Abstract

As atividades anti-proliferação de todas as vinte e cinco fármacos inibidores da quinase alvo que estão em uso clínico foram medidos em dois painéis de ensaio grandes: (1) um painel de ensaios de proliferação de quarenta e quatro linhas de células de cancro humano de origem diversa de tecidos de tumor; e (2) um painel de ensaios de actividade de enzima mais de 300 quinase. Este estudo fornece uma cabeça-on comparação de todos os medicamentos inibidores da quinase em uso (status novembro 2013), e para seis destas drogas, a primeira kinome profiling dados no domínio público. Correlação de atividades de drogas com mutações do gene do cancro revelou marcadores sensibilidade a drogas novas, sugerindo que os cancros dependentes mutante

CTNNB1

irá responder a trametinib e outros inibidores de MEK, e cancros dependentes de

SMAD4

a pequena molécula drogas inibidoras de EGFR. Comparação das eficácias segmentação celulares revela os inibidores mais orientadas para EGFR, ABL1 e BRAF (V600E) crescimento celular -driven, e demonstra que os agentes mais bem direcionados combinam alta potência bioquímico com boa seletividade. Para os inibidores ABL1, nós computacionalmente deduzir optimizado perfis quinase para utilização numa nova geração de fármacos. Nosso estudo mostra o poder da combinação de dados de perfis bioquímicos e celulares na avaliação da acção do fármaco inibidor da quinase

Citation:. Uitdehaag JCM, de Roos JADM, van Doornmalen AM, Prinsen MBW, de Man J, Tanizawa Y, et ai. (2014) Comparação do Targeting Gene Câncer e bioquímicos seletividade de todas orientadas Kinase Inibidores aprovado para uso clínico. PLoS ONE 9 (3): e92146. doi: 10.1371 /journal.pone.0092146

editor: Yiqun G. Shellman, University of Colorado, School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 19 de dezembro de 2013; Aceito: 17 de fevereiro de 2014; Publicação: 20 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Uitdehaag et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do escritório Inovação (Agentschap NL) do Ministério dos Assuntos Económicos dos Países Baixos (INT 111039). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. RB e GZ são fundadores e acionistas da Holanda Translational Research Center B.V. (NTRC). KY é um dos fundadores do Carna Biosciences, Inc. (Carna). KY e YK são acionistas de Carna. A linha de células de perfil do câncer descrito é oferecido como um serviço comercial por NTRC sob as Oncolines marca. O perfil bioquímico quinase descrito é oferecido como um serviço comercial por Carna sob a marca QuickScout. Isto não altera a adesão dos autores para as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

terapias direcionadas aumentar significativamente a eficiência da terapia do cancro. Eles trazer grande benefício para os pacientes porque melhoram as taxas de sobrevivência com muito menos efeitos colaterais do que terapias citotóxicas tradicionais. inibidores de pequenas moléculas de proteínas cinases são um excelente exemplo do sucesso da terapia-alvo. Atualmente (Nov. 2013) vinte e cinco fármacos inibidores da quinase aprovados para utilização clínica, todos excepto dois para o cancro (Tabela 1 e Figura 1). Em 2012 proteínas quinases eram a única classe alvo de maior sucesso com base no número de novos medicamentos aprovados por os EUA Food and Drug Administration (FDA) e esta tendência continuou em 2013 [1]. No entanto, dado o atrito elevado de candidatos a fármacos, os benefícios de sobrevivência limitado de terapias de primeira geração, o problema da resistência ao fármaco e o facto de que a terapia dirigida só é benéfico para uma pequena fracção dos doentes com cancro, existe uma necessidade de novos e melhorados inibidores da quinase alvo.

Todos são inibidores da quinase que foram aprovados para uso clínico em novembro de 2013.

Crucial para o desenvolvimento de terapias-alvo é a capacidade de algumas drogas resposta a um marcador genético, tais como mutação, translocação ou sobre-expressão de um gene de cancro [2]. Apesar de que existem mais de 500 cinases codificadas pelo genoma humano, fármacos inibidores da quinase correntes aprovadas actuam principalmente através de apenas cerca de dez diferentes alvos (Tabela 1 e Tabela S1). A maioria dos inibidores de cinase de oncologia ato inibindo a proliferação de células de tumor, angiogénese, ou ambos [3]. biomarcadores de sensibilidade aos fármacos são, portanto, necessários para apoiar o desenvolvimento de novas terapias direcionadas e ampliar a utilidade de terapias anti-câncer comercializados.

