de espécies reactivas de oxigénio na mitocôndria, agentes quimioterapêuticos tais como os inibidores da histona-desacetilase [5] e cisplatina [6] induzem autofagia, e em muitos casos, a resposta autophagic a estes tratamentos é cito-protectora [ ,,,0],5]. Recentemente, tem sido sugerido que, combinando com agentes que rompem autofagia, a eficácia do fármaco anti-cancro pode ser reforçada [5].
Ulinastatin (ITU) é uma glicoproteína que contém glicosaminoglicanos e glicanos N-ligados . Inibe a actividade de uma vasta gama de enzimas incluindo tripsina, chymo-tripsina, calicreína, plasmina, etc. [7]. Clinicamente, a UTI é usado principalmente para tratar a pancreatite aguda, pancreatite recorrente crônica e insuficiência circulatória aguda [8, 9]. Estudos recentes têm mostrado que a ITU inibe o crescimento de muitos tipos de cancros, incluindo o cancro gastrintestinal e o cancro da mama, e podem induzir a morte celular, se for usado em conjunto com outros agentes terapêuticos [10-12]. Nos nossos estudos preliminares, ITU foi encontrada para ter efeito inibitório sobre autofagia. Desde autofagia desempenha um papel importante na resistência aos medicamentos em muitos tipos de células cancerosas [13, 14], que, portanto, a hipótese de que UTI pode reduzir a resistência aos medicamentos em células cancerosas por inibir a autofagia.
A epirubicina (EPI) é uma antraciclina fármaco amplamente utilizado em quimioterapia do cancro [15]. Ele alcança o tratamento através da indução de apoptose em células cancerosas. No entanto, pelo menos em células MCF-7 de cancro da mama, o EPI induz também autofagia que protege as células cancerosas, causando a resistência aos medicamentos [15]. Neste estudo, nós investigamos o efeito de UTI na autofagia induzida por EPI em células de câncer de fígado. Geramos um resistentes-EPI linhas celulares de cancro do fígado (células MHCC-LM3er) e estudou a regulação da autofagia nestas células. Também estudaram o efeito da UTI na autofagia e resistência às drogas nessas células cancerosas, e verificados os resultados in vivo. Verificou-se que a ITU suprimida autofagia induzida por EPI, a qual foi conseguida através da inibição da via de sinalização de factor de transcrição nuclear factor de-kB (NF-kB). Os nossos dados sugerem que a ITU pode ser utilizado como um agente terapêutico para auxiliar o tratamento do cancro por redução da resistência à droga nas células cancerosas.
Materiais e Métodos
Anticorpo, linhas celulares, plasmídeos e outros materiais
mouse anti ACTB, coelho anti-p IKKα, anticorpos p-Nemo (Santa Cruz, EUA) foram utilizados na diluição 1: 200. Coelho anti LC3, rato anti IKKα, rato anti Nemo, e coelho anti PARP, Atg5, ATG7, SQSTM1, anticorpos BECN1 (sinalização celular, EUA) foram utilizados na diluição 1: 1.000. O anti sistema de rotulagem do mouse EnVision coelho marcado com HRP foi de Xangai Changdao Biotech Inc.
linhas celulares de cancro do fígado células hepáticas normais SMMC-7721 e MHCC-LM3, e foram presentes de Segunda Universidade Médica Militar, Xangai. PcDNA3.1-GFP-LC3 foi obtido de Cirurgia Oriente Hepatobiliary Hospital, Segunda Universidade Médica Militar, na China. As linhas celulares de cancro utilizados no estudo foram adquiridos a partir Cell Bank of Type Culture Collection da Academia Chinesa de Ciências, Xangai Instituto de Biologia Celular, da Academia Chinesa de Ciências, onde foram caracterizados por detecção de vitalidade das células, DNA-impressão digital, detecção de isozima e detecção de micoplasma. Estas linhas celulares foram imediatamente congelados e expandido de modo que pudessem ser reiniciado a cada 3 a 4 meses a partir de um frasco congelado do mesmo lote de células.
