Abstract

Polycomb repressiva Complexo 2 (PRC2) é um regulador epigenética induzida em muitos tipos de câncer. Pensa-se para conduzir tumorigênese reprimindo divisão, stemness, e /ou reguladores do desenvolvimento. Cancros evitar a detecção imunológico, e diversos reguladores imunes são perturbados em tumores diferentes. Não está claro como tais efeitos específicos de células são coordenadas. Aqui, mostramos um papel profundo e câncer seletivo para PRC2 na repressão múltiplas vias citocinas. Nós achamos que PRC2 reprime centenas de IFN-y estimulada genes (ISGs), citocinas e receptores de citocinas. Este repertório alvo é significativamente ampliado no câncer vs células não cancerosas, e é distinta em diferentes tipos de câncer. PRC2 é, por conseguinte, um regulador de ordem superior do sistema imunitário em células de cancro. Inibindo PRC2 quer com inibidores de ARNi ou EZH2 activa promotores de receptores de citoquinas /citocinas marcadas com bivalente cromatina H3K27me3 /H3K4me3, e aumenta a capacidade de resposta a diversos sinais imunes. PRC2 salvamentos inibição da indução do gene imune, mesmo na ausência de SWI /SNF, um supressor de tumor defeituoso em ~ 20% dos cancros humanos. Esta nova função PRC2 em células tumorais poderia impactar profundamente o mecanismo de acção e eficácia dos inibidores EZH2 no tratamento do câncer

Citation:. Abou El Hassan M, Huang K, Eswara MBK, Zhao M, Song L, Yu T , et ai. (2015) Cancer Cells Hijack PRC2 Para modificar vários citocinas Pathways. PLoS ONE 10 (6): e0126466. doi: 10.1371 /journal.pone.0126466

Editor do Academic: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, United States |

Recebido: 29 Dezembro, 2014; Aceito: 03 de abril de 2015; Publicação: 01 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Abou El Hassan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão disponíveis a partir da base de dados GEO, sob o número de acesso GSE67766. Este é um número Superseries, e dentro desse conjunto de dados existem arquivos individuais para todo o microarray, Chip-chip, e os dados de RNA-Seq

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por RB: 703.079 Canadian Cancer Society (http: //www.cancer.ca/research), RB: MOP 74570 Canadian Institutes of Health Research (https://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html), RB: KF12-02 Krembil Foundation (http : //www.krembilfoundation.ca/), JJ: R01GM103893 Institutos Nacionais de Saúde (US) NIH (https://www.nih.gov/)

Conflito de interesses:. Os autores declararam que nenhum existem interesses conflitantes.

Introdução

as células cancerosas utilizam várias estratégias para iludir o sistema imunológico, incluindo a regulação de citocinas ou outros fatores secretados /receptores que controlam a resposta imune [1]. Notavelmente, o tipo, localização e grau de infiltrado imune em um tumor (a “Immunoscore”) prever o resultado melhor do que uma multiplicidade de parâmetros patologia tumoral centrada tradicionalmente utilizadas, como grau do tumor [2]. Os factores que controlam a vigilância imunológica variar contextualmente e os detalhes são complexos, porque os agentes que promovam a depuração imunológica em uma situação promover a supressão imune num outro (revisto em [3]). Uma noção atraente é que os tumores podem utilizar um mecanismo comum para manipular a expressão dos reguladores do sistema imunológico, e que cada tumor adapta esta estratégia para se adequar ao seu ambiente individual. Interrompendo uma rede de regulação de nível superior, tais poderia fornecer uma estratégia geral para aumentar a detecção imunológico e alívio de muitos cânceres. No entanto, os mecanismos que controlam a miríade de genes imunológicos que influenciam a vigilância não são bem compreendidos.

repressiva Polycomb Complexo 2 (PRC2) é o regulador epigenética que os depósitos marcas repressor histona H3 lisina 27 (H3K27me3) na cromatina. Dois dos seus principais componentes incluem a subunidade catalítica EZH2, e SUZ12, a proteína andaime necessário para a estabilidade do complexo [4]. PRC2 é parte da família Polycomb dos reguladores, que combater os efeitos de transcrição positivas de membros da família Trithorax durante o desenvolvimento, tais como o complexo SWI /SNF cromatina remodelação [5]. PRC2, que é frequentemente sobre-expressa em cancro, é pensado para promover a tumorigénese através da regulação do ciclo celular, replicação de ADN, a sobrevivência, a senescência e /ou stemness [5-7]. Se e em que medida PRC2 pode influenciar o sistema imunitário em tumores não é clara.

