Sumário

ex vivo

-expanded, células alogénicas natural killer (NK) pode ser utilizado para o tratamento de vários tipos de cancro. Na terapia de célula alogénica NK, células NK provenientes de dadores saudáveis ​​deve ser expandido, a fim de se obter um número suficiente de células altamente purificadas, activados NK. No presente estudo, foi estabelecido um método simplificado e eficaz para a expansão em grande escala e a activação de células NK a partir de dadores saudáveis, sob boa prática de fabrico (BPF) condições. Após um único passo de depleção magnética de CD3

+ células T, as células mononucleares do sangue periférico empobrecido (PBMC) foram estimuladas e expandidas com PBMC autólogas irradiadas, na presença de OKT3 e IL-2 durante 14 dias, resultando em uma altamente população pura de CD3

-CD16

+ CD56

+ NK células que é desejada para fins alogénicos. Em comparação com células NK isoladas de fresco, estas células NK expandidos mostrou a produção de citoquinas e actividade citolítica robusta potente contra várias linhas de células de cancro. Digno de nota, as células NK expandidos mataram selectivamente as células cancerosas, sem demonstrar a citotoxicidade contra as células não tumorais alogeneicas em ensaios de co-cultura. A actividade anti-tumoral de células NK humanas expandidas foi examinada em ratinhos SCID injectados com células de linfoma humano. Neste modelo, as células NK expandidos controlada eficiente progressão do linfoma. Em conclusão, as células NK alogênicos foram eficientemente expandida em uma instalação de GMP-compliant e demonstrou actividade anti-tumoral potente ambos

in vitro

e

in vivo

Citation:. Lim O, Lee Y, Chung H, Sua JH, Kang SM, Jung meu, et al. (2013) GMP-Compliant, em larga escala expandidas células alogénicas Natural Killer Tenha Potent citolítica Atividade contra as células cancerosas

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 8 (1): e53611. doi: 10.1371 /journal.pone.0053611

editor: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Public de la Santé (CRP-Santé), Luxemburgo

Recebido: 03 de setembro de 2012; Aceito: 29 de novembro de 2012; Publicação: 11 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma bolsa da amp tecnologia Coréia Healthcare R D Project, Ministério da Saúde, Bem-estar Assuntos da Família, República da Coreia (A062260). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Eui-Cheol Shin é membro do Conselho Editorial PLOS ONE, e entende que este faz não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: MJ e HS são empregados em Cruz LabCell Corp. Mogam Instituto de Pesquisa de Biotecnologia Verde é uma fundação de pesquisa sem fins lucrativos. Número de patente: KR2008-74069. Patente Data de Emissão: 28 de março de 2012. Título de patente: método de crescimento para as células assassinas naturais. Cessionário: Green Cross LabCell Corp. e Hospital da Universidade Nacional de Seul. Inventor: Mi-young Jung, Dae Seog Heo, e Yu Kyeong Hwang. Número de patente: JP2011-521023. Patente Data Arquivado: 31 de janeiro de 2011. Título de patente: método de crescimento para as células assassinas naturais. Cessionário: Green Cross LabCell Corp. e Hospital da Universidade Nacional de Seul. Inventor: Mi-young Jung, Dae Seog Heo, e Yu Kyeong Hwang. Número de patente: CN200980130121.5. Patente Data do Registro: 30 de janeiro de 2011. Título de patente: método de crescimento para as células assassinas naturais. Cessionário: Green Cross LabCell Corp. e Hospital da Universidade Nacional de Seul. Inventor: Mi-young Jung, Dae Seog Heo, e Yu Kyeong Hwang. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Os outros autores declaram não haver conflito de interesses.

Introdução

natural killer (NK) células são linfócitos especializadas que fornecem uma primeira linha de defesa contra infecções virais e cancro [1]. a actividade de células NK é regulado por sinais de activação e receptores inibitórios [2]. O sinal de activação NK é mediada por vários receptores NK incluindo NKG2D e receptores de citotoxicidade naturais (NCRs) [2], [3]. Em contraste, a inibição NK é conferida por receptores semelhantes a imunoglobulina das células assassinas (KIR), que se ligam a moléculas MHC classe I em células alvo [2], [4]. De MHC de classe I expressão tende a ser perdido ou regulados negativamente em células cancerosas [5] e, como consequência, o sinal inibidor NK seja revogada, permitindo que as células NK a tornar-se activado e matar alvos malignas.