Para prever melhor as populações de resposta do paciente em um estágio inicial no desenvolvimento de medicamentos, e para melhor compreender acção do fármaco quinase, nós estabelecemos um painel de linha celular de cancro de quarenta e quatro linhas de células que foram derivados a partir de uma grande diversidade de tumores humanos (Figura 2A). As mutações genéticas que conduzem a cancro fenótipo canceroso da maior parte das linhas celulares foram caracterizadas no projecto Linhas Celulares cósmica (CCL) [4]. O nosso painel contém representantes de todos os oncogenes bem conhecidos e supressores tumorais, que, em um painel de célula grande soma até mais do que 90% de todas as alterações genéticas documentados (Tabela S2) [4]. Vinte e três destas alterações genéticas frequentes ocorrem em pelo menos duas linhas de células (Figura 2B e na Tabela S3)

A:. Tecido de origem de linhas celulares no painel de Oncolines. B:. Frequência de alterações do gene do cancro no painel da célula,

i

, mutações, translocações e copiar mudanças de números na COSMIC celular Linha projeto [4]. C: agrupamento hierárquico de perfis de dados de medicamentos inibidores da quinase comercializados no painel linha de 44 células. Sem escala

10logIC

foram usadas 50s. Doxorubicin_123 é um perfil triplicado para o controle. inibidores não-quinase são de cor vermelha. D:. Inibidores de quinase têm uma maior selectividade no painel da célula do que os agentes citotóxicos clássicos (5-fluorouracilo, cisplatina, vincristina, doxorrubicina, etoposido, docetaxel e bortezomib)

Estudos recentes têm demonstrado que a linha celular os painéis podem ser utilizados para identificar novos marcadores de sensibilidade ao fármaco por acoplamento de resposta à droga para a presença de mutações do gene do cancro [4] – [7]. Estes estudos têm utilizado painéis de células com até 400-1000 linhas celulares, para descobrir novas sensibilidades relacionadas com variantes genéticas raras. Contudo, tais painéis são impraticáveis ​​para a utilização de rotina [8]. painéis menores são experimentalmente mais acessível e pode também dar informações úteis, tal como foi demonstrada para o painel de linha celular de sessenta do National Cancer Institute (NCI60), em que, desde a década de 1990 mais de 300.000 compostos foram caracterizados [9], e o painel de linha de quarenta e cinco célula da fundação de pesquisa japonês [10].

para comparar as atividades anti-proliferativa de todos os medicamentos inibidores da quinase, que foram aprovados para uso clínico, temos perfilado-los à nossa quarenta e quatro painel de linha celular. Nós correlacionados atividades de drogas para mutações do gene do cancro e identificou novos marcadores de sensibilidade às drogas para inibidores de MEK e EGFR. Além disso, os dados do painel da célula foram utilizados para comparar quantitativamente a eficácia relativa direccionamento de fármacos concebidos para inibir a mesma quinase.

Para estudar ainda mais origens bioquímicas de efeitos diferenciais em direccionado para a célula que perfilado todos os fármacos inibidores da quinase numa painel de ensaios de actividade de enzimas de mais de 300 de tipo selvagem e cinases mutantes [11]. Considerando estão disponíveis extensos dados de selectividade bioquímicos para muitos inibidores da quinase [12] – [14], este fornece os primeiros perfis extensos dos medicamentos aprovados CABOZANTINIB [15], dabrafenib [16], ponatinibe [17], regorafenib [18], trametinib [19] e vemurafenib [20] (Tabela 1). Combinação dos conjuntos de dados celulares e bioquímicos revela que a potência e a selectividade bioquímica são contribuintes independentes para o direccionamento eficiente dos condutores genéticas em células tumorais. Além disso, as atividades fora do alvo específicos pode contribuir positivamente para segmentação, como mostramos para os inibidores ABL1, ligando computacionalmente perfis kinome a segmentação celular. Nosso estudo mostra que o painel da célula profiling em combinação com perfis painel bioquímico é uma ferramenta poderosa para encontrar novas aplicações para os inibidores existentes e a concepção de inibidores de forma otimizada alvejados.

