Abstract

Introdução

In vitro

ativação e crescimento de folículos dormentes primordiais para produzir ovócitos fertilizável iria fornecer um instrumento útil para a preservação da fertilidade. O emprego de fosfatase e tensina homólogo (PTEN) inibidores, em combinação com a proteína-cinase B (AKT) moléculas de estimulação, tem sido previamente empregados para aumentar a activação folicular através da estimulação da via PTEN-Akt.

Métodos

Nosso objetivo é estabelecer melhorou

in vitro

ativação também para pacientes com câncer cujo tecido ovariano já foi criopreservados. córtex ovariano humano fresco e previamente criopreservado foram expostos a curto prazo de baixa concentração e específica ovário tratamento, com apenas um inibidor de PTEN.

Resultados

O

in vitro

protocolo de ativação aumenta os mecanismos de ativação de folículos primordiais em ambas as amostras frescas e criopreservadas, e amplia as populações em crescimento sem induzir a apoptose em qualquer folículos ou o estroma circundante. O tratamento aumenta a secreção de estradiol e restaura os níveis do hormônio anti-mülleriano previamente diminuído de expressão por meio de procedimentos de criopreservação. modulação Genomic da expressão relativa de

PTEN

genes da via foi encontrado em amostras tratadas.

Conclusão

O

in vitro

protocolo de ativação oferece novas alternativas para pacientes com tecido criopreservado à medida que aumenta o pool de folículos ativados viáveis ​​disponíveis para

in vitro

procedimentos de crescimento. A combinação de criopreservação de tecido ovariano e

na ativação vitro

de folículos primordiais, o principal componente da reserva ovariana, será um grande avanço na preservação da fertilidade

Citation:. Novella-Maestre E, Herraiz S , Rodríguez Iglesias B, Díaz-García C, Pellicer A (2015) Curto Prazo PTEN Inibição Melhora

In Vitro

A ativação do primordiais folículos, Preserva folicular Viabilidade, e restaura os níveis de AMH no tecido ovariano criopreservado de pacientes com câncer . PLoS ONE 10 (5): e0127786. doi: 10.1371 /journal.pone.0127786

Editor do Academic: Wei Shen, Qingdao Universidade Agrícola, CHINA

Recebido: 12 Janeiro, 2015; Aceito: 19 de abril de 2015; Publicado em: 29 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Novella-Maestre et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios SAF 2011-30031-CO2-01 e FIS PI13 /02.353 do Ministério da Economia e Competitividade espanhol, pela Dexeus Fundação Saúde Feminina Grant 2011 e por PROMETEOII /2014/045 e GV /2014/115 pelo Ministério valenciano Regional de Educação. participação SH foi apoiado por uma bolsa CD11 /00292 do Ministério da Economia e Competitividade e BRI espanhol por concessão AP-2010-0675 do Ministério da Educação, Cultura e Desporto espanhol. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a sobrevida após o câncer na adolescência e na infância melhorou [1]. Assim, uma grande população de mulheres jovens, que não tenham cumprido seu projeto reprodutiva, vai sofrer efeitos secundários do tratamento do câncer, tais como gonadotoxicidade. Esta circunstância, aliada ao fato de que a nossa sociedade atrasa idade fértil [2], significa que a preservação da fertilidade (FP) está a ser cada vez mais solicitado, especialmente em pacientes jovens com câncer.

Várias opções estão disponíveis para o sexo feminino FP, tais como a criopreservação de oócitos [3], os embriões [4], ou tecido ovariano [5-7].

O córtex do ovário contém foliculos primordiais quiescentes caracterizados pela sua resistência aos processos de congelamento e descongelamento. Dadas estas propriedades, a criopreservação de córtex ovariano, para posterior orthotransplantation autóloga é a técnica mais utilizada para preservar a fertilidade em pacientes com câncer [8]. Além disso, é a única opção em pacientes pediátricos sem oócitos maduros para ser criopreservados, e para os casos de doenças dependentes de hormonas [9, 10].