Recentemente, o actividade anti-tumoral das células NK foi demonstrada na definição de transplante de células-tronco hematopoiéticas alogénicos (HSCT) [6]. Em depletados de células T HSCT, doadores células NK são os principais responsáveis ​​células efectoras para controlar as células cancerosas residuais [7]. A actividade do enxerto contra o tumor (GVT) das células NK do doador é significativamente melhorada quando KIR e MHC de classe I são incompatíveis entre dador e receptor, como sinais inibidores estão ausentes [8], [9]. Portanto, o aumento da actividade GVT de células NK com KIR-MHC de incompatibilidade é a lógica subjacente para o desenvolvimento da terapia de célula NK alogénica.

Na terapia alogénico de células NK, células NK a partir de dadores saudáveis, são preparados por

ex vivo

expansão e de activação, e depois são administradas a pacientes com cancro [10]. células NK alogênico de doadores saudáveis ​​são superiores às células NK autólogas de pacientes com câncer, que ficam debilitadas funcionalmente durante a progressão tumoral [11], [12]. Além disso, a eficácia anti-tumor das células NK alogénicas é reforçada por meio de incompatibilidade entre doador-receptor KIR de classe I e MHC de ligandos [13].

A fim de permitir a utilização terapêutica das células NK alogénicas na prática clínica , deve ser obtido um número suficiente de células NK altamente enriquecidos. Vários métodos para

vivo

expansão celular ex NK com grau clínico foram relatados [14]. Embora as células NK diferenciados a partir de sangue do cordão umbilical [15] ou células NK-92 [16] foram utilizados para terapia, as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) provenientes de sangue total ou leucaferese são utilizados como fontes gerais de células NK [17], [18]. Devido à vantagem da recolha asséptica, num sistema fechado, as PBMC recolha por leucaferese tem sido comumente usado para uma boa prática de fabrico (BPF) de expansão das células NK-compatível [14]. O processo geral de expansão para aplicação alogénica começa com dois passos sequenciais de depleção magnética de CD3

+ células T e enriquecimento de CD56

+ NK células [19] – [21]. A fim de estimular a proliferação de células NK, células alimentadoras irradiadas, tais como PBMC [19], as linhas de células linfoblastóides transformadas com vírus Epstein-Barr (EBV-LCLS) [20] ou de linhas de células leucémicas modificadas [21] são utilizados muitas vezes. células alimentadoras irradiadas estimular as células NK através de ambos os fatores humorais e contato direto célula-célula [22].

No presente estudo, nós estabelecemos um método simplificado e eficiente para a expansão em grande escala e ativação de NK células de voluntários saudáveis ​​em condições GMP. Após um único passo de depleção magnética de CD3

+ células T, as PBMC esgotadas foram estimuladas e expandidas com PBMC autólogas irradiadas, na presença de OKT3 e IL-2 durante 14 dias, resultando numa população altamente pura de CD3

-CD16

+ CD56

+ NK células que é desejada para fins alogénicos. Estas células mostraram citotoxicidade potente contra células tumorais in

in vitro

, enquanto poupando células não tumorais alogeneicas. Eles eficientemente controlada progressão do tumor em um modelo de murganho SCID de linfoma humano. Tomados em conjunto, as células NK alogênicos foram eficientemente expandida em uma instalação de GMP-compliant e demonstrou actividade anti-tumoral potente ambos

in vitro Comprar e

In vivo

.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Todas as amostras de estudo foram obtidos após a aquisição de consentimento informado por escrito dos participantes do estudo, de acordo com a declaração de Helsinki. Este protocolo de pesquisa foi analisado e aprovado pelo conselho de revisão institucional do Hospital Universidade Nacional de Seul (Permit Number: H-1004-027-315).

preparação de células NK e expansão

PBMC foram isoladas a partir de dadores saudáveis ​​por leucaferese. CD3

+ células T foram esgotadas por VarioMACS (Miltenyi Biotec, Alemanha). PBMC esgotadas de células T foram expandidas a uma concentração sementeira de 2 x 10

5 células /mL em Cellgro SCGM meio isento de soro (CellGenix, Alemanha) com 1% de auto-plasma, 1 × 10

