Abstract

Fundo

A riqueza de evidências obtidas utilizando modelos de ratos indica que CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ células T reguladoras (Treg) manter periférica tolerância a auto-antigénios e também inibem as respostas imunes anti-tumor. Até o momento não há informações limitadas sobre CD4

+ respostas de células T em pacientes com câncer colorretal (CRC). Partimos para medir as respostas de células T a um antigénio associado a tumores e examinar se Treg colidir com essas respostas imunes anti-tumorais em pacientes com CCR.

Metodologia e principais conclusões

Treg foram identificados e caracterizada como CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ usando citometria de fluxo. Um aumento da frequência de Treg foi demonstrada em ambos os nós sanguíneos e linfáticos mesentérica periférico de pacientes com câncer colorretal (CRC) em comparação tanto com controles saudáveis ​​ou pacientes com doença inflamatória intestinal (DII). Depleção de Treg a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de pacientes de CRC desmascarado CD4

+ respostas de células T, como observado através da libertação de IFN-y, para o tumor antigénio associado 5T4, ao passo que não se observou qualquer efeito em um grupo de controlo com a mesma idade saudável .

Conclusões /Significado

Colectivamente, estes dados demonstram que Treg capaz de inibir as respostas imunes específicas de antigénio associados a tumores são enriquecidos em pacientes com CCR. Estes resultados suportam uma lógica para manipulação de Treg para melhorar a imunoterapia do cancro

Citation:. Clarke SL, Betts GJ, Planta A, Wright KL, El-Shanawany TM, Harrop R, et al. (2006) CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ células reguladoras T Suprimir Anti-Tumor respostas imunes em pacientes com câncer colorretal. PLoS ONE 1 (1): E129. doi: 10.1371 /journal.pone.0000129

Editor do Academic: Christopher Arendt, Sanofi-Aventis, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de setembro de 2006; Aceito: 14 de novembro de 2006; Publicação: 27 de dezembro de 2006

Direitos de autor: © 2006 Clarke et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Cancer Charity Tenovus, Cardiff, e uma concessão de uma subvenção pequena de Cardiff e Vale NHS Trust. KLW foi financiado por uma subvenção de projecto Wellcome Trust e da Associação de Cancer Research International. AMG é um pesquisador sênior MRC

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é o quarto mais comumente. diagnosticada doença maligna com uma estimativa de 1 milhão de novos casos e mais de 500 000 mortes por ano em todo o mundo [1]. A gestão actual de doentes com CCR gira em torno de excisão do tumor primário e os nódulos linfáticos locais e a utilização selectiva de 5-fluorouracilo (5-FU; iniba a timidilato-sintase) quimioterapia baseada em [2]. Os recentes avanços na imagem pré-operatória, técnica cirúrgica e uso de quimioterapia neo-adjuvante melhoraram os resultados, mas o câncer colorretal continua a ser a segunda principal causa de morte por câncer nos países ocidentais com 40-50% dos pacientes que se submetem a uma operação potencialmente curativa, passando por recaída ou morte por doença metastática.

estadiamento clínico-patológico da doença se correlaciona fortemente com o prognóstico. Curiosamente, melhoria do resultado clínico também está associada com a presença de linfócitos que se infiltram no tumor (TIL), particularmente se os linfócitos invadir os elementos glandulares do tumor [3], [4]. Isto sugere que o anti-tumorais respostas imunes pode colidir com o crescimento do tumor primário, e pode ter um papel importante no controlo da doença metastática. evidência indireta para a importância da resposta imune em pacientes com câncer é a associação epidemiológica em algumas populações entre um aumento da incidência de tumores e transplante de imunossupressão pós órgão [5].