IMR (Médio hepatobiliar Cirurgia do Hospital, Segunda Military Medical University, China) foi utilizada na concentração de 2,5 uM. ITU (Techpool Bio-Pharma, Guangdong, China) foi usado na concentração de 1000 U /mL. Ditiocarbamato de pirrolidina (PDTC) (Beyotime Inc., Xangai, China) foi utilizado na concentração de 10 uM. A cloroquina (CQ, 10 uM) e 3-metiladenina (3-MA, 10 mM) (Sigma-Aldrich, EUA) foram utilizados para a inibição da autofagia. Os ratos foram mantidos e tratados de acordo com as diretrizes da universidade e usam protocolos animais foram aprovados pelos Conselhos de Ética do Hospital Cirurgia Oriente Hepatobiliary.
cultura de células, transfecção, Determinação celular Crescimento e Geração de fármaco-resistente MHCC-LM3 Linha celular
Todas as células de cancro do fígado foram cultivadas em DMEM com 10% de FBS a 37 ° C em uma 7% de CO
2 incubadora, e transfectadas com Lipo2000 (Genechem Inc., Coreia) na confluência 60-70%. O crescimento celular foi determinada com um kit de MTS (Promega, EUA), seguindo as instruções do fabricante. A linha celular MHCC LM3-resistente a drogas foi gerado como descrito anteriormente [15]. Resumidamente, as células MHCC-LM3 foram semeadas em frascos de cultura e foram autorizados a chegar ~ 80% de confluência em meio fresco antes de ser tratados com EPI. A dose de partida de PAV foi de 0,05 uM, e cada dose seguinte foi 25-50% mais elevado na concentração do que a dose anterior, até que as células eram estáveis em proliferação sem morte celular significativa.
-PCR em tempo real
o ARN total foi extraído com RNeasy Mini kit e QIAshredder (Qiagen), e a primeira cadeia de cDNA foi sintetizada com a First-Strand cDNA Synthesis kit (Abigen Biotechnology Co. Ltd.), seguindo as instruções dos fabricantes. PCR em tempo real foi realizada com LightCycler 1.5 (Roche) seguindo o protocolo do fabricante, e foram utilizados os seguintes iniciadores: para Beclin1: 5′-GGCTGAGGGATGGAAGGGTCTAAG-3 ‘e 5′-GTTTCGCCTGGGCTGTGGTAAGTA-3′; para Atg5: 5’-ATGACAGATGACAAAGATG-3 ‘e 5′-CTCATAACCTTCTGAAAGTG-3′; para At g7: 5’-ATGGGGGACCCTGGACTGG-3 ‘e 5′-GCAGAGTCACCATTGTAG-3′; para P62: 5’-ACTGATGGCTGTAACGGTCTA-3 ‘e 5′-GGAAGCAGATGGCACAGAGG-3′; e para GAPDH:. 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘e 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’
Ensaio de Apoptose
células foram lavadas com PBS frio foram re-suspensas em tampão de ligação (Beyotime Inc. , Shanghai, China) e, em seguida, suplementado com 2 jil de anexina V-FITC (20 ug /ml) antes de serem analisadas por citometria de fluxo.
Autophagy Assays
células a 70-80% de confluência foram transfectadas com pcDNA3.1-GFP-LC3 com Lipo2000. As células foram então observadas ao microscópio de fluorescência e as células com pelo menos 3 pontos verdes foram consideradas células autofágicos. A percentagem de células autofagia = autofágicos /células totais x 100%. Para observação ao microscópio electrónico, as células foram lavadas com PBS foram sedimentadas e o sedimento celular foi fixado em 2,5% de dialdeído glutárico a 1% e ácido ósmico durante 2 h. Após a lavagem, o sedimento foi desidratados e embebidos em resina epoxi. As seções de ultra-fina (45 nm) foram coradas com acetato de chumbo, e os cortes corados foram observadas em microscópio eletrônico JEM-2000EX [16]. Para controlar o fluxo autophagic, a construção em série de adenovírus MRFP-GFP-LC3 obtido a partir de Hanbio Inc (Xangai, China) foi utilizado neste estudo. A proteína exibiram fluorescente verde (GFP) e proteína fluorescente vermelha (RRP) contou com diferente sensibilidade do pH para monitorar a progressão do fluxo autofágica. Em resumo, a construção MRFP-GFP-LC3 capitalizada na diferença entre a pH ácido e o autolysosome autophagosome neutro para monitorar a progressão do autophagosome para autolysosome usando microscopia confocal [17].