6 células /mL irradiadas (2.000 rad) PBMC autólogas, 10 ng /ml de anti-CD3 monoclonal anticorpo OKT3 (Orthoclon, Suíça) e 500 UI /ml de IL-2 (Proleukin, Suíça) em um saco de cultura a-350N (NIPRO, Japão). OKT3 foi suplementado apenas uma vez no início da expansão para estimular a população de células T nas células de alimentação irradiadas. células NK foram alimentadas com meio fresco com 500 UI /ml de IL-2 a cada dois dias, sem a remoção do meio de cultura pré-existente para manter a concentração celular no 1~2 × 10

6 células /ml durante 14 dias. A viabilidade das células NK expandidas foi avaliada por coloração de iodeto de propídio. A expansão das células NK foi realizada sob as condições de BPF no Green Cross LabCell Corp. (Coréia).

linhas de células humanas

K562, as células Jurkat, SW480, Ramos e Raji foram obtidos a partir americana Type Culture Collection (ATCC). SNU398 células foram obtidas de Korean Linha Celular Banco (KCLB). As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (GIBCO) suplementado com soro fetal bovino a 10% (GIBCO). Todas as linhas celulares foram mantidas em crescimento de fase logarítmica, a 37 ° C numa atmosfera humidificada suplementada com 5% de CO

2.

A imunocoloração e análise citométrica de fluxo

células

NK foram coradas com o Os anticorpos monoclonais adequados, tal como se segue: anti-CD56-PE-Cy5 (B159), anti-CD3-FITC (UCHT1), anti-NKp30-PE (P30-15), anti-NKp44-PE (P44-8.1), anti- NKp46-PE (9E2 /NKp46), anti-DNAM-1-PE (DX11), anti-CD25-PE (M-A251), anti-CD158b-FITC (CH-G) (todos da BD Biosciences), anti- NKG2A-PE (131411), anti-NKG2C-PE (134591), anti-NKG2D-PE (149810), anti-CD69-PE (298,614) (todos da R D systems), anti-CD158a-APC (EB6B) , anti-CD158e-PE (Z27.3.7) (todos da Beckman Coulter), anti-CD56-APC-eFluor®780 (CMSSB), e anti-CD62L-PE (DREG-56) (todos da eBioscience). Para linhas de células tumorais, anti-HLA de classe I-PE (G46-2.6) e anti-MIC-A /B-PE (6D4) foram adquiridos a BD Biosciences, anti-ULBP-1-PE (170818) e anti- ULBP-2-PE (165903) foram adquiridos de R D systems e anti-CD112-PE (TX31) e anti-CD155-PE (SKII.4) foram adquiridos a BioLegend. As amostras foram adquiridos num usando software FlowJo BD FACS foram analisados ​​Canto II ou LSR Fortessa e dados (TreeStar Inc., OR).

citoquina intracelular e CD107a coloração

células NK e as células K562 foram co-cultivadas em 1:01 proporção de 4 h na presença de anti-CD107a-APC (H4A3; BD Biosciences), BD GolgiStop ™ e BD GolgiPlug ™. As células foram coradas com anti-CD56-APC-eFluor®780, permeabilizadas por BD Cytofix /Cytoperm ™ e ainda coradas com anti-IFN-γ-PE (B27; BD Biosciences) ou anti-TNF-α-PE-Cy7 (Mab11 ; eBioscience). As amostras foram adquiridas em um BD FACS Canto II ou LSR Fortessa e os dados foram analisados ​​usando o software FlowJo (TreeStar Inc., OR).

ensaio de 51Cr-release citotoxicidade

Um padrão 4 h

foi realizado ensaio de citotoxicidade 51Cr-release. As células alvo foram marcadas com 100 uCi de