Anteriormente, e outros mostraram que BRG1, o motor que impulsiona ATPase de SWI /SNF, é necessário para a resposta de IFN-y estimulada genes (ISGs ) [8-11]. No

CIITA

lugar, descobrimos que coordena BRG1 a ação de muitos potenciadores distais. No entanto, apesar de ser essencial no locus endógeno e um grande repórter KB 190, BRG1 é dispensável para a indução de IFN-y de curto

CIITA

repórteres, levando à noção de que podem moderar os efeitos de um repressor remoto. Em trabalho recente, em paralelo com o presente estudo, mostramos que PRC2 e H3K27me3 decorar o

CIITA

lugar, tanto no promotor e entre potenciadores remotas [12]. Removendo PRC2 aliviou a exigência de BRG1, e equilibrado um intensificador remoto -50 kb, exatamente como visto com BRG1. Nós saber se este antagonismo entre BRG1 e PRC2 pode estender-se a outros alvos de IFN-y. IFNy desempenha um papel vital na vigilância imunológica [13-20]. 20% dos cancros humanos não possuem funcional SWI /SNF [21], e este defeito ou a regulação positiva de PRC2 poderia fornecer um mecanismo geral para a fuga imunitária no cancro. Além disso, a segmentação de PRC2 para loci distintos poderia ajudar a esculpir o programa imune específica exigida em diferentes tipos de câncer.

Aqui, mostramos que PRC2 tem um amplo papel na repressão ISGs, e inesperadamente que ele também tem uma dramática e câncer papel selectivo na regulação de outras vias de citocinas. Inibindo PRC2 com RNAi ou inibidores de pequenas moléculas EZH2 reativada resposta ISG, mesmo em células cancerosas SWI /SNF-deficientes. Além disso, extensa análise RNA-Seq revelou que interromper PRC2 ativa várias citocinas e receptores de citocina vias. Esta função foi consideravelmente ampliada no cancro

vs

. as células não cancerosas, e pode ser bloqueada através de meios farmacêuticos. PRC2 é, portanto, um regulador de ordem superior de vias imunes em câncer, citocinas segmentação, seus receptores e alvos a jusante, e adapta este programa de acordo com o tipo de câncer. Citocinas têm efeitos pleiotrópicos na tumorigênese [3,22], e pode ter uma grande influência sobre a eficácia dos inibidores EZH2 no câncer humano.

Material e Métodos

Cultura de Células e adenovírus

As células foram cultivadas tal como descrito [9] e tratados com IFN-y humano (Invitrogen) a uma concentração de 0,1 mg /ml. células SW-13 foram transduzidas com adenovírus expressando GFP (Ad-GFP) ou proteína de fusão GFP-BRG1 (Ad-BRG1) descrito [9]. vírus AdBRG1 foi titulada modo que a expressão BRG1 combinado que, em células HeLa [9].

pequeno RNA de interferência (siRNA)

siSUZ12, siEZH2 e siCtrl foram obtidos a partir Qiagen, e siBRM da Thermo Scientific . SW-13 células em 2×10

6 por 10 cm prato foram transfectadas com 50 nM siCtrl, siSUZ12 ou siEZH2 sozinho ou com 75 nM siBRM por 3-4 dias, utilizando DharmaFECT-1 (Thermo Scientific). As células foram sub-cultivadas a 2×10

6 por placa de 10 cm e submetida a um segundo ciclo de transfecção, garantindo uma melhor depleção H3K27me3. Subsequentemente, as células foram tratadas com 0,1 mg de IFN-y humano /ml durante 6 horas.

Westerns

Westerns foram realizadas como descrito [23]. Para anticorpos ver S4 Table.

RT-PCR e Arrays Expressão

RNA foi reverso transcrito e analisado por PCR quantitativa. Os valores foram normalizados para a p-actina [9]. Os iniciadores são mostrados na Tabela S4. Para matrizes de expressão, a qualidade do ARN foi verificada utilizando Bioanalyzer (Agilent Inc.), convertido em cDNA, seguido de 2

ND síntese da cadeia e utilizando o kit de preparação de ARNc Ambion (Applied Biosystems). cRNA foi a qualidade purificado em coluna verificada usando Agilent Bioanalyzer. 1,5 ug foi hibridado com Illumina todo o genoma matrizes de expressão. AdGFP /BRG1 e amostras siCtrl /siSUZ12 foram hibridadas com BeadChips Humano-WG6 expressão e Humano HT-12-BeadChips expressão, respectivamente (Illumina, Inc.). A análise da expressão diferencial foi realizada utilizando a normalização média pelo software BeadStudio (Illumina Inc). foram incluídos três repetições biológicas para cada grupo de tratamento.