xenoenxerto em ratinhos nus
ratinhos nus machos (4-6 semanas de idade e 15-20 g de peso, adquiridos de Instituto de material Médico de Xangai, Academia chinesa de Ciências Médicas) foram mantidas a 25 ~ 27 ° C com 45 ~ 50% de umidade . ratinhos nus foram mantidos e tratados de acordo com as diretrizes da universidade e usam protocolos animais foram aprovadas pelos Conselhos de Ética do Hospital Cirurgia Oriente Hepatobiliary. células MHCC-LM3 e células resistentes a fármacos MHCC-LM3er foram colhidas e re-suspensas em PBS a 5 × 10
6 células /0,2 ml de PBS. Para cada ratinho, a 200 ul da suspensão de células foi injectada sob a pele no ombro direito. IMR (5mg /kg) e ITU (20000 /rato) foram injectadas em tumores cada 3 days.30 dias mais tarde os ratinhos foram sacrificados para mais investigação. Os tamanhos dos tumores foram calculados utilizando a fórmula V = ab
2/2 (a: maior diâmetro do tumor, b: diâmetro mais curto)
Resultados
UTI Inibe Autophagy induzido. por EPI
EPI tem sido relatado para induzir a autofagia em células de câncer de mama e provoca resistência à droga [15]. À verificação se ele tem o efeito similar em células de câncer de fígado, que trataram células SMMC-7721 com EPI em várias concentrações para determinar o intervalo que a EPI pode efetivamente induzir autofagia [15, 18]. Como mostrado na Fig 1A, autofagia aumentou de uma forma dependente da concentração PAV. Com base nesse resultado, escolhemos uma concentração moderada de 2,5 mM para estudos posteriores. Em seguida, nós verificado que se EPI induzida autofagia em outras células de câncer de fígado. EPI poderia melhorar significativamente a autofagia em SMMC-7721, Huh-7 e células HCC-LM3 e levemente em células 97H (Fig 1B). Tem sido demonstrado que CQ poderia inibir a infusão de autofagossomas e lisossomas, resultando na acumulação de autofagossomas e expressão LC3-II. Entretanto, 3-MA inibe classe I, bem como PtdIns3Ks classe III, que é necessária para a formação autofagossomas [16]. Com os dois inibidores da autofagia, nós validado que EPI poderia melhorar todo o processo de autofagia, incluindo autofagossomas e autolysosomes formação (Fig 1C). Em seguida, queríamos saber se a autofagia induzida por EPI poderia ser inibida pela UTI. Para este efeito, foram tratados SMMC-7721 e MHCC-LM3 células com IPE ou EPI + ITU, o aumento de LC3-II e diminuição de SQSTM1 foram significativamente inibida pelo tratamento com o PAV + ITU, sugerindo que a autofagia induzida por EPI foi inibida pela a adição de ITU (Figura 1D). Este resultado foi ainda apoiada pela observação de que a ATG7, expressões Atg5 e BECN1 diminuiu e expressão SQSTM1 aumentou tanto ao nível do ARNm (Figura 1E) e o nível de proteína (Figura 1F) em células a ser tratada com o PAV + ITU comparação com as células sendo tratados apenas com EPI. Nas células transfectadas com pcDNA3.1-GFP-LC3, a expressão de GFP-LC3 (pontos verdes) foram também significativamente reduzidos nas células a ser tratada com o PAV + ITU comparando com que, sendo as células tratadas só com IPE (Figura 1G ). Além disso, comparando com as células a ser tratada com o PAV, a quantidade de vesículas autofágicos em células a ser tratada com o PAV + ITU também foi reduzido de forma significativa, como observado ao microscópio electrónico (Figura 1H). Para confirmar ainda mais a função de UTI no fluxo autofágica, vamos verificar o número de autofagossomas e autolysosomes em células MHCC-LM3 tratados com EPI ou EPI + UTI, UTI poderia reduzir significativamente o fluxo autophgic (Fig 1I). Juntos, estes resultados sugerem fortemente que a ITU inibe autofagia induzida por EPI em células de cancro do fígado.