cromato de sódio 51Cr (BMS), e incubadas com as células NK em três proporções diferentes em E:T de fundo em U placas de 96 poços (Nunc, Dinamarca). A libertação espontânea e libertação máxima foi determinada por incubação de células alvo sem efectores em meio sozinho ou em 4% de Triton X-100, respectivamente. O ensaio foi realizado em triplicado. A radioactividade foi contada num contador gama, e foi determinada a percentagem de lise específica de acordo com a fórmula:% de lise específica = [(cpm médio experimental libertação-significativo libertação de cpm espontânea) /(cpm médio máximo de libertação de cpm espontânea libertação-média)] × 100. Para as experiências de bloqueio, as células NK foram pré-incubadas com 10 ug /ml de anti-rato IgG1K (MOPC-21; BD Biosciences), 10 ug /ml de anti-DNAM-1 (DX11; BD Biosciences), 2 ug /mL de anti- NKG2D (149810; R D systems), 2 ug /mL de anti-NKp30 (P30-15; BioLegend) ou 10 ug /ml de anti-NKp44 (P44-8; BioLegend) durante 30 min a 4 ° C, e

ensaio de libertação de 51Cr-SW480 foi realizada contra SNU398 e na proporção de 10:01 E:T. A inibição da morte foi calculada como uma percentagem da inibição pelo anticorpo de controlo do isotipo.

Fluxo de citotoxicidade de citometria de ensaio

A citotoxicidade das células NK expandidos contra PBMC alogénicas foi avaliada por ensaio de citotoxicidade de citometria de fluxo. células alvo de tumor K562 foram marcadas com 100 nM de calceina-AM (Molecular Probes, Eugene, OR), e células alogénicas ou autólogas PBMC alvo foram marcadas com anti-HLA de classe I. As células NK expandidos, células alvo K562 marcadas, e rotuladas PBMC as células alvo foram co-cultivadas na proporção de 03:01:01 durante 2 h. As células mortas foram coradas com 7-AAD (BD Biosciences). A percentagem de lise específica foi determinada de acordo com a fórmula:% de lise específica = (% média de 7-AAD

+ células em poços com NK co-cultura) – (% média de 7-AAD

+ células coradas em poços com alvo apenas)

In vivo

estudo em ratos SCID

CB-17-Prkdc

SCID (Recursos Animais Centre, Austrália) foram utilizados em 7 semanas de idade. ratinhos SCID foram alojados em gaiolas microisolator, e todos os alimentos, água e camas foram autoclavados antes de utilização. células NK expandidos foram marcadas com CFSE 5 uM (Sigma), e 2 × 10

7 das células CFSE-marcadas foram injectados intravenosamente em cada ratinho. Os ratos foram sacrificados às 2, 24, 48, 72 e 168 h, sob anestesia geral. As suspensões de células isoladas foram preparadas a partir de órgãos importantes, tais como os pulmões, baço, fígado, sangue periférico, nódulos linfáticos, medula óssea, rins, ovários, testículos e cérebro. A percentagem de CFSE

+ células foi analisada em lymphogating por análises de citometria de fluxo das suspensões de células isoladas a partir de amostras seriadas. Para avaliar a eficácia anti-tumor das células NK expandidos, CB-17-Prkdc

ratinhos SCID foram injectados por via intravenosa na veia da cauda com 1 × 10

5 células Raji e 1 × 10

7 expandidas células NK em 400 ul de PBS no dia 0. Três doses adicionais de células NK expandidos (1 × 10

7cells /rato) foram administrados dentro de nove dias. O anticorpo monoclonal anti-CD20, rituximab (0,01 ug /rato) foi injectado por via subcutânea no momento da primeira administração de células NK expandidos. ratinhos individuais foram monitorizados diariamente para a morbilidade e mortalidade associada ao tumor. Em particular, a postura anormal dos membros posteriores resultantes de uma incapacidade para estender os membros posteriores foi observada. Quando os ratos mostraram sinais de morbidade associada a tumor, tais como a perda excessiva de peso, letargia e /ou de emergência, que foram sacrificados de acordo com as orientações institucionais de cuidados de animais. A anestesia geral foi induzida através de uma injecção intramuscular de 100 mg /kg de cetamina (Yuhan, Coreia) e 12,5 mg /kg de xilazina (Rompun, Bayer). alojamento dos animais, a manipulação, e todos os procedimentos que envolvem ratos foram aprovados pelo comitê institucional do Instituto de Pesquisa de Biotecnologia Mogam (Permit Number: MG-10-111A) e todos os experimentos foram realizados em conformidade com a diretriz nacional que regula cuidados com os animais na Coreia

a análise estatística

O teste t de Student não pareado foi utilizado para comparar a toxicidade e citocina secreção de células NK antes e após a expansão. O teste t de Student foi utilizado para comparar a expressão do marcador de superfície de células NK antes e depois da expansão. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., CA).