Muito interesse tem surgido recentemente no papel de um que ocorre naturalmente população de células T CD4

+ CD25

+ células T reguladoras (Treg), caracterizados por a expressão da cabeça bifurcada fator de transcrição Foxp3, e o aumento dos níveis dos marcadores de superfície CD45RO, CTLA-4, e GITR [6 ], [7], [8]. Treg foram mostrados para controlar respostas específicas auto-antigénio na periferia, e, consequentemente, podem desempenhar um papel no controlo de respostas imunitárias anti-tumor. Vários grupos incluindo o nosso, têm demonstrado que a depleção de Treg promove a geração de respostas imunitárias anti-tumor e de rejeição de tumores em modelos de murino (revisto em [9]). Há evidências que sugerem que estas respostas protetoras alvo ambos os antígenos específicos do tumor, bem como antígenos tumorais partilhados [10], [11].

Mais recentemente, vários estudos têm observado um aumento da frequência de CD4

+

+ sup células CD25 no sangue periférico de pacientes com vários tipos de cancro, embora a maioria destes estudos não confirmaram que estas eram Treg por coloração para FOXP3 (revisto em [9]). A presença de FOXP3

+ Treg dentro do TIL de câncer de ovário tem, no entanto, foi identificado como um fator de risco independente para pior prognóstico. Além disso, depois da purificação a partir de ascites de tumor, estes Treg foram mostrados para suprimir respostas de células T específicas para o Her2

in vitro

[12].

O antigénio onco-fetais humanos, 5T4, é um 72kDa glicoproteína rica em leucina de membrana que é expressa em altos níveis na placenta e também sobre uma ampla variedade de carcinomas humanos, incluindo rectal, gástrico, renal e do ovário mas raramente em tecidos normais [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. Neste estudo foi testada a hipótese de que Treg se desenvolver em pacientes de CRC que suprimem respostas imunes 5T4 específicas do. As amostras de pacientes com CCR ou IBD, e controles saudáveis ​​foram examinados para resolver três questões: é a frequência de Treg (CD25

hiCD4

+ FOXP3

+ células T) aumentou nos gânglios sanguíneos ou linfáticos de pacientes com CRC; pode respostas de células T anti-tumorais para 5T4 ser identificadas em pacientes de CRC; e não Treg colidir com essas respostas imunes anti-tumorais?

Métodos

grupos

Amostra

pacientes

CRC foram identificados a partir de reuniões de equipe multi-disciplinar com a primeira apresentação de um adenocarcinoma e sem metástases à distância relatados no exame de imagem transversal (estágio TNM I-III; fase A-C de Duke). pacientes com DII (colite ulcerativa ou doença de Crohn) assistir clínica ou submetidos a ressecção cirúrgica eletiva foram recrutados para o estudo. aprovação do comitê de ética local foi concedida para o estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisa local do Bro Taf.

Antígenos

derivado de proteína purificada (PPD) (Statens Serum Institut, Dinamarca), hemaglutinina (HA) foi um presente amável do Dr. John Skehel (NIMR, Mill Hill), 5T4 foi produzido como descrito anteriormente [19] (Oxford Biomedica). Todos os antígenos foram utilizados a uma concentração final de 1 ug /ml.

Purificação de linfócitos

30-50 ml de sangue foi elaborada a partir de pacientes ou controlos e heparinizado (10 U /ml). PBMC foram extraídos por centrifugação em Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo, Noruega). As células foram lavadas duas vezes em RPMI antes de posterior utilização. linfonodos foram dissecados a partir de amostras frescas dentro de 30 minutos de cirurgia, lavadas em RPMI, puré através de um filtro de células estéril e colhido por centrifugação.

citometria de fluxo e linfócitos de nódulos sanguíneos e linfáticos

As amostras foram coradas com anticorpos marcados com fluorescência para CD4 (clone RPA-T4), CD25 (clone M-A251), CD45RO (clone UCHL1) e CTLA4 (clone BNI3) (BD Pharmingen), CD4 (clone S3.5) (Caltag ) e CD25 (clone 4E3) (Miltenyi Biotec). Todos coloração foi realizada em tampão fosfato salino (PBS), 2,5% de FCS, 5 mM de EDTA e coloração intracelular foi realizada utilizando o Cytofix, Cytoperm Kit (BD Pharmingen). FOXP3 coloração foi realizada utilizando o kit de FITC anti-humano coloração FOXP3 (clone PCH101) (71-5776 eBioscience). Os linfócitos foram fechado na frente e perfis de dispersão lateral. Todos citometria de fluxo foi realizada em um BD FACSCalibur e analisados ​​utilizando o programa de análise v3.1 Summit (build 839 DakoCytomation, Fort Collins, Colorado).