(A) A expressão de LC3-II foi detectada em lisados de SMMC-7721 células tratadas com diferentes doses de PAV. (B) O nível LC3 foi detectada em diferentes células de câncer de fígado tratados com EPI (2.5μM) ou não durante 24 horas. (C) Western blot mostrou que o nível de LC3-II em SMMC-7721 células tratadas com IPE (2.5μM) com /sem CQ (10 uM) /3-MA (10 mM) a diferentes pontos de tempo. (D) moléculas indicadas foram detectados com imunotransfer�cias em células MHCC-LM3 SMMC-7721 e tratados com EPI /EPI + UTI para os tempos indicados. (E) PCR em tempo real mostra os níveis de mRNAs de genes relacionados com a autofagia em MHCC-LM3 e células SMMC-7721 tratados com EPI ou EPI + UTI. (F) Western blot mostra os níveis de proteínas de genes relacionados com a autofagia em MHCC-LM3 e células SMMC-7721 tratados com EPI /EPI + UTI durante 24 horas. (L) PAV /PAV + ITU foram adicionados a células MHCC-LM3 durante 24 h após a transfecção GFP-LC3. painel superior, coloração GFP-LC3; painel inferior, gráfico mostra a fracção de células autofágicos. micrografia (H) Electron de vesículas autofagia em células MHCC-LM3 tratados com EPI + EPI + UTI. As imagens de alta resolução ampliadas das áreas quadradas foram mostrados. células MHCC LM3-infectadas com adenovírus GFP-MRFP-LC3 durante 24 h (I), em seguida, tratada withEPI /PAI + ITU. Imagens representativas e gráficos foram mostrados. A experiência foi repetida 3 vezes. (* P 0,05, ** P 0,01).
UTI promove a apoptose induzida por EPI
Como um medicamento de quimioterapia, EPI elimina as células cancerosas através da indução de apoptose [19]. Uma vez que temos mostrado que UTI inibe a autofagia induzida por EPI, suspeitamos que UTI pode também promover a apoptose câncer nestas células. Para saber se a UTI tem qualquer efeito sobre a apoptose induzida por EPI, primeiro verificado se a combinação de EPI e UTI pode causar efeito tóxico nas células do fígado normal. Como mostrado na Fig 2A, não houve diferença significativa na sobrevivência entre as taxas de grupo EPI e grupo EPI + ITU, sugerindo que a EPI + ITU não causaria mais morte celular em células normais do fígado. Em seguida, examinamos a quantidade de células de câncer de fígado SMMC-7721 e MHCC-LM3 tratados com EPI ou EPI + UTI, e descobriu que o número de células foram significativamente menores se ambos EPI e UTI foram adicionados (Fig 2B). A clivagem de PARP, um indicador de apoptose, também foi melhorada em células tratadas com PAV + ITU comparando com que nas células tratadas com PAV sozinho (Figura 2C). Além disso, o tratamento com PAV + ITU resultou na diminuição do nível de inibidor de apoptose Bcl-2 e aumentou a clivagem de caspase-3 (figura 2D). Em apoio deste resultado, coloração Anexina V mostrou que a percentagem de células que foram submetidas a apoptose foi mais elevada em células tratadas com PAV + ITU (Figura 2E). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem fortemente que a ITU promove a apoptose quando é usado em combinação com o PAV, e poderia potencialmente aumentar a eficácia de EPI no tratamento do cancro.
(A) Percentagem de sobreviventes L02 células tratadas com PAV /EPI + ITU /UTI. (B) Percentagem de células sobreviventes de câncer de fígado MHCC-LM3 SMMC-7721 e sob o tratamento de EPI /EPI + ITU /UTI para os tempos indicados. (C, D) Western blot de moléculas indicados foram mostrados em SMMC-7721 e MHCC- LM3 células de câncer de fígado no âmbito do tratamento de EPI /EPI + UTI (tratamento em D durante 24 h). ACTB foi transferido como um controlo de carga. (E) anexina V coloração mostra a percentagem de células sofreram apoptose sob o tratamento de EPI /EPI + UTI para os tempos indicados. Painel esquerdo foi resultado médio de 3 experimentos; painel da direita foi resultado representativo. Os resultados são média de 3 experiências independentes, (* P 0,05, ** P 0,01).