O número total de folículos primordiais disponíveis é, entre outros importantes perguntas, o principal determinante para garantir FP sucesso. Isso pode ser comprometida por vários factores, tais como o tamanho do ovário córtex, a idade, a quimioterapia anterior, e outros efeitos potenciais de cancro nas gónadas femininas. Já foi publicado que neoplasias, como câncer de mama, também pode afetar o resultado reprodutivo como reserva ovariana é prejudicada em mulheres jovens com linha germinal

BCRA1

mutações [11]. resposta ovariana a ciclos de estimulação controlada diminui em pacientes com câncer, mesmo antes de receber qualquer tipo de tratamento [12]. No entanto, o risco de reintrodução de células malignas no tecido transplantado é a principal preocupação da criopreservação ovariana. Este evento adverso está em risco aumentado [13-15] em pacientes com cancros hematológicos, tais como a leucemia, a doença maligna mais comum da infância [16]. Portanto, novas alternativas seguras devem ser desenvolvidos para otimizar a reserva ovariana nestes pacientes, onde criopreservação e transplante de córtex ovariano são contra-indicados [17], ou em doentes pediátricos que não têm oócitos maduros para ser criopreservados [18].

como passo prévio para o crescimento, os folículos dormentes primordiais, o principal componente do ovário reserva [19, 20], tem que ser ativado para o seu programa de desenvolvimento para começar. vias diversas estão envolvidos na orientação de activação do folículo através do controlo da iniciação de crescimento de oócitos e manutenção, tal como o homólogo da fosfatase e tensina suprimida no cromossoma 10 (PTEN), fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), a caixa forkhead O3 (FOXO3), e o mamífero alvo do complexo rapamicina 1 (mTORC1) [21-26]. No entanto, os mecanismos subjacentes da activação permanecem desconhecidos.

Tem sido relatado que o crescimento de todos os folículos primordiais em animais neonatais e adultos é promovida pela supressão específica do oócito de o

gene PTEN

[21, 24-26]. Este gene codifica uma enzima fosfatase que regula negativamente a PI3K-proteína cinase B (AKT) via de sinalização.

PTEN

exclusão aumenta a fosforilação de Akt e a exportação nuclear de proteínas FOXO3 a jusante [24]. Na verdade

FOXO3

deleção do gene também ativa folículos todos os dormentes em camundongos. Recentemente, Li et al. 2010 [26] desenvolveu um curto prazo, o tratamento específico do ovário de roedor e ovários humanos com um inibidor de PTEN e /ou um activador de PI3K. Tratamento aumentou de extrusão nuclear FOXO3 em oócitos primordiais, o que levou à sua activação.

Com base nestes resultados, um ensaio clínico foi realizado por Kawamura [27] para investigar a eficácia dos inibidores de PTEN e moléculas estimuladoras Akt usados para o

procedimento in vitro

activação (IVA) em mulheres com falência ovariana prematura. Este estudo mostrou que os restantes folículos quiescentes de reserva ovariana pode ser resgatado através da indução de mecanismos de ativação para produzir ovócitos fertilizável.

Incentivar por estes resultados, o objetivo deste estudo foi realizar a ativação de folículos primordiais latentes humanos imersos no córtex ovariano de pacientes com câncer através de incubação com um inibidor de PTEN para evitar a degradação do oócito para, assim, aumentar o “pool” de folículos primordiais viáveis ​​disponíveis para

in vitro

procedimentos de crescimento.

Matéria e Métodos

Chemicals

Todos os produtos químicos, meios de cultura e reagentes utilizados neste estudo foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA), salvo indicação em contrário.

projeto

estudo

declaração Ética e coleta de tecido.

Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Hospital Universitario y Politécnico La Fe, em Valência, Espanha (2011/0018) Institutional Review e conduzida de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. Após a obtenção do consentimento informado por escrito, 18 biópsias córtex ovariano humanos das mulheres recrutadas no nosso Programa de preservação da fertilidade foram obtidos. biópsias córtex ovariano só foram incluídos se o tecido restante estava disponível após a coleta córtex ovariano para fins de preservação da fertilidade. Os pacientes foram afectados pelo cancro da mama (n = 8), rabdomioma (n = 1), leucemia linfoblástica aguda (n = 1), linfoma de Hodgkin (n = 4), síndrome anti-sintetase (n = 1), sarcoma de Ewing (n = 1), meduloblastoma (n = 1) e linfoma não de Hodgkin (n = 1). A idade média dos pacientes foi de 27,8 (variação 14-37) anos. Nenhum paciente havia sido submetido a quimioterapia /radioterapia antes da extração córtex ovariano. biópsias do ovário (uma espessura aproximada de 10x10x1 mm) foram imediatamente lavadas com meio M199 isento de soro a 37 ° C, dissecado, removendo medula e cortado em dois pedaços: um para testar o protocolo IVA em tecido fresco e o outro para testá-lo em criopreservadas /tecido descongelado. Devido à dimensão limitada da amostra, apenas 14 das 18 biópsias obtidas foram incluídos no grupo criopreservado

Os grupos experimentais

Fresh peças de ovário (n = 18) foram divididos em tiras..; um foi imediatamente fixado para actuar como um tecido fresco condição inicial de controlo e foi atribuído ao Grupo 1 (S1 fig); o outro foi atribuído ao Grupo 2 e foi

in vitro

ativados e cultivados por 25 h com o inibidor de PTEN.

A fim de avaliar se houve quaisquer efeitos deletérios devidos condições de cultura, adicional tiras de ovário frescos (n = 9) foram atribuídos ao Grupo 3 e foram incubados sob as mesmas condições que os activadas, mas sem o inibidor de PTEN para actuar como um controlo de cultura fresco.

peças ovariano criopreservado descongelado /( n = 14) também foram divididos em tiras; um foi fixada imediatamente após a descongelação para actuar como uma condição de controlo do tecido criopreservado inicial e foi nomeado como o grupo 4; outro grupo foi atribuída a 5 para ser incubadas e cultivadas com o inibidor de PTEN durante 25 h; um terceiro foi cultivado durante 25 h sem o inibidor de PTEN e foi considerado o controle cultivado criopreservado, chamado Grupo 6.

As amostras dos grupos controle cultivadas frescos e criopreservados (grupos 3 e 6) foram utilizados para a TUNEL ea quantificação produção hormonal por ELISA, como descrito abaixo.

Criopreservação de tecido ovariano e descongelamento.

a técnica de congelamento lento foi utilizado para criopreservação tiras ovarianas. meio de cultura M199, contendo 5% de albumina de soro humano (HSA) e 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO), foi utilizado como uma solução de agente crioprotector. DMSO foi adicionado sequencialmente num procedimento de 2 passos e os fragmentos foram distribuídos em sacos de etil vinil acetato (Cryocyte, Baxter Healthcare, Deerfield, IL, EUA). sacos selados foram colocados na câmara de congelação de um dispositivo de congelamento de taxa controlada (Planer). Um protocolo de slow-congelamento foi aplicado seguindo o mesmo procedimento empregado atualmente para fins clínicos em nosso programa de preservação da fertilidade. Os sacos foram armazenados em azoto líquido (-196 ° C), como previamente descrito [28, 29]. Descongelamento ocorreu após 24 h. Bolsas foram descongeladas e cryoprotectant foi fluido utilizando um protocolo de 3 etapas, conforme descrito em outros lugares [28, 29].

protocolo de IVA

incubações de curto prazo com Dipotassium Bisperoxo (picolinato) oxovanadate V, PTP Inibidor XV (bPV (PIC)), foram realizadas tal como um protocolo de IVA. Resumidamente, as amostras activadas foram primeiro incubadas durante 1 h com 100 | iM de bpV (PIC) (Calbiochem, Merck KGaA, Alemanha) em meio α-MEM suplementado com 10% de HSA e 1% de antibiótico-antimicótico Solução (ATB). Em seguida, as amostras foram incubadas durante 24 h com o mesmo meio (100 uM bpV (PIC) + 10% de HSA, 1% ATB- α-MEM) suplementado com 0,3 I.U de FSH. Todas as incubações foram realizadas sob condições padrão de cultura a 37 ° C, 5% de CO

2.