CD4

+ CD25

hi add-costas experimentos

purificada PBMC foram enriquecidos para CD4

+ células e, em seguida, separados em CD4

+ CD25

oi e CD4

+ CD25

– frações usando pérolas magnéticas (Miltenyi CD4

+ CD25

+ kit de isolamento de regulamentação). Citometria de fluxo de cada fracção mostrou que o rigor da CD25

+ seleção de célula pela Miltenyi CD4

+ CD25

+ kit de isolamento de regulamentar e esferas anti-CD25 Miltenyi era comparável. Um ensaio de proliferação foi criada usando 2×10

4 CD4

+ CD25

– células, ativado com 0,5 ug /ml ligado à placa anti-CD3 (clone OKT3) (eBioscience) e 1 mg /anti ml solúvel -CD28 (clone 28.2) (BD Pharmingen) anticorpos em RPMI 1640 suplementado com FCS tratado com calor a 10%, 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina e 1 mM de piruvato de sódio. CD4

+ CD25

– as células foram activadas sozinho ou na presença de CD4

+ CD25

oi em células diferentes proporções de 01:01, 1:0.1, 1:0.01 e 1:0.001 CD4

+ CD25

-:CD4

+ CD25

células hi. A proliferação foi medida no dia 3 por adição de 0,037 MBq /poço (1 uCi) de [

metil -3H] timidina (Amersham Biosciences) para as 18 horas finais de cultura. As células foram colhidas para filtros filtermat A Impresso (Wallac, Turku, Finlândia fornecedor Perkin Elmer) usando um colector de células TomTek. Uma vez que os filtros foram secos, Meltilex A folhas de cintilador melt-on (Wallac) foram adicionados e filtros foram lidas usando uma cintilação microbeta líquido e luminescência contador Trilux 1450 (Wallac).

ensaios ELISPOT de IFN-γ

os anticorpos foram obtidos a partir de Mabtech (Natka, Suécia) e o ELISPOT foi desenvolvida utilizando o kit de substrato de fosfatase alcalina da Bio-Rad (Hercules, Califórnia). O efeito da depleção de Treg sobre a produção de IFN-γ específica para o antigénio foi avaliada em ensaios paralelos. CD25

células hi foram esgotados utilizando separação magnética com microesferas de MACs CD25 (Miltenyi Biotec, Alemanha). Resumidamente, 1,5 × 10

7 PBMC foram incubados com 15 ul de pérolas anti-CD25 revestidos no volume total de reacção de 150 ul de tampão (1 × PBS, BSA a 0,5%, EDTA a 5 mM) a 4 ° C durante 15 min . grânulos em excesso foram lavados e PBMC foram partem de uma coluna de MS. A coluna foi lavada com 3 x 1 mL lavagens em tampão. A eficácia da depleção foi confirmada por citometria de fluxo. Os ensaios foram preparados utilizando um 3,5 × 10

5 não empobrecido ou CD25

células oi-empobrecido em RPMI 1640 suplementado com 5% FCS tratado termicamente, 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, mM L 2 piruvato de sódio e -glutamina 1 mM por poço de uma placa de filtração de 96 poços apoiados-polímero (MAIP-S-4510) (Millipore, Moslheim, França) num volume de reacção total de 100 uL /​​poço. As concentrações de anticorpos utilizados e os passos de lavagem foram de acordo com as instruções do fabricante, todas as incubações foram anticorpo com 50 ul /poço. O método foi anteriormente descrito [20]. PPD, HA e 5T4 foram testados em poços em duplicado, tendo sido adicionados a uma concentração final de 1 ug /ml, e em comparação com poços de controlo sem proteína. A placa foi incubada a 37 ° C, 5% de CO