Resultados

Composição e validação de o celular painel

Um painel de quarenta e quatro linhas celulares de cancro humano foi montado a partir da American Type Culture Collection (ATCC). As linhas celulares foram seleccionadas para representar tanto uma vasta gama de diferentes tipos de tumores de tecidos (Figura 2A) e várias alterações genéticas diferentes em oncogenes e genes supressores de tumor (Figura 2B). DNA pública Informação sequência a partir do projeto CCL [4] e linha celular de cancro Encyclopedia (LECC) [5] foram usados ​​para selecionar as linhas celulares. Para todas as linhas de células, desenvolvemos ensaios de proliferação utilizando a medição do teor de ATP intracelular como uma leitura indireta do número de células. Em comparação com outros painéis de células, o painel (Oncolines) aumentou a diversidade genética (figura S1) e as concentrações de teste abrangem uma gama mais ampla: nove pontos em 32 mM a 3,2 nM. Nós não estimar actividades compostos por extrapolação fora da escala de teste, como foi levada a cabo num outro estudo [4]. Em vez disso, para garantir que todos os sub IC

50s caiu dentro da gama de teste, que foi alargado para concentrações subnanomolares no caso de compostos muito potentes. Para preservar as características da linha de células, as linhas de células foram cultivadas nos meios recomendados pelos investigadores originais que as linhas de células depositadas, e pela ATCC. Todas as células foram utilizadas no prazo de nove passagens do frasco ATCC originais

A precisão dos dados resposta celular está ficando cada vez mais atenção [21] – [23].. Ao seguir um fluxo de trabalho padronizado e aplicar critérios de qualidade rigorosos, conseguimos uma máxima IC

50 deslocamento de um factor de 2 e um desvio padrão de 0,07 em

10logIC

50 valores (um factor de 1,17), com base em múltiplas medições independentes dos mesmos compostos através do painel (Figura S2). Para referência este valor, nós investigamos reprodutibilidade em conjuntos de dados públicos. Apesar do consenso geral de que os conjuntos de dados públicas de experiências são perfis de compostos de elevado valor para a comunidade de descoberta de fármacos, a informação sobre a reprodutibilidade dos dados é escasso. Para o painel de NCI60 observou-se uma variação máxima de IC

50 de um fator de 11, quando o mesmo composto foi medido em duas ocasiões diferentes (Figura S2C) Além disso, uma análise recente de dados chEMBL [21], quando dois grupos em diferentes laboratórios mediu a mesma constante, um desvio padrão de 0,8 em

10logIC

50 anos foi encontrado. Isso se traduz em um fator de 10

0,8 = 6 desvio como padrão no IC

50 anos. Concluímos, portanto, que a nossa linha de células de perfil de dados são altamente reprodutível.

Para determinar se o painel tem tamanho suficiente, foi realizada uma análise de energia. Dependendo do número de linhas de células que transportam uma mutação do gene do cancro específico, um IC

50 deslocamento de 2 a 10 vezes entre respondedores e não-respondedores é estatisticamente significativa (Tabela S4). Estes limites caem bem dentro respostas geralmente observados [4], e, portanto, um painel de linha 44-célula é suficientemente grande para efectuar análises de responder de drogas.