Nos grupos de controlo cultivadas e G3 (G6), as amostras foram incubadas sob as mesmas condições, mas bpV ( PIC) não foi adicionado ao meio de cultura. Após o procedimento IVA e cultura, as amostras foram fixadas em formalina tamponada neutra e o meio de cultura foi imediatamente armazenadas a -80 ° C para a hormona de quantificação.

avaliação histológica e foliculares contagens

formalina-fixo As amostras foram incluídos em parafina (FFPE) e cortada em 4 mm de espessura. Cada 10

th seção foi corado com hematoxilina-eosina (H E) para realizar a análise histológica e contagem foliculares. As seções restantes foram utilizados para a análise imuno

Nos H amostras E-coradas, os folículos foram classificados da seguinte forma:. Estágio Primordial: o oócito foi cercado por uma camada de células da granulosa achatadas (GC); estágio primário: o oócito foi rodeado por uma camada completa de GC cubóide; estágio secundário: o oócito foi cercado por duas camadas, ou mais, de GC cúbico [19]. Folículos foram contadas apenas quando o núcleo do ovócito estava presente para evitar a dupla contagem. Somente folículos saudáveis ​​[30] foram contados para estabelecer as densidades e percentagens do repouso (primordiais) e folículos em crescimento (primário, secundário). Todos os H E-seções coradas foram examinadas por dois observadores diferentes (ENM, SH)

Imunohistoquímica

Para estabelecer a ativação folicular, estado proliferativa e crescimento por fases secundárias, imunocoloração com FOXO3a,. Ki-67 e do hormônio anti-mülleriano (AMH) foi feito. Um anticorpo monoclonal de coelho anti-humano FOXO3a (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, EUA), na diluição de 1: 150, foi incubado durante 60 min à temperatura ambiente (TA) para detectar a activação do folículo. Um rato monoclonal o anticorpo Ki-67 anti-humano (MIB-1, Dako Denmark A /S, Glostrup, Dinamarca), na diluição de 1: 100, foi incubado à temperatura ambiente durante 60 min, e foi utilizado para detectar especificamente células foliculares proliferando . Um anticorpo policlonal de cabra anti-humano-MIS (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg, Alemanha), na diluição de 1: 200, foi utilizado para detectar a HAM (60 min e temperatura ambiente). Para todos os anticorpos, uma reacção biotina /estreptavidina foi utilizado para a incubação do anticorpo secundário (método LSAB Dako Denmark A /S, Glostrup, Dinamarca), seguido por detecção com 3,30-diaminobenzidina (DAB). Para os controlos negativos, o anticorpo primário foi omitido; para os controlos positivos de um deslizamento adicional, contendo pulmão, endométrio proliferativo e testículos, foi incluído.

Os folículos foram considerados ativado quando foi detectada a extrusão nuclear FOXO3 no oócito. Ki-67 e AMH foram positivos quando detectado no GC e em núcleos de oócitos /GC, respectivamente.

AMH e Estradiol (E2)

produção

Para a determinação AMH, as amostras de meios de cultura foram analisados ​​por HAM-Gn-II ELISA (Beckman Coulter, Immunotech, Texas, EUA), seguindo o protocolo MANUFACTURER’S. Resumidamente, as amostras e os controlos foram dispensados ​​em poços de micro-titulação revestido com o anticorpo anti-HAM. Após incubação e lavagem, adicionou-se o anticorpo de detecção anti-AMH marcado com biotina. Após a lavagem, estreptavidina-peroxidase de rábano foi adicionado aos poços e desenvolvido. Em seguida, a absorvância foi medida num leitor de ELISA automático (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). O limite de detecção (LOD) do ensaio a HAM foi 0,08 ng /ml; Neste ensaio não detecta inibina A, activina A, FSH e LH. As variações intra- e inter-ensaios eram de 3,7% e 4,4%, respectivamente.

E2 foi medida com o kit estradiol EIA (Cayman Chemical Company, Michigan, EUA). O ensaio foi realizado seguindo o protocolo MANUFACTURER’S em amostras não diluídas. A absorvância foi medida a 405-420 nm. A LOD do ensaio de E2 foi de 20 pg /ml, e a interferência com outras hormonas esteróides foi 0,01%. Por 102,4 pg /mL, as variações intra- e inter-ensaio foram 13,0% e 8,2%, respectivamente.