2 durante 18 h. As células T activadas foram enumeradas ao nível de uma única célula pela contagem do número de manchas por poço utilizando um leitor ELISPOT automatizado (Cadama). Respondedores foram identificados como tendo pelo menos 5 células formadoras de manchas (SFC) por 10

6 PBMC, após a subtração do fundo, e um aumento de pelo menos 50% acima do fundo.

A análise estatística

Fluxo de dados de citometria foram analisados ​​utilizando o aluno não pareado

t

-test (GraphPad Prism versão 2.0 (software GraphPad). a proporção de pacientes com câncer e controles saudáveis ​​de montagem uma resposta ao 5T4 foi comparada usando uma fechada método de formulário para comparar diferenças e calculando os intervalos de confiança [21].

Resultados

Definir a população Treg humana

Usando os parâmetros de propagação rigorosos relatados recentemente [8], Treg foram identificadas como células CD4 positivas, com coloração de CD25 mais brilhante do que a da população de células CD4-negativas (Figura 1a). a frequência de Treg foi calculada como a percentagem de células CD4

+ CD25

células de hi no CD4

+ população, e foi na faixa de 0,09-1,44% de CD4

+ células em PBMC de controles saudáveis ​​pareados por idade. de acordo com relatórios anteriores, a grande maioria dos CD4

+ CD25

células hi foram de CTLA4-positivas e expressa CD45RO ( 97%) [6], [7], [8]. O CD25

oi população foi ainda analisada pela expressão de FOXP3. Tal como mostrado na Figura 1b, mais de 95% das células T CD4

+ CD25

FOXP3 células de hi expressa, em comparação com aproximadamente 30% das células T CD4

+ CD25

int células. Este padrão de coloração foi o mesmo para ambos os controlos saudáveis ​​e pacientes de CRC. expressão FOXP3 foi insignificante em CD4

+ CD25

– células (Figura 1b)

(A) CD4

+ CD25

-., CD4

+ CD25

foram identificados

+ CD25

células hi int e CD4 como mostrado. CD4

+ CD25

células hi são aqueles em que a expressão de CD25 foi maior do que no CD4

– população. (B) a expressão FOXP3 dentro de cada população foi avaliada por coloração intracelular. (C) recentemente isolado CD4

+ CD25

– células T (2 × 10

4 células /poço) foram cultivadas isoladamente (CD25 /baixo) ou com CD4

+ CD25

oi As células T em diferentes proporções, e estimuladas com ligado a placa de anti-CD3 e anti-CD28 solúvel. A proliferação foi avaliada por (

3H) -timidina. Os resultados representam a média de poços em triplicado, com desvio-padrão, a partir de um ensaio representativo.

Para confirmar o fenótipo regulatório desta população de células CD4

+ CD25

células hi, a sua capacidade de suprimir a ativação de CD4

+ CD25

– células foi avaliada através de uma co-cultura de

in vitro

ensaio de proliferação. CD4

+ CD25

– e CD4

+ CD25

células hi foram separados do PBMC, como descrito nos métodos. A adição de CD4

+ CD25

células HI para policlonalmente estimulado CD4

+ células T suprimida claramente a proliferação de CD4

+ CD25

– células T e, como relatado por outros, esta supressão foi dependente da dose [8], [22], [23] (Figura 1c).

pacientes com CCR têm aumentado o número de Treg em

sangue periférico

O Treg foram fenotipicamente definido como descrito acima . A Figura 2a mostra as frequências de Treg nas PBMC de pacientes com CCR (n = 12, a faixa etária 58-80 anos) em comparação com controles saudáveis ​​pareados por idade (n = 11, a faixa etária 48-93 anos) e pacientes com doença inflamatória intestinal (n = 22, idades compreendidas entre os 19-80 anos). Em todos os grupos, a frequência de Treg era menos do que 2% de CD4

+ células T. No entanto, a frequência média em pacientes com CCR (1,13%) foi significativamente maior em comparação com os grupos de controle (pacientes com DII 0,56%, controles saudáveis ​​0,46%). Não houve diferença significativa na freqüência de Treg em controles saudáveis ​​e pacientes com DII.