Profiling of Clinical Kinase Inibidores no celular Painel

em uma análise de sensibilidade às drogas comparativa, nós perfilado todos os inibidores de vinte e cinco quinase no uso clínico em todas as linhas de células de quarenta e quatro anos, juntamente com seis agentes citotóxicos clássicos e o bortezomib inibidor do proteassoma (Figura 2C, Tabela S5). Todos os fármacos inibidores da quinase aprovados para oncologia mostrou actividade anti-proliferativa em, pelo menos, algumas das linhas de células. Apenas tofacitinib e fasudil, as duas drogas que são aprovados para as indicações não cancerosas (Tabela 1), não mostrou actividade inibidora ou muito baixa.

o agrupamento de todos os dados de proliferação celular (Figura 2C) confirmou que os agentes citotóxicos têm actividade relativamente undiscriminatory contra todas as linhas celulares. O perfil do bortezomib inibidor de proteassoma se assemelha ao de agentes citotóxicos, que ilustra que a inibição de um alvo bem definida não resulta em uma terapia alvo quando o alvo desempenha uma função fisiológica geral. De todas as linhas celulares, SHP-77 foi o menos sensível à doxorubicina, cisplatina, docetaxel, o etoposido, a vincristina e bortezomib (Figura 2C), que coincide com a sua expressão de múltiplos mecanismos multi-resistência a drogas [24]. HCT-15 e DLD-1 são diferentes no cariótipo mas originam a partir do mesmo paciente [25]. Consistentemente, os perfis das duas linhas de células aglomeram entre si. SW-620 e SW-480 também originam a partir do mesmo paciente, mas não se aglomeram entre si, principalmente porque SW-620, que é derivada a partir de uma metástase, é substancialmente mais sensível à trametinib inibidor MEK (Figura 2C).

Limpar alvo efeitos são mostrados por fármacos inibidores da quinase, como muitos inibir a proliferação de apenas algumas linhas de células. Que linhas depende do seu mecanismo de acção. Por exemplo, o EGFR inibidores lapatinib, erlotinib e aglomerado de gefitinib em conjunto porque inibem o mesmo subconjunto de linhas celulares, mais notavelmente UA-565, FaDu, CAL 27 e C-33A, que se originam a partir de uma variedade de tecidos e têm a característica comum que superexpressam

EGFR

(Tabela S3). O aglomerado ABL1 inibidores de imatinib e nilotinib em conjunto porque inibem selectivamente as linhas de células A-204 e K-562, que são dependentes ABL1 para o crescimento (Figura 2C). No entanto, outras drogas cinase inibe o crescimento de várias linhas de células, tais Axitinib, ponatinibe, bosutinibe, sunitinib e crizotinibe, que se agrupam em conjunto no mapa de calor (Figura 2C), a mTOR inibidores temsirolímus e everolimus, e o trametinib inibidor MEK (Figura 2C). Para analisar ainda mais a selectividade celular de inibidores de cinase, comparou-se a mais potente celular IC

50 de um composto, como uma medida da actividade celular específica, com a média de IC

50 no painel completo, como uma medida de toxicidade celular geral. terapias citotóxicas e bortezomib clássicos apresentam uma diferença de 10 vezes entre a média IC

50 no painel da célula e o mais potente IC

50 (Figura 2D). Em contraste, a maioria dos inibidores de cinase mostrou uma diferença de 100 vezes, e dasatinib mesmo uma diferença de mais de 1000 vezes (Figura 2D), o que demonstra que os inibidores da quinase de facto atingir uma janela de selectividade melhorada em comparação com os agentes quimioterapêuticos clássicos.

perfis bioquímicos of Clinical quinase Inibidores

para relacionar a actividade anti-proliferativa dos medicamentos inibidores da quinase para a inibição de metas específicas de cinase, todos os compostos foram perfilado numa concentração única de um painel de mais de 300 ensaios de cinase bioquímicos (Figura 3A, Tabela S6) [11]. Além disso, para os alvos mais importantes, IC