UTI Promove EPI-Induced apoptose em células do cancro do fígado por inibir a autofagia
A autofagia desempenha funções de protecção indispensáveis na morte celular induzida por EPI em células de câncer [15, 20]. Sabendo que UTI promove a apoptose induzida por EPI, que queria saber se isso foi conseguido através da inibição da autofagia, que também foi induzida por EPI. Para esta finalidade, foi gerada uma linha celular resistente a EPI LM3er através da aplicação de uma dose baixa de PAV a célula meios de cultura ao longo de um período de tempo (ver Materiais e Métodos). Para ambas as células MHCC-LM3er e as células de controlo não resistentes EPI (MHCC-LM3), adicionamos EPI e descobriram que o número de células sobreviventes MHCC-LM3er era maior do que a das células MHCC-LM3, e menos MHCC- LM3er células sofreram apoptose do que as células de controlo (Fig 3A). Este resultado indicou que as células resistentes-EPI (MHCC-LM3er) foram melhor protegidas contra a apoptose induzida por EPI. Para descobrir se a resistência à EPI era devido ao aumento da actividade autophagic em células MHCC-LM3er, examinámos a expressão basal de vários marcadores autophagy e descobriram que nas células MHCC-LM3er, os níveis de mRNA de ATG7, Atg5 e BECN1 foram superiores que as células no controle (Fig 3B). Também examinamos os níveis basais de várias proteínas relacionadas à autofagia, e descobriu que os níveis de LC3-II, ATG7, Atg5 e BECN1 aumentou em células MHCC-LM3er bem, ao passo que o nível de SQSTM1 diminuiu (Fig 3C). microscopia de fluorescência também mostrou que, comparando com as células de controlo, havia mais células autofágicos no grupo MHCC-LM3er (Fig 3D). Além disso, sob o microscópio de elétrons, encontramos mais vesículas autofagia em células MHCC-LM3er (Fig 3E). Assim, estes resultados sugerem que as células MHCC-LM3er-resistentes EPI têm maior actividade autophagic basal do que nas células de controlo. Além disso, descobrimos que as células MHCC-LM3er poderia resistir à morte celular induzida por EPI comparando com células MHCC-LM3 e inibição da autofagia com 3-MA poderia bloquear completamente a resistência das células MHCC-LM3er à EPI. Os resultados semelhantes também foram obtidos quando UTI foi utilizada (Fig 3F e 3G). Este resultado sugere fortemente que UTI promove a apoptose induzida por EPI em células de câncer de fígado por inibir a autofagia.
(A) Percentagem de células sobreviventes MHCC-LM3 e LM3er sob o tratamento de EPI. painel inferior mostrou as percentagens de células MHCC-LM3er anexina V-positiva MHCC-LM3 ou. (B) PCR em tempo real mostraram os níveis de mRNA de Atg5, ATG7 e BECN1 em células MHCC-LM3 e MHCC-LM3er. (C) Western blot de LC3-I, LC3-II, ATG7, Atg5, BECN1 e SQSTM1 em células LM3 e LM3er. ACTB foi um controlo de carga. (D) pontos GFP-LC3 em células MHCC-LM3 e LM3er. painel superior, microscopia de imunofluorescência mostrou a imagem representativa de pontos GFP-LC3, eo painel inferior estava fração de células autofagia em células MHCC-LM3 ou MHCC-LM3er. micrografia (E) Electron de vesículas autofagia em células MHCC-LM3 e LM3er. As imagens de alta resolução ampliadas das áreas quadradas foram mostrados. (F) Percentagem de sobreviver (painel superior) e anexina V células-positivas (painel inferior) em células MHCC-LM3 e LM3er sob o tratamento de EPI /EPI + 3-MA ou EPI /EPI + UTI. Os resultados são uma média de 3 experiências independentes (* P 0,05, ** P 0,01).
ITU Regula Autophagy através da inibição de NF-kB via de sinalização de via de sinalização
NF-kB regula positivamente autofagia [14, 21, 22]. UTI poderiam inibir a activação do NF-kB via de sinalização [23, 24]. Nós portanto especulado que a ITU pode inibir autofagia nas células de cancro do fígado através da supressão da via de sinalização de NF-kB. Para testar esta hipótese, as células tratadas MHCC-LM3 SMMC-7721 e com o PAV sozinho ou EPI + ITU, e descobriu que a actividade de NF-kB foi suprimida em células ITU (Figura 4A) suplementado. Este resultado foi suportado pela inibição da fosforilação de IKK-α e nemo (Fig 4B). Além disso, descobrimos que a adição de PDTC, um inibidor da via de sinalização de NF-kB, a células-MHCC LM3 inibiram a fosforilação de IKK-α e a expressão de LC3-II (Figura 4C). Estes resultados sugerem que a ITU inibe autofagia por suprimir a via de sinalização de NF-kB. Para saber se a adição das drogas, UTI ou PDTC, promoveu a apoptose induzida por epirubicina nas células de câncer de fígado, nós adicionamos EPI, EPI + UTI, EPI + PDTC, ou EPI + UTI + PDTC para SMMC-7721 e MHCC -LM3 células de câncer de fígado, e observou porcentagem similar de células sobreviventes em EPI + UTI, EPI + PDTC ou EPI + UTI + PDTC células suplementadas. Particularmente, não houve qualquer efeito adicional sobre a morte celular, se ambos ITU e PDTC são adicionados, o que sugere que ambos ITU e PDTC promover a apoptose em um mesmo mecanismo, que é inibir a sinalização autofagia regulada por via de NF-kB (Fig 4D e 4E) .