(A) recentemente isolado PBMC de 12 pacientes de CRC, 11 controles pareados por idade saudáveis ​​e 22 pacientes com DII foram coradas com anticorpos para CD4 e CD25. Usando a estratégia de gating delineado na Figura 1, Treg foram enumeradas. (B) amostras de nódulos linfáticos mesentéricos (LN) foram coletadas de espécimes cirúrgicos de 8 CRC e 7 pacientes com DII e corados e fechado como acima. Os dados mostram a percentagem de células CD4 +>

oi, em cada amostra. Cada símbolo representa um paciente. Os valores de p foram calculados utilizando de um estudante não pareado

t

-teste.

pacientes com CCR têm aumentado o número de Treg nos linfonodos mesentéricos

Obtenção de nós controle linfáticos de indivíduos sem a doença abdominal não foi possível. pacientes com DII oferecer um grupo de controle de doenças do cólon para os pacientes com CCR, as últimas áreas também muitas vezes demonstrando de inflamação ao redor do tumor. Além disso, os resultados de PBMC não demonstrou uma alteração significativa nas frequências de Treg em pacientes com DII em comparação com controles saudáveis. Assim, considerou-se razoável utilizar linfonodos mesentéricos obtidas a partir de pacientes com DII submetidos a cirurgia como um grupo de controle para examinar Treg no tecido linfóide secundário.

linfonodos frescas foram obtidos a partir das amostras cirurgicamente ressecados e preparados como descrito nos métodos. As frequências de Treg em gânglios linfáticos mesentéricos obtidos a partir de pacientes com CCR (n = 8), e pacientes com DII (n = 7) foram comparadas (Figura 2b). pacientes de CRC novamente mostrou um aumento significativo na frequência de Treg, reflectindo o aumento já descrito no sangue periférico. O nó de linfa derivado CD25

oi Treg tinha o mesmo fenótipo aos encontrados no sangue (dados não mostrados). Não foi observada diferença na proporção global de CD4

+ ou CD8

células + T (dados não mostrados).

Os pacientes com não-metastático CRC demonstrar

+ respostas de células T CD4 vigorosos recordar antigénios

PBMC foram purificadas a partir de pacientes com CCR (n = 14) antes da cirurgia e a CD4 específica

+ resposta de células T a antigénios recall controlo PPD e HA medido pela libertação de IFN-γ. Estes resultados foram comparados com controles pareados por idade saudáveis ​​(n = 11) (Figura 3). CD4 e CD8 experiências de depleção confirmou que estes eram CD4 + T respostas de células

(dados não mostrados). Não houve evidência de que os pacientes foram imunossuprimidos; todos os sujeitos responderam a pelo menos um antigénio. A proliferação celular foi também avaliada em experiências paralelas como uma medida da activação das células T, e, novamente, nenhuma evidência foi encontrada de imunossupressão pré-operatório (dados não mostrados).

de PBMC inteiro de 11 controles pareados por idade e 14 CRC os pacientes foram avaliados para respostas aos antígenos PPD e HA, medida pelo IFN-γ ELISPOT. As PBMC purificadas foram adicionadas a 3,5 × 10

5 células /poço, e incubou-se durante 18 horas na presença de qualquer um de 1 ug /mL de PPD, 1 ug /mL de HA com ou sem antigénio. Wells foram criados em duplicado. Menos de 5 células formadoras local /10