ChIP qPCR, Chip on chip, e Chip-seq

DNA ChIP-qPCR foi realizada como descrito [10,24]. Os anticorpos e os iniciadores estão em S3 S4, respectivamente. Os anticorpos foram previamente validado [25] e nós verificado ainda anticorpos H3K27me3 e H3K79me3 usando manchas de pontos. Para Chip-chip, ADN imunoprecipitado foi amplificado, marcados, e hibridado com 1M Humano matrizes promotor da telha (Agilent). TileMap foi utilizada para definir regiões com significativamente enriquecida H3K27me3 [26], e intensidades foram normalizadas para os padrões internos. Os picos foram classificados de acordo com seu valor de estatísticas de teste (máxima estatística TileMap-MA: MAXM /P [26]). Métodos para definir um corte MAXM /P são descritos em S1 Texto (métodos complementares). Para mais detalhes sobre a análise dos dados Chip-seq, veja S1 Texto (métodos suplementares).

RNA-Sequencing

qualidade RNA foi testada usando Bioanalyzer (Agilent). grânulos de oligo-dT foram usadas para isolar ARN poli (A)

+ ARNm, e após a fragmentação aleatória ~ fragmentos de ARN de 300 pb foram usados ​​para preparar bibliotecas de ADNc utilizando multiplexados Ilumina TruSeq ARN kit de preparação de amostra. High-throughput seqüenciamento de bibliotecas foi realizada utilizando Illumina HiSeq 2000, LTRI. Sequenciamento lê de cada amostra em formato fastq foram avaliados com FASTQC e qualidade por base de sequência e por conteúdo GC sequência indicada dados de alta qualidade. Os dados foram mapeados no genoma humano (hg19) usando TopHat 1.4.1 que permite até dois desemparelhamentos [27]. Não-exclusivo lê foram filtrados. A lê count (ou montagem) para cada gene foi calculada usando um gasoduto com base em R personalizado ((https://www.r-project.org). Para mais detalhes sobre como a qualidade dos dados e genes diferencialmente expressos foram avaliadas ver texto S1 (Métodos e resultados complementares)

Gene Set Análise de Enriquecimento

Foram extraídos genes com log

2Fold mudança . 0 e probabilidades diferenciais 0,5 e classificou o SUZ12 genes suprimidos, diminuindo valores de probabilidade diferenciais. Nós usamos a função GSEA Preranked para analisar o enriquecimento dos genes classificados sobre os conjuntos de genes C2 exportados do KEGG via versão 3.1 com os genes nos conjuntos de genes identificados pelo símbolo gene HUGO. Foram selecionados vias enriquecido com alto Índice de enriquecimento (ES) por um corte de valor nominal P (NOM p-val) 0,01 e FDR q-val . 0,05 para a “interação receptor de citocina-citocina” (CCRI) via, que a análise de ponta ainda aplicada GSEA para extrair os membros da via que explicam o enriquecimento. Nós agrupados os genes com o seu dE probabilidade através das seis linhas celulares de cancro de genes comuns e diferente afetados em células cancerosas diferentes dentro da mesma via. Utilizou-se o mapa via KEGG da via CCRI (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html, mapa 04.060) para gerar esquemas. análise de agrupamento e visualização foram realizados com MeV (https://www.tm4.org/mev.html).

citocinas Detecção

Para Suz12 knockdown, células A549 foram tratadas por-dois ciclos conforme acima. Para a inibição de EZH2 droga, as células foram tratadas durante dois ciclos de quatro dias com 2 uM de GSK343 ​​ou UNC1999. No final de cada tratamento, as células foram semeadas @ 3×10

4 /poço em placas de 96 poços. As células foram deixadas a assentar durante 4 h e em seguida as concentrações indicadas dos vários estímulos (por LPS, IFNy, TNFa e IL1β) foram adicionados. Os sobrenadantes da cultura foram recolhidos após 24 h e congelado até à utilização. ELISA foi realizada em duplicado utilizando IL6-, IL8- e kits CXCL10-ELISA Max Deluxe A partir de BioLegend. análise multiplex de citocinas nos sobrenadantes da cultura foi realizada usando a matriz de citocinas humanas primárias /Quimiocina matriz ensaio de 41-Plex de Eva Technologies Corporation, Canadá. Três experimentos independentes foram realizados. análise de Western blot foi realizada para garantir Suz12 derrubar e regulação para baixo dos H3K27me3 após cada experimento.