Em ambos os ensaios, a absorvância era inversamente proporcional às concentrações de HAM e E2 nas amostras, que foi calculada a partir da curva de calibração. As amostras foram corridas em triplicado. Os resultados foram expressos em ng /ml e pg /ml, respectivamente, e também de acordo com a curva padrão estabelecido.

A apoptose quantificação por TUNEL

fragmentação do ADN foi detectada por o TdT (deoxyribonucleotidyl do terminal transferase) mediada por ensaio dUTP rotulagem nick-end (TUNEL), utilizando o vermelho TMR

in situ

kit de detecção de morte celular (Roche Diagnostics, Alemanha). Três secções embebidas em parafina por amostra foram limpas com xileno e re-hidratados (etanol, água destilada) antes de serem ensaiadas. Após lavagem com PBS, a recuperação de antigénio com tampão citrato 10 mM foi realizada em um forno de microondas durante 5 min. Em seguida, as lâminas foram incubadas durante 60 min a 37 ° C dentro de uma câmara humidificada escuro com 50 uL da mistura reaccional de TÚNEL; esta mistura foi omitido no controlo negativo. As amostras foram montadas com ouro Prolongar Antifade Reagente com DAPI (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, EUA) e examinadas com um microscópio de fluorescência convencional por. O sinal apoptótico foi registada como positiva quando coradas dUTP o núcleo vermelho.

Danos

celular foi quantificada em folículos primordiais, o principal componente da reserva do ovário, e no estroma do ovário. Os folículos foram considerados danificado quando o núcleo dos oócitos, ou mais de 50% de GC, foi corado vermelho por dUTP. No estroma do ovário, a morte celular investigada pelo método TUNEL foi expressa como percentagem de morte celular [(TUNEL + células /células totais) * 100]. A taxa de apoptose dos grupos IVA (G2 e G5) foi comparado com seus respectivos controles em cultura (G3 e G6). A selecção dos controlos de cultura permitiu-nos para elucidar se o dano celular, quando observado, pode ser devido à inibição de PTEN ou apenas para as condições de cultura. Além disso, o grau de apoptose detectada no córtex do ovário fresco ou induzida por técnicas de criopreservação, foi estabelecido anteriormente [28, 31-34].

Para quantificar o ensaio TUNEL, imagens de alta resolução foram obtidos por microscopia óptica ( LEICA DM4000B, Leica Microsystems GmbH, Alemanha) com uma câmera digital em anexo (LEICADFC450C, Leica Microsystems GmbH, Alemanha). A quantificação foi avaliada pela imagem ProPlus 6.3 (Media Cybernetics Inc. de Rockville, MD, EUA).

expressão do gene Relativa da via PTEN

ARNm foi obtido a partir de amostras de 7-9 ovarianos FFPE de cada grupo com o Recuperar Todos totais ácido nucleico kit de isolamento (Ambion, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, EUA), seguindo o protocolo MANUFACTURER’S. Para cada amostra, foram utilizados quatro lâminas 15 uM. Em seguida, foi sintetizado ADNc com transcriptase reversa MultiScribe do High-Capacity cDNA de transcrição reversa Kit (Applied Byosistems, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, EUA). As sondas TaqMan específicas foram ensaiadas pelo Real-Time PCR para quantificar a expressão relativa dos seguintes genes:

PTEN

,

PI3KCB

,

AKT1

e

FOXO3

. As misturas de reacção de PCR foram preparadas com 100 ng de cDNA como modelo em A expressão do gene 1xTaqman Mistura de PCR, seguindo o protocolo MANUFACTURER’S. Em seguida, as amostras foram amplificadas por PCR no sistema rápido 7900HT (Applied Byosistems, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, EUA). As condições de PCR consistiram em uma activação inicial de uracyl-

N

-glycosylase a 50 ° C durante 2 min., seguido de AmpliTaq activação do ouro a 95 ° C durante 10 min. Em seguida, as amostras foram repetido 40 vezes por desnaturação a 95 ° C durante 15 segundos, e uma extensão de recozimento a 60 ° C durante 1 minuto, por ciclo. Cada amostra foi ensaiada em triplicado.