6 PBMC foi considerado negativo.

Treg tem um efeito significativo sobre as respostas imunes anti-tumorais no sangue de pacientes com CRC

Uma série de ensaios foram realizados em pacientes com CCR (n = 14) e controlos da mesma idade (N = 11) para determinar se a remoção de CD25

células de hi alterou a resposta imunitária para chamar antigénios e o antigénio associado ao tumor 5T4. Nós optimizado um sistema de isolamento concebido especificamente para esgotar somente os CD25

células de hi dos seus amostras conforme descrito nos métodos (Figura 4a). PBMC recém-isoladas foram utilizadas em

ex vivo

ensaios ELISPOT de IFN-y tal como descrito acima, para determinar as respostas aos antigénios de memória e o antigénio tumoral 5T4, antes e após a depleção de Treg. No seu conjunto, o esgotamento dos Treg descoberto algumas respostas para recordar antigénios em pacientes e controles (Figura 4B) CRC. No entanto, no caso de o antigénio associado ao tumor 5T4, houve uma diferença notável entre os controlos e os pacientes de CRC. Um específico do 5T4

ex vivo

resposta foi encontrada em 1/11 dos controles saudáveis ​​e esgotamento de Treg reforçada esta resposta. Enquanto que a depleção de Treg aumentada a resposta específica de 5T4 em 14/01 dos pacientes de CRC, a depleção desta população levou à

desmascaramento de uma resposta 5T4 em 14/05 dos pacientes testados (95% de intervalo de confiança as diferenças emparelhadas é -0,83 para -0,22 revelando uma diferença significativa no 5T4 respostas entre pacientes com CCR e controles saudáveis). Estes dados sugerem que são de Treg supressão de respostas imunitárias anti-5T4 especificamente em pacientes com cancro colo-rectal. Estes seis pacientes que demonstraram respostas 5T4 melhoradas teve frequências Treg semelhantes em sangue periférico (faixa de 0,82-2,35% média de 1,14%) para as freqüências medidos em toda a população CRC (média de 1,13%). Enquanto IFN-γ-release, medida diretamente

ex vivo

, respostas-5T4 anti habilitados a ser detectada, não encontramos respostas proliferativas vigorosas para 5T4 em pacientes ou controles CRC. No entanto, com várias rondas de re-estimulação e a adição de IL-2, que tenham crescido HLA-DR-restrita linhas 5T4-específicas (dados não mostrados).

(A) PBMC foram purificadas e dois amostras preparado: todo PBMC e PBMC esgotadas de CD25

células hi. (B) PBMC inteiro e CD25

oi-empobrecido PBMC de 11 controles pareados por idade (barras abertas) e 14 pacientes de CRC (barras sólidas) foram criados em paralelo em um ensaio ELISPOT-y IFN (3,5 × 10

5 células /poço) com PPD (gráfico de cima), HA (gráfico do meio) ou 5T4 (gráfico inferior). O número de respostas é mostrado para cada antigénio. Em cada caso, a percentagem da esquerda é a frequência de respondedores que aumentaram após a depleção Treg (Aumento), o percentual no meio é a frequência de não-respondedores que tiveram uma resposta após a depleção (New Response) e à direita o frequência de respondedores que mostraram uma diminuição ou nenhuma alteração em resposta após a depleção Treg (redução /NC). A confiança de 95% Intervalo de diferenças pareadas de proporções entre pacientes e controles é -0,83 para -0,22 revelando uma diferença significativa para 5T4 respostas. (C) Os 6 pacientes com respostas de CRC para 5T4 são mostrados em mais detalhe. As barras representam as células formadoras de manchas /10

6 PBMC após a subtração de pontos fundo, PBMC todo (cinza claro) e CD25

oi-empobrecido PBMC (cinza escuro). As respostas foram observadas apenas em CD25

oi-empobrecido PBMC de pacientes 1-5, ao passo que uma resposta foi observada em ambas as populações PBMC de paciente 6. Em todos os ensaios, os poços foram criados em duplicado.