Resultados

O antagonismo Genome-Wide entre BRG1 e PRC2 em alvos de IFN-y

SWI /SNF regula ISGs [8-11,28-30], mas a relação funcional com PRC2 é desconhecido. Para comparar as metas de todo o genoma, SW-13 células Brg1 deficiente foram transduzidas com vetores adenovirais expressando BRG1 (Ad-BRG1) ou GFP (Ad-GFP), ou transfectadas com siCtrl ou siSUZ12, não tratada ou IFN-estimulada durante 6 horas , e micromatrizes utilizadas para avaliar os níveis de mRNA. SUZ12 é uma sub-unidade do núcleo de PRC2 e os seus resultados de perda na degradação da subunidade enzimática, EZH2 [4]. Estamos focados em genes em que AdBRG1 ou siSUZ12 induzidas expressão ≥ 2 vezes (para um resumo do conjunto de dados, consulte os gráficos de pizza em Fig 1). Uma discussão detalhada sobre as classes de dados e de genes é fornecida em S1 Texto (ver a primeira seção de Resultados Complementares); o segundo prevê amplos detalhes sobre o grau em que BRG1 e PRC2 regular basal e IFN-y expressão genética induzida. Surpreendentemente, BRG1 reconstituição ou tratamento siSUZ12 indução de 87% (95/109) de ISGs melhorada, mas afectada expressão basal de apenas ~ 2% de todos os genes (Fig 1). Além disso, da 2% de todos os genes cuja expressão basal foi afectada, 14% (48/342) foram co-regulado por SWI /SNF e PRC2, ao passo que 34% (32/95) de ISGs foram co-regulados. O efeito de SWI /SNF e PRC2 em genes co-regulados era antagônica. tempo real, análise de PCR de 52 ISGs confirmou a BRG1-dependência predominante nesta classe de genes (Fig A em arquivo S1) e siSUZ12 resgatou a resposta em 5/7 ISGs-dependente Brg1, enquanto ISGs ou genes de controle BRG1-independente não foram afetados (Fig B, Painel B no Arquivo S1). Uma segunda SUZ12 siRNA ISGs-dependente Brg1 também resgatados (Fig C no ficheiro S1). depleção PRC2 marginalmente induzida BRM proteína relacionada com BRG1 (Figura B, Painel A no ficheiro S1). Para avaliar se esta ligeira indução poderia explicar a indução de alguns ISGs que derrubou BRM. Este passo adicional teve nenhum ou apenas um ligeiro efeito no resgate de ISGs-dependente Brg1 por siSUZ12 (Figuras B, D no arquivo S1). Resgate de ISG-responsividade, também não foi devido à indução de IFN endógenos, porque o tratamento de RNAi não teve efeito sobre os níveis de fosforilação de STAT1 ou proteína IRF1, quer em células SW13 [12], ou em várias outras linhas celulares (ver abaixo).

as micromatrizes foram realizadas com ARN a partir de células SW-13 para avaliar o efeito de BRG1-reconstituição ou SUZ12 knockdown na expressão basal de todos os genes (a, 465 genes afectados) ou IFNy responsividade (B, 109 ISGs). Os tratamentos são indicados em vermelho e azul por cima de cada heatmap, as classes de genes são indicados por barras coloridas à esquerda de cada heatmap, e os gráficos de pizza resumir a% de genes em cada classe (em (A) cinzento = genes não afetados). Uma carta adicional ao direito da heatmap em (A) classifica genes com base em: 1. a capacidade de resposta de IFN-y (ISGs = 12), ou ir termos: 2. Desenvolvimento (n = 118); 3. A sinalização celular (n = 64); 4. A migração celular (n = 24). Gene Classe Abreviaturas: EXPN: Expressão; Br: Brg1, Z: Suz12; S: Estimulados; R: reprimido; I: Interferão-γ; G:. Gene

Se PRC2 regula diretamente ISGs, estes objectivos devem exibir H3K27me3. Em primeiro lugar, abordou esta questão usando o chip-qPCR, estabelecendo pontos de corte para análise de todo o genoma subsequente. Foram estudados 30 promotores: 10 ISGs resgatados por siSUZ12 ou BRG1, 6 ISGs resgatados por siSUZ12 somente, 6 ISGs resgatados por BRG1 somente, 3 ISGs não afetadas pela siSUZ12 ou BRG1 e 5 controlos positivos para H3K27me3. IRF1, não afetado por qualquer PRC2 ou BRG1, faltava H3K27me3 e agiu como linha de base (Fig E no Arquivo S1). H3K27me3 foi detectada em 15/16 dos promotores ISG siSUZ12 regulamentados, mas apenas 4/9 dos ISGs afetado por siSUZ12 (Fig E, Painel A em arquivo S1) (p 0,05, teste exato de Fisher), e H3K27me3 foi significativamente maior no antigo (Fig E, Painel B no Arquivo S1).