50 valores foram determinados (Tabela 1). Para vemurafenib, dabrafenib, trametinib, regorafenib e CABOZANTINIB, este é o primeiro perfil kinome grande no domínio público. Uma comparação dos RAF inibidores vemurafenib e dabrafenib aprovadas mostra que dabrafenib é muito mais potente do que o vemurafenib no tipo selvagem BRAF e BRAF mutante (V600E). Dabrafenib também inibe substancialmente mais cinases (Tabela 1; Figura 3A). O primeiro perfil de trametinib revela que, como a maioria dos inibidores de MEK [26], é extraordinariamente selectiva (Figura 3A). Regorafenib é um análogo estrutural do sorafenib e mostra um perfil bioquímico semelhante (Figura 3A). Regorafenib foi classificado como mais potente [18]. No entanto, os dados mostram que isto é verdade para a sua inibição de VEGFR2, um alvo de drogas angiogénicos, mas não para PDGFRα, um alvo em tumores estromais gastrointestinais, uma indicação para o qual está aprovada regorafenib bem (Tabela 1). inibição bioquímica de TIE2, outro receptor envolvido na angiogênese, foi menor, de acordo com um relatório anterior (Quadro S6) [18]. Em vez disso, tem uma actividade inibidora regorafenib adicional substancial em várias quinases oncogénicas, incluindo os receptores de efrina e p70S6K, que pode contribuir para o seu perfil clínico diferencial [27]. CABOZANTINIB tem sido caracterizado como um combinado de VEGFR2, TEM e inibidor de RET e é um dos inibidores mais potentes VEGFR2 (Tabela 1). Ele está aprovado para utilização no carcinoma medular da tiróide, consistente com a sua potente inibição da ret [28]. No entanto, esta não é uma característica distintiva de CABOZANTINIB, como todos os inibidores do receptor da cinase do factor de crescimento, e diversos inibidores ABL1 são inibidores potentes RET (Tabela S6). A actividade da CABOZANTINIB sobre o TEM, outro alvo importante droga [29], é muito mais especial, como crizotinib é atualmente a única droga aprovada que inibe esta quinase

A:. agrupamento hierárquico de perfis de inibidores de todas as drogas quinase em um painel de mais de 300 ensaios de cinase bioquímicos (% -inhibition a concentração de inibidor 1 mM). Trametinib, everolimus e temsirolimus mostrar apenas inibição menor, como ensaios de quinase mTOR e MEK não estão incluídos no painel. B: Potentes bioquímicos IC

50s no alvo biológico correlacionam com mais potente celular IC

50 anos. C: Biochemical selectividade leva a uma resposta mais selectivo no painel da célula. selectividade bioquímica foi quantificada por selectividade entropia [33] e a selectividade do crescimento celular direccionador foi expresso pela média IC

50 no painel da célula. Non-oncologia drogas Fasudil e tofacitinib foram excluídos da análise devido à falta de resposta. círculos abertos: a mTOR e MEK inibidores everolimus, temsirolímus e trametinib, respectivamente

Os perfis bioquímicos de todos os vinte e cinco drogas quinase no mesmo painel de ensaio nos permite estudar como bioquímica potência e selectividade influência. segmentação celular geral. Isto é importante, como no domínio da cinase, a selectividade dos novos candidatos a fármacos é um assunto muito debatido [30] – [32]. potência bioquímica melhorada se correlaciona com melhores celulares IC

50, e a força desta relação é (Figura 3B) dependente do alvo. Para monitorar selectividade bioquímica, que resumiu os perfis kinome através do cálculo da entropia selectividade (Tabela 1) [33]. Quanto mais baixo for este valor, a um composto mais selectivo. A entropia seletividade bioquímica inferior é esperado para resultar em toxicidade celular menos geral, conforme determinado pelo painel da célula média IC

50 e este é certamente o caso de muitos inibidores (Figura 3C). Axitinib, ponatinibe, bosutinibe, sunitinib e crizotinib têm uma alta entropia (Tabela 1) e mostram ampla atividade celular (Figura 3C). A toxicidade celular dos inibidores BRAF (V600E) EGFR, ABL1 e também melhora com o aumento da selectividade (Figura 3C). As excepções são os inibidores de mTOR e de MEK que são bioquimicamente inibidores altamente selectivos (Tabela 1, Figura 3A) mas inibem a proliferação de várias células. Isto confirma que MEK e mTOR conduzir a proliferação de muitas linhas de células, e ilustra que a selectividade de uma resposta celular também depende do alvo biológico.

marcadores genéticos de droga Sensibilidade

Para explorar o biologia subjacente às respostas celulares, investigamos os determinantes genéticos de resposta às drogas vinte e cinco inibidor da quinase de uma maneira imparcial. Nós correlacionados quaisquer diferenças no IC