Depois de controlar a eficiência de amplificação dos genes alvos, a expressão relativa foi obtido pelo método comparativo Ct (DDCT) [35]. A expressão de ARNm de gene alvo foi normalizada com a expressão do gene repórter 18S.

A análise estatística

Todos os dados são apresentados como média ± SEM. O teste de Friedman, seguido de uma Wilconox emparelhado

post hoc

teste, foi realizado para avaliar os resultados entre os grupos. p 0,05 valores foram considerados estatisticamente significativos. Todas as análises foram realizadas com SPSS 19.0 (IBM, Somers, NY, EUA)

Resultados

densidades folicular e populações

Entre os H . Seções ovarianos E-manchadas , 597 folículos foram contadas e examinadas. Quando densidades primordiais, primários e secundários foram comparados entre as amostras activadas e seus respectivos controles condição inicial (G1 e G4), não foram detectadas diferenças significativas nas amostras frescas ou criopreservados (p = ns), nem quando eles foram comparados com a cultura grupos de controle (G3 e G6) (Tabela 1).

as intervenções experimentais realizados sobre o tecido ovariano amostras incluídas em cada grupo experimental do nosso estudo estão listadas na Tabela 1. densidades foliculares e os percentuais de cada população foram calculados. Os valores são expressos como média ± SEM. O grupo criopreservado activado (G5) mostrou diferenças estatisticamente significativas para a percentagem de folículos quiescentes e crescentes em relação à condição inicial.

No entanto, após a activação, as percentagens de folículos primordiais reduzidos em ambos os grupos de IVA frescos e criopreservados quando em comparação com os controles condição inicial de tecido (Grupo 1: 62,3 ± 8,3%; G2: 47,9 ± 8,2%; G4: 55,0 ± 6,1%; G5: 38,2 ± 7,1%), mas as percentagens de os crescentes aumentou (G1: 37,7 ± 8,3%; G2: 52,03 ± 8,2%; G4: 46,9 ± 6,1%; G5: 61,9 ± 7,1%) quando comparados aos seus controles, ou quando comparados com os controles em cultura (G3 e G6). Este fenómeno foi estatisticamente significativa apenas no grupo G5 (p = 0,02 e p = 0,03, respectivamente).

A fim de elucidar se havia alguma diferença entre o nosso controle imediatamente fixa e os controles de cultura, um estudo exploratório foi realizado (Tabela S1). Não foram detectadas diferenças entre os tecidos de controle condição inicial frescos e criopreservados quando as densidades foliculares primordiais, primários e secundários foram comparados com seus respectivos tecidos de controlo cultivadas, nem quando as populações quiescentes e em crescimento foram comparadas.

ativação folicular

FOXO3 exportação nuclear, um indicador de activação do folículo, foi monitorizada (Figura 1A e 1B) e quantificada (Fig 1C e 1D) nas amostras activadas, e também nos seus respectivos controlos. Um aumento de 3 vezes na percentagem de folículos primordiais activados foi observado nas amostras activadas frescas (G2: 59,55 ± 9,88%) quando comparada com o seu controlo inicial (G1: 23,69 ± 5,71%, p = 0,03). Quando a activação de folículos primários foram analisados, não foi estatisticamente significativo, apesar do aumento de 15% observado no grupo activado (G2: 80,44 ± 4,8%, G1: 66,4 ± 8,9%, p = NS). Nas amostras activadas criopreservados (G5), o protocolo IV produziu um aumento significativo de 2 vezes na activação do folículo primordial e primária (Fig 1D) quando comparado com o grupo de controlo (primordial: G5: 63,7 ± 8,9%; G4: 36,8 ± 7,2 %, P = 0,04 e primário: G5: 93,80 ± 2,4%; G4: 47,5 ± 8,9%; P = 0,03)