Genome-wide chIP-chip revelou ~ 1/5

th de promotores tiveram algum H3K27me3 (pelo menos um de 100 pb bin 1,5x acima do controlo). A intensidade média H3K27me3 pico +/- 1 kb ao redor do TSS de todos os genes (Fig F Painéis A, B em Ficheiro S1), e os níveis de anti-H3K27me3 correlacionada com a expressão basal (Figura F, painéis C, D em Ficheiro S1), consistente com outros tipos de células (revisto em [6]). Concentrando-se em genes em que BRG1 e /ou siSUZ12 estimuladas expressão, aqueles com os níveis mais altos H3K27me3 foram reprimidos por PRC2 (BRS /ZRG ZRG; Fig G, Painéis A-E em arquivo S1). O nível médio de H3K27me3 em ISGs foi semelhante ao observado em todos os genes silenciosos (c.f. Fig 2A e 2F, painel A em Ficheiro S1). ~ 40% de ISGs teve algum H3K27me3 (Figura 2B), que é ~ 2x mais do que todos os genes (c.f. Fig F, painel B no ficheiro S1). Como em todos os genes, o nível ea frequência de H3K27me3 correlacionada com a expressão basal (Fig 2C e 2D). Além disso, pelo ISGs basally silenciosos, o nível ea frequência de H3K27me3 foi significativamente maior em loci onde siSUZ12 reforçada IFN-y capacidade de resposta (Fig 2E-2I, ZR-ISGs, BRS /ZR-ISGs).

Genome-wide ChIP -chip de dados foi utilizado para avaliar os níveis de H3K27me3 em promotores ISG. intensidade de sinal (A) ChIP-chip por 100 caixas pb dentro de +/- 5 kb da TSS de todos os 109 ISGs definidos na figura 1B. (B) Percentagem de H3K27me3 promotores ISG positivos e negativos. (C) intensidade do sinal ChIP-chip como em (A), mas agrupados de acordo com a expressão basal ISG. (D) Histograma da percentagem de H3K27me3 ISGs positivos e negativos em relação à sua expressão de genes basal. código (E) Cor da ISGs basalmente silenciosas analisadas em (F) – (H). (F) Heatmap mostra sinal H3K27me3 ChIP-chip basal dentro de +/- 1 kb do TSS das classes ISG basally silenciosos indicados. intensidade de sinal (G) ChIP-chip por 100 caixas pb dentro de +/- 1 kb da TSS de ISGs basally silenciosas. (H) violino gráfico mostra o nível do sinal de média ChIP-chip. Os asteriscos indicam diferenças significativas (P 0,05, teste de Mann Whitney) entre os grupos indicados. (I) histograma mostra a percentagem de promotores H3K27me3 positivos em cada classe ISG indicado. *: Significativamente mais elevada% de ISGs positivos H3K27me3 entre os grupos indicados (P 0,05, teste exato de Fisher). Gene Classe Abreviaturas: Br: Brg1, Z: Suz12; S: Estimulados; R: reprimido; I: Interferão-γ; G: Gene

Em conjunto, os dados de expressão e cromatina de ligação acima expor uma extensa papel, antagonista de SWI /SNF e PRC2 em IFN-y resposta

PRC2 reprime Múltiplas imunitário Pathways em.. as células cancerosas

Para avaliar a relevância geral de nossos resultados, foi realizada análise de RNA-Seq após a depleção PRC2 em 8 câncer e 3 linhas de células não cancerosas derivados (câncer: A549, adenocarcinoma de pulmão; Panc.04.03 AsPC1 , adenocarcinomas pancreáticos; PC3, o câncer de próstata; MCF-7 MDA-MB-231, cancros da mama, HeLa, câncer do colo do útero; e SW-13, de câncer adrenocortical; Non-câncer: 184-A1, mama; BPH-1 próstata , e Beas-2B pulmão). Westerns revelou que SUZ12, EZH2 e /ou níveis H3K27me3 eram normalmente elevadas em linhas de cancro em comparação com linhas não-cancerosas (Fig H no arquivo S1). níveis BRG1 /BRM variou entre linhas cancerosas e não-cancerosas com o mais baixo em A549, AsPC1, Panc.04.03 e 184A1 (Fig H no arquivo S1). níveis de EZH2 e SUZ12 correlacionados um com o outro, mas não com H3K27me3 grandes quantidades, e níveis PRC2 e Brg1 BRM ou foram não correlacionado (Fig H, Painel B no ficheiro S1). Estes achados variáveis ​​sublinham a importância de estudos funcionais para deduzir o efeito de PRC2 na expressão do gene, porque simplesmente avaliar os níveis do complexo ou a marca revela pouco sobre o seu papel em células cancerosas ou não-cancerosas.