50 por análise Anova com mutações, translocações, a sobre-expressão de mRNA e do número de cópias de DNA muda em um conjunto de genes de câncer altamente frequentes e validados (Tabela S3 e as figuras S3 para S5). Várias associações conhecidas de terapias específicas foram utilizados para validar o painel de célula como uma ferramenta de investigação para a descoberta de novos marcadores de sensibilidade aos fármacos. Por exemplo, nutlin 3a, um composto de estabilização da interação de p53 com MDM2, inibiu a proliferação de linhas de células de tipo selvagem para

TP53

mais potente do que as linhas de células que expressam mutante

TP53

(Figura S3 ). O BRAF inibidores vemurafenib e dabrafenib preferencialmente inibiu a proliferação de linhas de células que contêm o

BRAF (V600E)

mutação. inibidores ABL1 e inibidores de EGFR preferencialmente linhas celulares inibidas que são dependentes de

ABL1

e

EGFR

oncogenes, respectivamente (Figuras S4 e S5).

Com a análise Anova, nós novos marcadores de sensibilidade aos fármacos descobertos para inibidores de MEK e EGFR. O trametinib inibidor MEK preferencialmente linhas celulares inibidas portadores de mutações em

CTNNB1

, que codifica o factor de transcrição β-catenina (Figura 4A). A associação foi confirmada com dois outros inibidores de MEK,

i.

AZD6244 e PD0925301 (Figura S6). Em média, os inibidores de MEK foram entre 12 e 37 vezes mais potentes em linhas de células que expressam mutante β-catenina em comparação com linhas celulares que expressam apenas a proteína de tipo selvagem. Uma descoberta interessante adicional é que todos os quatro inibidores de EGFR, incluindo afatinib, são mais activos em ensaios de proliferação em linhas de células portadores de uma mutação em

SMAD4

(Figura 4B e figura S5). A associação foi confirmada com dois outros inibidores de EGFR que ainda estão em desenvolvimento clínico,

i.,

Pelitinib e neratinib (Figura S7). A diferença na actividade dos inibidores de EGFR em

SMAD4

mutante

células contra

do tipo selvagem variou de 2 a 12 vezes

A:. O trametinib inibidor MEK e B : o afatinib inibidor de EGFR. As parcelas vulcão mostram a média IC

50 deslocamento entre as linhas mutantes e não mutantes de células (eixo dos xx) e o significado de o teste Anova (eixo y). A significância foi corrigido para de vários testes e todas as associações acima do nível do limiar (linha pontilhada), são verdes. Áreas de círculos são proporcionais com o número de linhas de células que carregam mutações.

Comparando Segmentação Eficácia das Classes Inibidor

Análise dos determinantes genéticos da resposta celular permite a comparação da especificidade do celular segmentação de diferentes drogas que tenham sido concebidas para inibir o mesmo alvo molecular, tais como EGFR, ABL1, ou inibidores de BRAF (Tabela 1, Figura 5).

Cada círculo representa um inibidor da quinase comercializado e o seu crescimento de células alvo inibição. As linhas celulares que superexpressam

EGFR

: A. As linhas celulares que contêm o

BRAF (V600E)

mutação: B. As linhas celulares que contêm aberrante

ABL1

sinalização: C. Os compostos no canto superior esquerdo dos lotes têm direccionamento superior. associações estatisticamente relevantes após a correção para testes múltiplos são de cor azul. D: comparação quantitativa do inibidor a segmentação por padronização de IC

50 mudanças entre as linhas de células sensíveis e não sensíveis

inibidores de EGFR são um dos primeiros exemplos de terapias específicas (Tabela 1).. Gefitinib, erlotinib e afatinib foram aprovados para o cancro do pulmão de superexpressão de EGFR. Também tem actividade contra EGFR lapatinib (IC

50, 4,9 nM, Tabela 1). Estes inibidores são todos altamente selectivo (Tabela 1). Além disso, o espectro de inibidores selectivos vandetanibe, bosutinibe, ponatinibe e dasatinib são potentes inibidores de EGFR (Tabela S6). Sobreposição da Anova análises individuais para EGFR mostra que os inibidores seletivos têm uma melhor correlação com o