Resultados

Características de larga escala, células NK expandiu-GMP

No presente estudo, nós eficientemente expandido células NK a partir de dadores saudáveis ​​por cultura de PBMC esgotadas de células T e PBMC autólogas irradiadas, na presença de IL-2 e OKT3 durante 14 dias numa instalação de GMP. No dia 14, os produtos, chamados MG4101, foram compostas de altamente enriquecido CD3

-CD56

+ (98,10 ± 0,88%) ou CD56

+ CD16

+ (97,43 ± 1,66%) células NK com contaminação mínima por CD3 +, células T

(0,06 ± 0,14%), CD14

+ monócitos (0,09 ± 0,14%) ou CD19

+ células B (0,04 ± 0,07%) (Fig. 1A-B ). Durante a cultura, as células NK foram expandidas 691,4 ± 170,2 dobragem (Fig. 1C) com 95,2 ± 1,9% de viabilidade (Fig. 1D). Em ensaios de citotoxicidade contra diversas células tumorais, células NK expandidos exercida aumento da actividade citolítica em comparação com as células NK isoladas de fresco (Fig. 1E). A actividade potente de células NK expandidos também foi demonstrada pela desgranulação marcador CD107a, e pela secreção de IFN-γ e TNF-α durante a co-cultura com células K562 (Fig. 1F).

(A-B) T- PBMC esgotadas de células foram expandidas sob as condições de BPF descritos nos Materiais e Métodos. A percentagem de CD3

-CD56

+, CD56

+ CD16

+, CD3

+, CD14

+ e CD19

+ células foram analisadas por citometria de fluxo analisa ( B, n = 8). Representativos gráficos de pontos FACS são apresentados (A). (C) A expansão dobra das células NK foi determinada antes (D0) e após a expansão de células (D14) NK (n = 8). (D) A viabilidade das células NK expandidas foi avaliada por coloração de iodeto de propídio. (E) A citotoxicidade das células NK contra diversas células tumorais foi comparada antes (D0) e após a expansão de células NK (D14) (n = 4). A proporção effector:target era 10:01. células (F) foram co-cultivadas com NK células K562 na proporção 01:01 durante 4 h, e a coloração de citocinas intracelulares (IFN-y e TNF-a) e CD107a foi realizado como descrito nos Materiais e Métodos. Os dados foram comparados antes (D0) e após expansão (D14). Média e DP são apresentados. *

p Art 0,05; **

p Art 0,01; ***

p

. 0,001

células NK Expressão dos receptores das células NK em grande escala, GMP-expandidas

A expressão de superfície de activar ou inibitória receptores NK foi analisada antes e após a expansão em grande escala. Entre os receptores de activação, NKG2C, NKp30 e NKp44 aumentou significativamente durante a expansão, enquanto NKG2D, NKp46 e DNAM-1 não (Fig. 2A). Expressão dos receptores inibitórios, NKG2A e KIR manteve praticamente inalterado sobre a cultura enquanto proporções de CD158a

+ b

+ e

+, CD158a

+ e

+ e CD158b

+ e

+ NK células foram diminuiu (Fig. 2B). estado de activação das células NK foi avaliada por coloração para CD25, CD62L e CD69, todos os quais foram encontrados para ser aumentado na superfície de células NK expandidos (fig. 2c). A expressão de receptores de quimioquinas tais como o CXCR3 e CXCR4 também foi avaliada. A frequência de CXCR4

+ NK células aumentou significativamente durante a expansão de células NK enquanto que a frequência de CXCR3

+ células NK não foi alterada (Fig. 2D).

A expressão de superfície de ativação de receptores (A ), os receptores inibitórios (B), marcadores de activação (C) e receptores de quimiocinas (D) foi analisada por citometria de fluxo antes (D0) e depois () D14 expansão de células NK (n = 10~12). Individual ou co-expressão de KIR (CD158a, CD158b ou CD158e) foi calculada pela portas booleanas usando software FlowJo (B). *