As células foram tratadas com siCtrl ou siSUZ12 e não tratada ou expostos a concentrações fisiologicamente relevantes de IFNy (0,2 ng /ml), comparável ao que secretado por células NK expostas a células tumorais [31,32]. SUZ12-depleção H3K27me3 reduzida em todos os tipos de células, e um aumento em alguns H3K27ac (HeLa, MDA-MB-231, PC3), mas não afectou as subunidades de SWI /SNF (Figura I em Ficheiro S1). ensaios de RNA-Seq próximos foram executados para avaliar o efeito de SUZ12 knockdown no basal ou expressão gênica induzida por IFN-y (44 ensaios, 4 condições x 11 linhas), e os resultados foram validados usando análise de componentes principais e análise de correlação. O efeito do derrubar SUZ12 na expressão do gene também foi confirmada com um siRNA de cópia de segurança contra SUZ12. Para uma discussão completa, consulte a seção intitulada “Validação de dados de RNA-Seq” em S1 Texto (Resultados Suplementares), que remete para os dados de validação nas figuras J-M em arquivo S1, S2 e Tabela.

De acordo com um amplo papel para PRC2 em ISGs ISGs, SUZ12 reprimido (ZR-ISGs) foram observados em várias linhas de células (Fig 3, Fig N no arquivo S1, S2 Tabela). Entre as duas categorias mais abundantes ISG (ZR-ISGs ISGs e não foi afectada por SUZ12 (N-ISGs)), houve diferenças específicas de células em número absoluto das células ZR-ISGs (gama de 13-152, média 70, 43) mediano, mas siSUZ12 indução de entre 13% e 77% (média de 45%, mediana 43%) em 7/8 linhas celulares (Fig 3) reforçada. Estes valores são conservadores, como havia outras classes de genes menor abundância mais complexas onde SUZ12 afetadas expressão ISG (S1 Tabela). Mais N-ISGs (68%) e ZR-ISGs (72%) eram específicas para cada tipo de célula (Fig O em Ficheiro S1), o que indica que, para além de um conjunto de núcleo, cada linha induz um cocktail ISG distinta. Isto é consistente com a natureza específica do contexto da vigilância imune [3], e com a ligação da cromatina específico de células por PRC2 [33]; fato dos genes reprimidos pela SUZ12 sozinho (ZRG-N), 77% eram exclusivas de uma linha de células (Fig S no arquivo S1). Além disso, a fração de ZR-ISGs foi menor nos não-câncer contra linhas de câncer, com as três linhas não-cancerosas nº 7

th, 8

th e 11

th entre todas as 11 linhas avaliadas ( tabela S1).

mc_ui_heatmap mostram o efeito dos quatro tratamentos (colunas 1-4, chave na tabela para a direita) sobre a expressão ISG num painel de pulmão, pâncreas, mama, células de cancro da próstata e cervical adrenocortical linhas. As células foram transfectadas com siCtrl ou siSUZ12 e deixadas sem tratamento ou estimuladas com IFNy, durante 6 horas. ISGs são classificados em ISGs SUZ12-reprimidos (Zr-ISGs, amarelo) e ISGs que não são regulados pela PRC2 (N-ISGs, verde). A percentagem de Zr-ISGs e N-ISGs são mostrados em diagramas circulares acima de cada heatmap, eo número total de ISGs por linha é indicado abaixo de cada heatmap.

Em seguida, virou-se para o efeito de depleção PRC2 na expressão génica basal. Nossa análise microarray em células de carcinoma adrenal SW13 não revelou um efeito de destaque em genes do sistema imunológico até que nós tratados com IFN-y (Fig 1), mas nós quisemos saber se pode haver um efeito mais proeminente na expressão basal de vias imunes em outros tipos de câncer. Para decifrar as principais vias afetadas, usamos Gene Set Análise de Enriquecimento (GSEA) [34]. Surpreendentemente, siSUZ12 induzida a expressão basal dos vários componentes do sistema imunológico em 6/8 linhas de cancro, de que o “receptor de interacção citocina /citoquina” (CCRI) conjunto de genes foi feita em todas as linhas 6 (Figs 4 e 5), e em 4 linhas a classe CCRI foi o conjunto de genes superior ou segundo classificado (* na Fig P no arquivo S1). Estes resultados foram validados por vários genes com dois siRNAs contra SUZ12 (S2 tabela). Entre as seis linhas de cancro, onde foi induzida a conjunto de genes CCRI, 61% dos genes foram supra-regulados especificamente em uma ou duas das linhas de células (Fig Q no ficheiro S1). Assim, não só regula PRC2 ISGs, mas o seu efeito sobre o sistema imunitário em células cancerosas se estende para numerosas citoquinas e receptores de citoquina, e semelhante a ISGs, que afecta diferentes genes CCRI em contextos de cancro distintas.