EGFR

níveis de expressão e mudanças de potência maiores do que os inibidores de espectro seletivo (Figura 5A). Também os inibidores de EGFR específicos, tais como gefitinib e erlotinib, tem uma melhor eficácia do que o direccionamento lapatinib inibidores Her2 /EGFR duplamente selectivo e afatinib, apesar de o inibidor irreversível afatinib é mais potente sobre o EGFR. O inibidor de EGFR gefitinib é mais orientada (mais superior esquerdo na Figura 5A), que tem propriedades bioquímicas semelhantes como erlotinib (Tabela 1). Sua segmentação superior está provavelmente relacionado às atividades não-alvo específicos:

ou seja,

gefitinib é menos ativo em ABL1 e mais ativo no EGFR (T290M) mutante e os receptores ephrin, que pode suprimir EGFR por cross-talk [34].

a descoberta de que o crescimento de muitos tumores é impulsionado por uma mutação específica no gene BRAF oncogene,

isto é, BRAF (V600E),

tem levado ao desenvolvimento da RAF inibidores vemurafenib e dabrafenib (Tabela 1). Trametinib é um inibidor de MEK, que actua a jusante do BRAF e também é registrado para BRAF cancros mutantes [19]. Sorafenib foi caracterizado como um inibidor de BRAF [35], mas não tenha sido aprovado para cancros BRAF mutante e mal inibe BRAF bioquimicamente (Tabela 1). análise Anova da linha celular profiling dados revelam uma forte associação da atividade anti-proliferativa dos dabrafenib com

mutante

BRAF (V600E), seguido à distância por vemurafenib (Figura 5B). Dabrafenib inibida linhas celulares mutantes BRAF com um IC 284 vezes inferior

50 do que as linhas celulares não mutantes. Para vemurafenib a diferença era de 3 vezes. Não houve correlação entre a atividade celular de sorafenib e

BRAF (V600E)

. Segmentação eficácia dos inibidores da RAF está relacionada com a potência aumentada de bioquímica dabrafenib comparação com vemurafenib, como dabrafenib é menos selectivo (Tabela 1).

Outra classe importante de drogas inibidoras da quinase são os que se destinam ABL1, dos quais um re-arranjado forma,

ou seja,

BCR-ABL1, impulsiona Philadelphia leucemia mielóide crônica cromossoma-positivo (CML). Imatinib, nilotinib, dasatinibe, ponatinibe e bosutinibe são drogas aprovado para esta indicação. No entanto, também diversos inibidores da quinase do factor de crescimento tais como crizotinibe, vandetanibe, Axitinib sunitinib e são inibidores potentes ABL1 (Figura 3A, Tabela S6). análise Anova de linha de células de câncer de perfil dados revelam uma forte associação com

ABL crescimento celular

dependente para todos os inibidores da CML-aprovados, exceto bosutinibe (Figura 5C). Dasatinib mostra o mais potente IC

50 deslocamento, que pode ser atribuído à sua potência superior. Porque é o espectro de dasatinib selectiva e inibe o crescimento de muitas linhas de células diferentes, a significância (p-valor) da associação é baixo. O inibidor de ABL1 mais visados ​​na Figura 4C é realmente o inibidor ABL1 mais seletiva, imatinib (Tabela 1).

Quantificação de Câncer Gene segmentação

Para comparar mais inibidores, desenvolvemos uma medida quantitativa da gene do câncer de segmentação com base em dados de painel de células e análise da resposta. A IC

50 mudança média (ΔIC

50) de um composto em teste ANOVA análises foi tomado como base, uma vez que indica a diferença na potência de um composto entre sensível (mutante) e insensível (de tipo selvagem) célula linhas. Outro parâmetro importante é a variância residual entre IC

50s no tipo selvagem ou grupo de transporte de oncogene de linhas celulares (σ

mut

ou

em peso

), o que é indicativo de efeitos adicionais sobre o crescimento celular, além do mecanismo inibidor principal. Para combinar ambos os valores foram selecionados a diferença média padronizada (SMD) como uma ferramenta quantitativa, que é calculado como ΔIC

50 /. Para o EGFR clinicamente utilizados, ABL1 e BRAF fármacos inibidores da quinase esta quantidade mostra claramente que dabrafenib e imatinib são excepcionalmente adequado e que a gefitinib e erlotinib são quase equivalentes (Figura 5C), sugerindo que o SMD do IC

50s é um bom ferramenta para classificar a segmentação de candidatos a medicamentos e terapias existentes.