p Art 0,05; **

p Art 0,01; ***

p

. 0,001

A atividade citotóxica contra várias linhagens de células tumorais

Em seguida, a atividade citotóxica da população de células NK expandida foram avaliadas. Várias linhas celulares de tumor exibido diferentes níveis de susceptibilidade de células NK expandidos (Fig. 3a). Para compreender este susceptibilidade variada, a expressão de ligandos para receptores de NK foi analisada nas linhas de células de tumor. Destes ensaiadas para a expressão, os ligandos mais relevantes foram de HLA de classe I, os ligandos NKG2D; ULBP-1, 2-ULBP e MIC-A /B e DNAM-1 ligandos; CD112 (Nectin-2) e CD155 (Necl5). A linha celular mais susceptível, K562, expressa ligandos NKG2D mas não o ligando KIR, HLA de classe I (Fig. 3B). Jurkat, SW480 e SNU398 células expressa não apenas ligantes NKG2D, mas também de HLA de classe I, e foram moderadamente suscetível a células NK expandidos. células alvo NK-sensíveis (K562, Jurkat, SW480 e SNU398) tendem a sobre-expresso CD112 e CD155 em comparação com as células alvo resistentes a NK (Ramos, Raji e PBMCs). Digno de nota, as células NK não matou PBMC alogénicas, que expressa HLA de classe I sem NKG2D e DNAM-1 ligandos (Fig. 3A e B).

(A) Citotoxicidade de células NK expandidos contra várias linhas de células tumorais foi analisado por

ensaio de 51Cr-release com o effector:target indicada (E:T) rácio em triplicado. A citotoxicidade contra as CMSPs normais também foi analisada. O ensaio foi realizado duas vezes com células NK expandidos a partir de doadores diferentes, e dados representativos foi apresentada. Cada gráfico representa SD ± média. (B) Expressão de HLA-classe I, ULBP-1, 2-ULBP, CIV-A /B, CD112 e CD155 foi analisada por citometria de fluxo em várias linhas de células de tumor e as CMSPs normais (linhas sólidas). histogramas cinza representam os controles isotípicos. (C) As células NK expandidos foram pré-incubadas com anticorpos de bloqueio para DNAM-1, NKG2D, NKp30 e /ou NKp44, e a citotoxicidade foi analisado contra células SW480 ou SNU398 por

ensaio de libertação de 51Cr-em triplicado. rácio E:T foi 10:01. A percentagem de inibição de citotoxicidade foi calculada como uma percentagem da inibição pelo anticorpo de controlo do isotipo. O ensaio foi realizado duas vezes com células NK expandidos a partir de doadores diferentes, e dados representativos são apresentados. Cada gráfico de barras representa a média + SD.

Para avaliar o papel de activação dos receptores NK, um ensaio de citotoxicidade com células NK expandidos foi realizada na presença de anticorpos bloqueadores específicos para NKG2D, DNAM-1, NKp30 , e NKp44. Embora o bloqueio de um único receptor sozinho citotoxicidade ligeiramente afectada, bloqueando os receptores múltiplos conduziu a uma redução substancial na citotoxicidade. Em particular, bloqueando todas as quatro receptores citotoxicidade inibido por mais do que 85% (Fig. 3C). Deste modo, a citotoxicidade de células NK expandido é sinergicamente aumentada por activação simultânea através de múltiplos receptores de activação NK.

Ausência de actividade citotóxica contra células não tumorais alogeneicas

O uso clínico de células NK expandidos a partir de dadores saudáveis ​​não relacionados pode resultar em toxicidade devido à atividade citotóxica contra células receptoras não transformadas alogénicos. Para avaliar o potencial de citotoxicidade contra células receptoras normais, as células NK foram expandidas simultaneamente co-cultivadas com células tumorais K562 e PBMC alogeneicos normais, e a respectiva citotoxicidade contra cada alvo foi avaliada. A citotoxicidade contra as PBMC alogénicas verificou-se ser negligenciável (0,43 ± 0,27%) (Fig. 4A) e comparável à citotoxicidade contra as PBMC autólogas (0,40 ± 0,40%) (Fig. 4B). Esta citotoxicidade mínima não foi afectada pela presença ou ausência de células tumorais K562. Enquanto isso, as células NK expandidos mataram eficazmente células tumorais K562, independentemente da presença de células alogénicas ou autólogas PBMC (Fig. 4A-B). Portanto, as células NK expandidos eficazmente discriminados células tumorais a partir de PBMC alogénicas normais e selectivamente as células transformadas mortos. A citotoxicidade específica do tumor sem morte de células não tumorais alogeneicas-nos a possibilidade de aplicar as células NK expandidos a partir de dadores não aparentados, saudáveis ​​num cenário alogénico.