(A) e (B);. FOXO3 detecção e localização, para monitorar a activação folicular. Folículos das amostras G2 e G5 são mostrados, respectivamente. Note-se que os folículos ativados dos grupos G2 e G5 apresentar uma extrusão FOXO3 nuclear (seta) e um sinal positivo no GC; (C) a percentagem de activação folicular primordial foi avaliada em tecidos ovarianos frescas, e um aumento significativo foi observado em G2 quando comparado ao G1 (* p = 0,03); (D) quando a percentagem folicular primordial activado foi comparado no grupo anteriormente criopreservado descongelado, a activação do folículo foi aumentada em G5 vs. G4 (** P = 0,03); (E) nova amostra activado (G2), folículos primordiais mostrando Ki-67 coloração em GC e ovócitos núcleos; F) o sinal-Ki-67 positiva nos oócitos dos folículos primordiais da amostra crioconservada-activado (G5); (L) a quantificação da expressão de HAM em GC. Um aumento na expressão AMH foi observado no GC dos folículos em ambos G2 (p = 0,006 §) e G5 (§§ p = 0,008) como um resultado de

in vitro

procedimento de activação com 100 uM de BPV (pic); (H) a secreção de estradiol para o meio de cultura. Como o gráfico mostra,

in vitro

procedimentos de ativação aumento da secreção de E2 no

in vitro

activado fresco (G2

vs

. G3 * p = 0,036) e criopreservados (G5

vs

. G6 ** p = 0,001) amostras quando comparados com os seus próprios controlos.

proliferação e crescimento de fases secundárias

O Ki-67-positivo as células foram detectados em oócitos e GC de todas as amostras activadas (Fig 1E e 1F). Este achado revelou que bpv (pic) a exposição, mesmo após os procedimentos de criopreservação, não afeta a capacidade proliferativa de folículos primordiais e primários.

AMH imunocoloração revelou um aumento significativo, de cerca de 23-30%, na AMH folículos positivos após o tratamento IVA nas amostras activadas de grupos G2 e G5 quando comparados com os controles condição inicial do tecido (G1: 53,3 ± 8,7%

vs

.G2: 76,3 ± 9,4%; p = 0,006 e G4: 25,7 ± 8,2%

vs

G5: 54,5 ± 10,2%; p = 0,008) (Fig 1G)

AMH e Estradiol produção

A quantificação da AMH.. em meio de cultura demonstraram que o protocolo IV aumentou significativamente a concentração de HAM em amostras frescas activados quando comparado com o grupo de controlo cultivadas (G2: 0,34 ± 0,1 ng /ml

vs G3:. 0,47 ± 0,1 ng /mL ; p = 0,017). No entanto, este aumento não foi detectada nas amostras previamente criopreservadas, onde os níveis de AMH permaneceram abaixo do LOD baixo em todas as amostras analisadas.

Um aumento significativo na concentração de E2 secretada para o meio de cultura foi detectado em ambos a fresco (G3: 84,9 ± 17,7 pg /ml

vs

G2: 98,6 ± 22,9 pg /ml; p = 0,036). e grupos de IVA criopreservados (G6: 33,6 ± 6,3 pg /ml

vs

G5:. 40,8 ± 6,8 pg /ml; p = 0,001) quando comparados aos seus respectivos controles cultivadas (Fig 1H)

apoptose por TUNEL

para elucidar se o protocolo IVA induzida qualquer efeito prejudicial no estroma do ovário ou folículos, os danos celulares foi investigado e quantificado por TUNEL nas amostras activadas e de controlo-cultivadas. células de TUNEL positivos foram detectados em todos os grupos experimentais, mesmo em ambos os grupos de controlo cultivadas, devido às condições de cultura (Figura 2A a 2D). Relativamente aos danos das células foliculares (Fig 2E), o estudo mostrou que não houve diferença estatística no grau de folículos danificados entre os grupos ativados e suas respectivas amostras de controlo da cultura no fresco (G2: 7,7 ± 4,0%

vs

G3: 13,0 ± 7,6%; P = NS) e tecidos criopreservados (G5: 6,25 ± 6,0%

vs

G6:. 28 ± 18,4%, p = NS), embora uma ampla variabilidade entre as amostras estava detectada (Fig S2). Quando o dano celular foi quantificada no estroma, não houve diferenças significativas, devido aos procedimentos de ativação foram encontrados (Fig 2F).