(a) a actividade de NF-kB relativo em células MHCC-LM3 SMMC-7721 e sob o tratamento de EPI /EPI + UTI durante 24 h. (B) Western blot de p-IKK alfa e p-Nemo, em comparação com os níveis de proteínas totais de IKK alfa e Nemo, respectivamente, em SMMC-7721 e MHCC-LM3 células de câncer de fígado no âmbito do tratamento de EPI /EPI + UTI para 24 h. ACTB é um controlo de carga. (C) Western blot da alfa p-IKK, alfa total IKK, LC3-I e LC3-II em células MHCC-LM3 sob o tratamento de EPI /EPI + UTI /EPI + PDTC durante 24 h (D, E) Percentagem de sobrevivendo (D) e as células V-positivos anexina (e) em SMMC-7721 e as células MHCC-LM3 sob o tratamento de EPI /EPI + UTI /EPI + PDTC /EPI + UTI + PDTC durante 24 h. Os resultados são a média de 3 experiências independentes (* P 0,05, ** P 0,01)
ITU também promove a apoptose através da inibição de NF-kB via de sinalização induzida por Autophagy na Vivo
Para provar o nosso resultado acima in vivo, injetamos células MHCC-LM3er resistentes-EPI MHCC-LM3 ou sob a pele em ratos (n = 6), e descobriu que a administração de EPI poderia inibir o crescimento de tumores em MHCC-LM3 ratinhos injectados com células, mas em menor grau em ratinhos injectados com células MHCC-LM3er. No entanto, quando ITU foi administrada, o crescimento do tumor em ratinhos injectados com células MHCC-LM3er foi inibida, e a taxa de crescimento foi semelhante à que nos ratinhos injectados com células MHCC-LM3 (Fig 5A e 5B). Para descobrir se ITU inibida a via de sinalização de NF-kB in vivo, administrou-se sozinho ou EPI EPI + UTI aos ratinhos e analisaram a actividade da via de sinalização de NF-kB nos tumores. Verificou-se que, comparando com ratinhos de controlo, o nível de LC3-II e as fosforilações de IKKα e nemo foram todos reduzidos nos tumores de murganhos administrados tanto com PAV + ITU, indicando a inibição do NF-kB via de sinalização (Fig 5C e 5D). Este resultado sugere que a ITU promove a apoptose através da inibição de NF-kB autofagia sinalização regulada por via in vivo.
(A, B) Os tamanhos dos tumores (A) e a curva de crescimento do tumor (B) a partir de ratinhos xenoenxertados com MHCC-LM3 ou células MHCC-LM3er (n = 6) tratados com EPI /EPI + UTI. A curva de crescimento foi obtido a partir de medições múltiplas dos diferentes ratos do mesmo grupo. (C) Análise Histoimmunochemical mostra a expressão de p-IKKα e p-Nemo em ratos de xenotransplante sob o tratamento de EPI /EPI + UTI. (D) Western blot de p-IKKα e p-Nemo em amostras de ratos de xenotransplante sob o tratamento de EPI /EPI + UTI. ACTB é um controlo de carga. Os resultados são a média de 3 experiências independentes (* P 0,05, ** P 0,01).
DISCUSSÃO
Independentemente do tipo de câncer, resistência à droga continua a ser um grande desafio para o sucesso tratamento quimioterápico para pacientes com câncer [25]. É evidente que é importante identificar e desenvolver novas estratégias terapêuticas para melhorar o resultado do tratamento do câncer. A autofagia é uma faca de dois gumes no câncer, ele funciona como ambos os mecanismos anti e pró-câncer [26]. No cancro do fígado, a autofagia pode proteger o fígado por suprimir a inflamação, danos no tecido e instabilidade do genoma para inibir a iniciação do câncer; Por outro lado, é necessária para a sobrevivência de células de cancro e desenvolvimento de cancro [26]. Muitas terapias de cancro actuais, incluindo a quimioterapia e radiação terapêutica, impõem stress metabólico em células cancerosas e induzir autofagia, que por sua vez, proteger as células da apoptose e causar resistência ao fármaco. Portanto, o uso de inibidores autofágicos em combinação com agentes terapêuticos podem em especial melhorar a eficácia terapêutica [25, 27].