Discussão

Nós comparamos a frequência de cuidadosamente definidos CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ células T reguladoras (Treg) em pacientes com CCR com controles pareados por idade saudáveis ​​e pacientes com DII. pacientes com CCR têm uma frequência aumentada de Treg e não há evidência de que essas respostas imunes anti-tumorais alvo Treg.

Foi avaliado se aprimorados número de Treg em pacientes com CCR correlacionadas com imunossupressão geral. Uma combinação de análises ELISPOT e ensaios de proliferação IFN-γ para monitorar respostas ao recall antígenos PPD e HA, demonstraram respostas igualmente robusta em pacientes com CCR e controles saudáveis, indicando que as respostas imunes a antígenos não-tumorais não sejam prejudicadas em pacientes com CCR.

o padrão de reactividade imunológica era notavelmente diferente entre pacientes de CRC e controlos saudáveis ​​quando as respostas imunitárias para o antigénio onco-fetais associado a um tumor, 5T4, foram comparados. respostas específicas-5T4 foram observadas numa proporção de controlos saudáveis, mas estas respostas eram em grande parte inalterada pela depleção Treg. Em contraste, uma resposta específica de 5T4 foi detectado em mais de um terço dos pacientes com CCR apenas após a remoção de Treg, o que sugere que os pacientes em CRC Treg suprimem a resposta imunitária especifica para o tumor. Este grupo de pacientes com CCR que demonstraram respostas anti-5T4 após a depleção Treg parecia ter frequências Treg semelhantes em comparação com o grupo global CRC, embora estudos mais amplos serão necessários para confirmar isso. Desde 5T4-respostas não foram desmascarada por depleção Treg em controlos saudáveis, estes dados indicam também que as células Treg capazes de suprimir as respostas específicas 5T4-se desenvolvem em resposta ao tumor. O mecanismo preciso através do qual isto ocorre não está claro neste momento, mas é possível que o meio de citoquina dentro do tumor promove a geração de Treg reconhecer antigénios associados a tumores. Relatórios recentes indicam um papel para o TGF-p na expansão de Treg [24], [25]. Num modelo de tumor de roedores tem sido mostrado que apenas as células dendríticas (DC) a partir de portador de tumor mas não em animais livres de tumor promover a proliferação de Treg. Curiosamente DCs de animais livres de tumor poderia expandir Treg, mas apenas se pré-incubadas com os sobrenadantes das células de tumor.

in vitro

utilizando anticorpos anti-TGF-p Estes efeitos podem ser inibidos [26]. Colectivamente, estes dados sugerem que Treg requerem tanto uma estimulação e citocinas específicas de antigénio de tumor, tais como TGF-p, de modo a proliferar e a suprimir as respostas imunitárias anti-tumor.

5T4 é um candidato atraente para vacinas contra tumores, uma vez que é expressos em muitos tumores epiteliais. No entanto, este estudo sugere que Treg reconhecer o antigénio e possivelmente desempenham um papel na supressão de respostas anti-tumorais, presumivelmente em detrimento do indivíduo. Dois outros estudos demonstraram que Treg reconhecer antigénios tumorais (LAGE-1 e ARTC-1) em indivíduos com melanoma [27], [28]. É importante assegurar que as estratégias de vacina utilizando antigénios associados a tumores não aumentar o braço de regulação do sistema imunológico inibindo assim a potencial imunidade anti-tumoral. Uma abordagem pode ser Treg para esgotar antes da vacinação, como foi recentemente demonstrado para o carcinoma de células renais [29]. Será de grande interesse, pois, determinar em estudos futuros se tal estratégia irá resultar em respostas clínicas mensuráveis ​​em pacientes com CCR.

Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao Prof. Robert Newcombe, Departamento de Epidemiologia, estatística e Saúde Pública da Universidade de Cardiff para o conselho estatística.