núcleos de células (A) coradas com DAPI (azul) para realizar o ensaio TUNEL. A amostra a partir do grupo G3. O sinal de TUNEL + foi encontrado nas células do estoma (vermelho) do G3; (B), note o folículo primordial na amostra G2. O TUNEL + sinal foi encontrado no estroma, mas note que estava ausente no oócito e GC dos folículos do grupo G2; (C) a amostra G6. folículos primordiais cercadas por núcleos GC e do estroma em forma achatada coradas com DAPI (azul). células positivas TUNEL-coradas a vermelho no estroma. Folículos foram negativos para o dano ao DNA na amostra G6; (D) a amostra G5 que continha dois folículos, núcleos de células primordiais corados com DAPI. Nenhuma TUNEL + sinal foi detectado no oócito e GC, mas era positiva no estroma do ovário; (E) índice de morte celular. Quantificação dos folículos com um sinal positivo TUNEL em oócitos ou GC. Não foram detectadas diferenças entre as amostras activadas activados e não; (F) a área de quantificação do estroma TUNEL positivos. Não foram detectadas diferenças para folículos quando a área de TUNEL + foi comparada entre os grupos activados activados e não. Esta constatação sugere que o dano celular encontrado no estroma de todos os grupos deveu-se ao processo de cultura.

expressão gênica relativa do

PTEN

via

para validar o efeito da bpV (pic) incubações sobre a expressão do gene da

PTEN

caminho, a expressão relativa dos principais genes foi quantificada.

em tecidos frescos, o protocolo IVA induzida vários modificações significativas, como uma mudança reduziu vezes (fc) do

PTEN

(fc = -1,21, p = 0,03) e

PI3K

(CF = -2.43) genes, e um sobre-expressão de

AKT

(fc = 7,65, p = 0,015) e

FOXO3

(fc = 6,78, p = 0,01) em comparação com os controles (Fig 3A e 3B). Quando o limite do Ciclo de Delta (ΔCt) foi estatisticamente comparadas entre o activado e amostras de controlo (Tabela 2), diferenças significativas também foram observadas entre o

PTEN

,

PI3K

e

FOXO3

perfis de expressão gênica. (p = 0,01; p = 0,03 ep = 0,015, respectivamente)

(a) vezes a mudança do

gene PTEN

. Diferenças significativas foram obtidas quando ΔCt foram analisadas e mostraram a inibição PTEN produzido pelo BPV (pic) em 100 M em fresco (G1

vs

. G2 p = 0,01) e em tecidos ovarianos previamente criopreservados (G4

vs

G5 p = 0,04); (B) vezes a mudança do

FOXO3

gene. Uma diminuição significativa foi detectada apenas nos tecidos frescos que se submeteram ao tratamento IVA quando ΔCt foram analisados ​​(G1

vs

. G2 p = 0,015).

Para o criopreservados amostras, a expressão relativa ou fold mudança do

PTEN genes da via

também foi modificado pelo IVA

(PTEN

fc = -1,29,

PI3K

fc = 0,59,

Akt

fc = 2,27, p = 0,007; e

FOXO3

fc = 1,94, p = 0,008) quando comparados com os controles (Fig 3A e 3B). Embora tenha sido observado o mesmo padrão de expressão, diferenças estatisticamente significativas foram detectadas apenas para o

PTEN

gene ao comparar ΔCt (p = 0,04).

Além disso, um estudo exploratório para a expressão do gene foi realizada entre amostras condição inicial e as respectivas controle culta. Como S2 Tabela mostrado, não foram detectadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos controle, quando comparado com um teste emparelhado.

Discussão

O uso de um protocolo de IVA com um inibidor de PTEN no córtex ovariano criopreservado humano a partir de pacientes com cancro aumentada do conjunto de foliculos primordiais activados viáveis ​​sem induzir efeitos deletérios, como os resultados obtidos indicam. Esta abordagem representa uma grande melhoria nos primeiros passos de

in vitro

técnicas de crescimento.