citotoxicidade selectiva das células NK expandidos contra alvos mistas de CMSPs normais e células K562 foi analisada por ensaio de citotoxicidade de citometria de fluxo, tal como descrito nos Materiais e Métodos. células alvo de tumor K562 foram marcados com calceina-AM, e ou alogénicos (A) ou células autólogas (B) As células-alvo de PBMC foram marcadas com anti-HLA de classe I. As células NK expandidos, as células alvo K562 marcadas, e as PBMC marcado as células alvo foram co-cultivadas na proporção de 03:01:01 durante 2 h. As células mortas foram coradas com 7-AAD, e a percentagem de lise específica foi calculada. Citotoxicidade contra PBMC (da esquerda de cada painel) e células K562 (direito de cada painel) é apresentada separadamente. O ensaio foi realizado em duplicado. Cada gráfico de barras representa a média + SD.

Em

actividade in vivo anti-tumoral de células NK expandidas em ratinhos SCID

Para

in vivo

estudo de células NK expandidas, administrou, células NK CFSE rotulados expandidas humanos para SCID e monitorados a cinética da sua distribuição. As células NK rotulados apareceu pela primeira vez nos pulmões, onde residiam por 48 horas, em seguida, desapareceu gradualmente (Fig. 5a). No baço, do sangue periférico e do fígado, a frequência das células NK administrados atingiu o seu pico em 48 horas e, em seguida, desceu gradualmente (Fig. 5A). Na medula óssea, linfonodos, cérebro, rins, ovários e testículos, o infundido CFSE

+ NK células foram minimamente detectado (≤1.1%) (Tabela S1). Todos os ratinhos de NK-administrado parecia saudável semelhante ao do grupo de controlo durante o curso do estudo.

células marcadas com CFSE (A) NK (2 × 10

7 células /rato) foram injectadas por via intravenosa em ratinhos SCID. Os ratos foram sacrificados às 2, 24, 48, 72 e 168 h, e a percentagem de CFSE

+ células nos pulmões, baço, do sangue periférico e no fígado foi analisada em lymphogating por citometria de fluxo (n = 4). Cada gráfico representa a média ± SEM. (B-C) ratos SCID foram injectados por via intravenosa na veia da cauda com 1 × 10

5 células Raji e 1 × 10

7 expandida células NK em 400 ul de PBS no dia 0 (n = 10 /grupo) . Três doses adicionais de células NK expandidas (1 × 10

7cells /mouse) foram administradas no prazo de nove dias. O anticorpo monoclonal anti-CD20, rituximab (0,01 ug /rato) foi injectado por via subcutânea no momento da primeira administração de células NK expandidos. paralisia associada ao tumor (B) e sobrevivência (C) foram monitorizados. O teste de eficácia foi confirmada por conjunto adicional de experiência utilizando 10 murganhos por cada grupo, e o conjunto representativo dos dados é apresentada.

Em seguida, a actividade anti-tumoral das células NK foi examinada em expandidas murganhos SCID injectados intravenosamente com células de linfoma de células B humanas Raji. A morbidade foi avaliada por paralisia de perna traseira-, como as células Raji têm tropismo medula espinhal, e a mortalidade foi avaliada. Administração de células NK humanas expandidas revogada significativamente a progressão do tumor, tal como evidenciado pela diminuição da morbidade (Fig. 5B) e de mortalidade (Fig. 5C). A eficácia de células NK humanas expandidas foi ainda melhorada pela co-administração de uma dose baixa de rituximab (0,01 ug /rato), enquanto que a mesma dose de rituximab sem células NK não melhorar o resultado da doença. Esta dose de rituximab é considerado extremamente baixo e é comparável a 1 /25.000 da dose regular em seres humanos [29]. Em resumo, as células NK expandidos demonstrado

In vivo

actividade anti-tumoral num modelo de tumor de murino, e a adição de anticorpo específico para o tumor aumentou significativamente a sua eficácia, presumivelmente pelo desencadeamento de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