Deduzir kinome Profiles Optimal

tem sido argumentado que reacções cruzadas específicas, além de uma atividade bioquímica primário, pode contribuir positivamente para o direccionamento celular de inibidores da quinase pela inibição da resistência, ou um feedback de sinalização, [36] [32], [37]. Muitos grupos de pesquisa tentaram projetar, dual-atividade específica, ou até mesmo inibidores de várias atividade da quinase [31], [38], [39]. No entanto, a questão que o perfil inibidor é mais ideal para alvejar um motorista genética particular não foi respondida. Usando dados celulares e bioquímicos, que começaram a derivar perfis bioquímicos tais ‘ideais’ para alvos celulares.

Dada a importância de inibidores ABL1 (Tabela 1), que procurou em primeiro lugar para qualquer atividade bioquímica, além de inibição de ABL1, que podem contribuir para a eficácia a segmentação desta classe de drogas. Vinte quinases relevantes, incluindo todos os alvos de fármacos inibidores da quinase actualmente aprovados, foram selecionados como candidatos que podem conferir actividades secundárias benéficos. Se qualquer uma destas cinases foram inibidas por qualquer dos 25 fármacos inibidores da quinase ( 80% na Tabela S6), o par foi marcado ‘activo’, de outro modo “inactivo”. A matriz de actividade bioquímica resultante foi usado numa análise Anova juntamente com os SMDs direccionado para a célula (Figura 5D) para identificar actividades bioquímicas que têm como alvo linhas de células que transportam o

ABL1

oncogene. Para além da identificação de ABL1 esperado, esta análise revelou, surpreendemente, ABL2 (ARG) como significativa lado-actividade (Figura 6A). Esta constatação foi confirmada por análise de regressão rede elástica (não mostrada), e ABL2 foi ainda validado pelo estudo de um conjunto de dados separada de ligação K

DS [12], confirmando que ABL2 de ligação aumenta a eficácia de segmentação de inibidores ABL1 na célula painel de linha (Figura 6B). A contribuição de ABL2 explica porque bosutinibe, que é um inibidor potente da ABL1, mas não possui actividade de ABL2, tem relativamente fraca eficácia no direccionamento

ABL1

células de transporte de oncogenes em comparação com outros inibidores ABL1 (Figura 5C).

a: componentes bioquímicos de inibidores da quinase que contribuem para o direcionamento específico de

ABL1

crescimento celular dependente. O círculo rotulado ABL1 refere-se à inibição ABL1 bioquímica. B: Inibidores com igual ABL1 e afinidade ABL2 em um conjunto de dados independente [12] são melhores na segmentação

ABL1

dependente do crescimento celular do que os inibidores com actividade ABL1 sozinho. Pobre afinidade ABL2 significa ligação K

diferenças d entre 4 e 26 vezes em comparação com ABL1. Igual afinidade significa ligação K

d diferenças entre 0,5 e 4 vezes.

Discussão

O desenvolvimento de inibidores selectivos da quinase resultou em uma série de medicamentos inovadores para geneticamente bem -definida populações de pacientes [2], [40]. Para apoiar o desenvolvimento da próxima geração de inibidores da quinase alvo, temos realizado uma análise aprofundada da eficácia celular e bioquímica no alvo de todos os inibidores da quinase em uso clínico (Nov. 2013), pelo perfil paralelo de todos os compostos em um painel de quarenta e quatro linhas de células e ensaio de um painel grande quinase (Figuras 2 e 3).

primeiro, a análise dos nossos dados mostra que existe um potencial para novas aplicações de inibidores da cinase-alvo (Figuras aprovados e S4 S5). Descobrimos novos marcadores de sensibilidade às drogas para inibidores de MEK e EGFR. inibidores de MEK foram 12 a 37 vezes mais activa em células abrigando mutado

CTNNB1

(Figura 4A).