UTI é um importante inibidor de tripsina, e estudos recentes têm demonstrado que ele funciona com outros agentes quimioterapêuticos para promover a apoptose, resultando na inibição do crescimento do tumor, pelo menos parcialmente, devido ao seu efeito inibitório sobre muitas vias de sinalização envolvidos no crescimento [10, 11, 28-30]. Nos nossos estudos preliminares, verificou-se que era ITU inibidor de autofagia, e, portanto, também a hipótese de que ele pode melhorar a terapia do cancro através da inibição da autofagia e reduzir a resistência a fármacos quimioterapêuticos em células cancerosas. Com efeito, os nossos dados mostram que em células de cancro do fígado, ITU para inibir a elevação de autofagia induzida por EPI, um fármaco quimioterapêutico largamente utilizado cancro. Quando foi usada em combinação com PAV, ITU promoveu a apoptose nas células. Este resultado sugeriu que as células no cancro do fígado, ITU sozinho teve um efeito mínimo sobre a proliferação celular, mas quando foi aplicado em conjunto com o PAV, que aumentou a apoptose induzida por EPI, muito provavelmente por inibição da autofagia (Fig 2B). Este resultado foi ainda apoiada pela observação de que em células epi-resistentes, ITU foi capaz de sensibilizar de forma eficaz as células à EPI por inibição autofagia (Figura 3).
Uma vez que o NF-kB é relatado para regular positivamente autofagia, testamos se UTI inibida autofagia suprimindo via de sinalização de NF-kB. Os nossos resultados mostraram que a adição de ambos EPI e ITU para as células do cancro do fígado, inibiram significativamente a actividade de luciferase de NF-kB, e reduziu a fosforilação de IKK-α e nemo, um resultado também foi verificada por meio de estudos in vivo. Estes resultados sugerem fortemente que a via de sinalização de NF-kB é inibida quando ambos EPI e ITU são aplicados. Para provar que a supressão da via de sinalização de NF-kB conduziria à inibição da autofagia, que inibiu a NF-kB via de sinalização através da adição de PDTC, um conhecido inibidor de NF-kB via de sinalização, para as células em conjunto com o PAV, e observaram a inibição da autofagia como esperado. Este resultado apoia fortemente a nossa hipótese de que, como PDTC, UTI poderia inibir a autofagia através da inibição da via de sinalização de NF-kB. Para provar ainda que tanto UTI e PDTC agiu na mesma via de sinalização, ao invés de trabalhado de forma independente para regular a apoptose, nós adicionamos dois PDTC e UTI juntamente com EPI às células cancerosas, mas não se observou qualquer aumento da atividade apoptose. Este resultado apoia fortemente a nossa conclusão de que UTI e PDTC não trabalham sinergicamente e UTI só foi tão eficaz como PDTC na inibição da via de sinalização de NF-kB para promover a apoptose.
resistência à droga induzida por autofagia em células de câncer tem sido um desafio para o tratamento do cancro [31]. estratégias de combate à autofagia têm sido usados em muitos ensaios clínicos registradas no Instituto Nacional do Câncer nos EUA em uma variedade de cancros humanos [32]. No entanto, CQ ou HCQ (hidroxicloroquina) foram utilizados para inibir a infusão dos lisossomas autofagossomas e na maioria dos ensaios clínicos, o uso de outros inibidores autophagy que poderiam restringir a formação de autofagossomas nos ensaios clínicos não foram relatados. ITU tem sido utilizado para o tratamento de outras doenças, tais como pancreatite aguda, e os nossos resultados demonstraram que a ITU poderia inibir autofagia induzida por EPI e promovem a apoptose durante a terapia do cancro, muito provavelmente por inibição da via de sinalização de NF-kB. EPI é um agente de quimioterapia do cancro amplamente utilizado, mas também pode causar resistência aos fármacos através da indução de autofagia. A nossa descoberta de que implica ITU pode ser utilizado em combinação com drogas anti-cancro, tais como IMR para melhorar o resultado da terapia do cancro. Além disso, os resultados também podem lançar luzes sobre a aplicação da UTI em outros campos clínicos.