Discussão

imunoterapias do cancro têm usado diversos tipos de células imunitárias, incluindo as células dendríticas (DC), os linfócitos T citotóxicos (CTLs), assassinas activadas por linfocina células (LAK), assassino induzida por citocina células (CIK) e células NK [23] – [26]. Embora tenha havido avanços recentes na terapia DC e terapia de CTL, a aplicação clínica é um pouco limitada desde antigénios de cancro deve primeiro ser caracterizado [23], [24]. Em contraste, células LAK, células NK e células CIK têm actividade citolítica independente de antigénio contra células tumorais. Frequentemente, as células LAK ou células CIK são preparados a partir de doentes com cancro e autologously administrado após

ex vivo

manipulação [25], [26]. No caso de células NK, células NK tanto autólogas alogénico e pode ser utilizado para terapia anti-cancro. Trabalhos anteriores mostraram que as células NK alogénicas pode ser administrada de forma segura a pacientes com cancro [10]. terapia alogénico de células NK é particularmente benéfica, uma vez que aumenta a eficácia anti-cancro das células NK através da indução de incompatibilidade entre doador-receptor KIR em células NK e dadores de MHC de classe I ligandos em tecidos receptor [13].

em estudos anteriores, vários métodos de

vivo a expansão de células NK ex têm sido desenvolvidos para uso clínico [14]. PBMCs por leucaferese recolhidos são muitas vezes utilizados como uma fonte geral de células NK, as quais têm uma vantagem da recolha asséptica, num sistema fechado [14]. O processo geral de expansão para aplicação alogénica começa com dois passos sequenciais de depleção magnética de CD3

+ células T e enriquecimento de CD56

+ NK células [19] – [21]. No presente estudo, apenas uma única etapa de esgotamento magnética de CD3

+ células T satisfez a qualidade do produto no respeito da pureza e viabilidade. No dia14, o produto final foi composta por CD3 altamente pura

-CD56

+ NK células (98,10 ± 0,88%) com contaminação mínima por CD3 + células T

(0,06 ± 0,14%), CD14

+ monócitos (0,09 ± 0,14%) ou CD19

+ células B (0,04 ± 0,07%). Entre as PBMC esgotadas de células T, células NK foram expandidos selectivamente, enquanto outras células tais como as células B e monócitos tornou-se minimamente detectável. Para a aplicação clínica alogénica, depleção de células T no produto final é desejada para evitar doença do enxerto contra hospedeiro [10].

Em estudos anteriores, várias tentativas foram julgados para estimular a proliferação de células NK com células alimentadoras irradiadas tal como PBMC, EBV-LCLS ou linhas de células leucémicas modificadas [19] – [21]. O presente processo inclui PBMC autólogas irradiadas com OKT3 fornecidos no início de expansão. células estimuladas com OKT3 T entre células alimentadoras irradiadas pode estimular células NK proliferação através de ambos os fatores humorais e contato direto célula-célula. Outros estudos estão em investigação para esclarecer o papel funcional das células alimentadoras.

No presente estudo, as células NK expandido mostrou a produção de citocinas robusto e actividade citolítica potente contra várias linhas de células de câncer em comparação com as células NK recentemente isolados. Estas células sobre-expressar a NKG2C, NKp30, NKp44, e marcadores de activação, incluindo CD25, CD69 e CD62L. Digno de nota, as células NK expandidos mataram selectivamente as células cancerosas, sem citotoxicidade contra células não tumorais alogeneicas em ensaios de co-cultura. Esta atividade citotóxica dirigida de células NK expandidas sugeriu que a aplicação alogênico de células NK expandidas em pacientes com câncer seria seguro. Na verdade, não há efeitos colaterais significativos foram observados em uma fase em curso Eu estudo utilizando células NK alogênico expandidas (www.clinicaltrial.gov; NCT 01212341).

A fim de acompanhar a cinética de

in vivo

distribuição, administrou-CFSE marcado, expandido células NK humanos para ratinhos SCID. As células NK rotulados apareceu pela primeira vez nos pulmões, onde residiam por 48 horas, em seguida, desapareceu gradualmente (Fig. 5a). No baço, do sangue periférico e do fígado, a frequência das células NK administrados atingiu o seu pico em 48 horas e, em seguida, desceu gradualmente (Fig. 5A). Entretanto, também estudada a expressão de receptores de quimioquinas tais como o CXCR3 e CXCR4 nas células NK expandidos.