Síntese da GSEA a análise de genes diferencialmente induzida por siSUZ12 relação ao siCtrl 6 em cancro e 4 linhas de células derivadas não-cancerosas. As linhas celulares incluídos no mapa de calor são indicadas para a direita; um sinal significativo é indicada em cinza. Similar caminhos biológicos são agrupados e destacados com uma cor distinta para a direita, e seu nome classe geral é indicado para a esquerda.

A. Heatmap de genes CCRI significativamente induzidos por siSUZ12 (Probabilidade Diferencial 0,9) em 11 linhas de células (verde não-câncer, câncer de azul). Para nomes de linhas celulares correspondentes a cada número de Ver (F). estrelas azuis neste e painéis posteriores indicam linhas de células em que a via CCRI foi significativamente enriquecidas de acordo com GSEA. BE Heatmaps de subconjuntos de dados em (A), separadas por tipo de tecido: B. mama (184 non-cancer

vs

MCF7 e MDA-MB-231 de cancro.), C. Lung (Beas-2B não -Câncer

vs

. câncer A549), D. próstata (BPH-1 não-câncer

vs

. PC-3 câncer), e E. Outro linhas celulares 4 de câncer de pâncreas (Panc .04.03 e AsPC1), cervical (HeLa) e adrenocortical (SW-13) de origem. F. Frequência de genes CCRI induzidas em todos os 271 genes CCRI em cada linha de células.

Em contraste com as linhas de câncer, siSUZ12 não enriquecer para conjuntos de genes do sistema imunológico em não-câncer de mama, próstata e pulmão linhas (Fig 4, Fig Q no arquivo S1). Para expandir esta análise, foram utilizados GSEA para analisar dados de RNA-Seq publicados a partir SUZ12-knockdown em células HEK-293T humanos [35]. Estas são células não derivadas-cancerosas de origem neural que expressam oncogenes virais, mas foram transformadas

In vitro

, independente do sistema imune [36]. GSEA revelou que a depleção PRC2 não afectou significativamente CCRI ou outras vias imunes (Fig 4). Assim, PRC2 alterado vias CCRI significativamente em 6/8 linhas celulares de cancro, mas 0/4 contextos não-cancerosas. esgotamento PRC2-regulada alguns genes CCRI em derivados não-cancerosas linhas celulares, mas menos do que em células cancerosas, insuficiente para alcançar significância no GSEA, e os genes afetados eram distintos no câncer vs linhas não-cancerosas de tecidos correspondentes (Fig 5) . Estes dados indicam um amplo papel para PRC2 na regulação do sistema imunológico, que é alterado e expandido de forma significativa no câncer.

SUZ12 Knockdown Induz Genes com bivalentes Promotores

Para definir se a repressão mediada por PRC2 de genes induzidos siSUZ12, especialmente da subclasse CCRI, é direto, nós extraído de dados H3K27me3 ChIP-seq disponíveis para as células cancerosas A549 pulmão, e comparou-o com os nossos dados RNA-Seq +/- siSUZ12 (Fig 6A). Em paralelo, comparou a distribuição H3K4me3, que marca promotores activos ou equilibrada. agrupamento não supervisionado identificou 10 diferentes padrões H3K27me3 /H3K4me3. genes siSUZ12 mais altamente induzidos, incluindo o subconjunto CCRI estavam em clusters 1-4, com extensa cobertura promotor H3K27me3 (Fig 6A-6D). No entanto, a maioria dos genes com alta promotor H3K27me3 não respondeu a siSUZ12 (Fig 6A), sublinhando a importância de medir o efeito sobre a expressão do gene. Notavelmente, o sinal médio H3K4me3 foi consideravelmente maior em toda genes siSUZ12-responsivos, incluindo o subconjunto CCRI, em comparação com genes que foram afetados por siSUZ12 ou 1000 conjuntos de genes aleatórios (Fig 6E). Assim, os genes que são induzidos a seguir a interrupção PRC2 tem uma assinatura H3K27me3 /H3K4me3 bivalente, e os genes induzidos CCRI-siSUZ12 são típicos deste grupo.

dados do chip-SEQ de células A549 foi utilizada para avaliar sinais de cromatina na siSUZ12 genes induzidos. A. Unsupervised K-means clustering foi realizada em sinais H3K27me3 e H3K4me3 e plotados como mapas de calor em todo o TSS (para mais detalhes ver “análise de dados ChIP-seq em S1 Texto, métodos suplementares). Os 10 aglomerados resultantes (ID do cluster (CID) 1-10) estão representados, a fim de variação média log2Fold na expressão de genes após tratamento siSUZ12 como mostrado nos gráficos de pontos para a direita. No gráfico de pontos, todos os genes (esquerda) ou genes CCRI (à direita) mostram mudança log2Fold para cada gene; pontos vermelhos indicam genes significativamente induzidos por siSUZ12 (probabilidade Diferencial 0,9). expressão basal é mostrado para a extrema direita (cinza claro: baixo; cinza: medium; cinza escuro: alta). B. Mostra agrupamentos de genes revelados no painel A. Proporção de todos os genes induzidos por siSUZ12 (vermelho) em CIDs 1-4 ou 5-10 (como mostrado nos gráficos de pontos no A). C. Proporção de genes da via CCRI induzidas por siSUZ12 (vermelho) em CIDs 1-4 (esboço vermelho) ou 5-10 (esboço azul). sinal de D. Média H3K27me3 ChIP em torno do TSS para os grupos indicados de genes (chave para a direita; ZR-Genes: todos os genes SUZ12 reprimido; N-Genes: não afetados pela siSUZ12; ZR-CCRI: genes CCRI que são SUZ12-reprimido ; N-CCRI: genes CCRI não afetadas pelo SUZ12; Rand: 1.000 conjuntos de genes aleatórios, n = média dos outros quatro conjuntos de genes). E. O mesmo que (D), exceto para os sinais H3K4me3 chip no CIDs 1-4 (ou seja, aqueles com alta H3K27me3).

pequena molécula EZH2 Inibidores Augment múltipla Immune Pathways

Nossos dados levantam a possibilidade de que as drogas que inibem PRC2 pode aumentar a activação da via imune em células de cancro. Quando quatro linhas celulares de cancro foram tratados com 2 M de GSK343 ​​[37] ou UNC1999 [38], ou outra droga reduziu marcadamente níveis H3K27me3 (Fig R no arquivo S1). análise de RT-PCR revelou que de 8 ISGs SUZ12-reprimidas (ZR-ISGs) em linhas de 4 células (32 casos) UNC1999 aumentada de IFN-y-responsividade em 30 casos (94%) e GSK343 ​​fê-lo em 15 (50%) (Fig S no Arquivo S1). O tratamento não teve efeito sobre os não-ISGs tais como

PITX2

ou

HPRT

ou no ARNm ou os níveis de proteína de IRF1, um ISG-PRC2 independente (Figs R, S no ficheiro S1). UNC1999 induzida mRNAs para um maior grau do que GSK343 ​​apesar dos efeitos aparentemente semelhantes sobre os níveis de H3K27me3 granel. Isso pode refletir diferenças sutis na cinética e /ou quantidade total de esgotamento H3K27me3 em potenciadores ou promotores específicos, o que não seria revelada pela análise ocidental do total H3K27me3. Independentemente, estes dados mostram que os inibidores EZH2, como siSUZ12, aumentar a indução de mRNA de ISGs reprimido-PRC2.

Finalmente, avaliou-se a inibição PRC2 aumenta a indução de citocinas em resposta a outros sinais do sistema imunológico e se estes efeitos sejam observados a ao nível da proteína. Para isso, trataram células de câncer de pulmão A549 com TNFa, IL1β,

E

.

coli

lipopolissacarídeo (LPS), bem como IFN-y, e secreção avaliado das citocinas CXCL10, IL6 e IL8 . Ao contrário de indução de ARNm, a inibição PRC2 sozinho não aumentou os níveis de proteína, mas quando as células foram expostas a um dos quatro sinais imunes, siSUZ12 ou UNC1999 aumentada a indução da proteína citocina (Figura 7A-7C, Fig T no ficheiro S1, S2 Tabela). Estes dados estão de acordo com a bem estabelecida regulação pós-transcricional da produção de citoquina para prevenir reacções imunológicas adversas, tais como inflamação crónica. Por exemplo, para além de transcrição do gene (sob o controlo directo de PRC2), citocinas estão também fortemente regulada ao nível de estabilidade e /ou tradução do mRNA através de motivos, tais como o elemento UA-Rich (ARE), constitutiva deterioração elemento (CDE ), Codificação Região Determinante de Instabilidade (CRD) e vários outros [39]. Os nossos resultados sugerem que PRC2 regula o componente da transcrição, mas não o controlo pós-transcricional, o que requer um sinal adicional a partir do sistema imunitário.