Abstract
Artonin E é um flavonóide prenilada isolado da casca do caule de
Artocarpus elasticus
Reinw. (Moraceae). Este estudo teve como objetivo investigar os mecanismos apoptóticos induzidas por artonin E em uma linha de células de cancro do ovário humano metastático SKOV-3
in vitro
. ensaio de MTT, ensaio clonogénico, laranja de acridina e iodeto de propídio dupla coloração, as análises do ciclo celular e anexina V foram realizados para explorar o modo de artonin morte celular induzida por E, em diferentes pontos de tempo. escada do ADN, a activação de caspases-3, -8 e -9, multi-paramétrico citotoxicidade-3analysis por rastreio de alto conteúdo, a medição da geração de espécies de oxigénio reactivo, e Western blot foram utilizados para estudar os processos envolvidos na apoptose. MTT resultados mostraram que artonin E inibiu o crescimento de células SKOV-3, com IC
50 valores de 6,5 ± 0,5 ug /ml após 72 h de tratamento, e mostrou menos toxicidade para uma célula de ovário humano lineT1074 normal, com IC
50 valor de 32,5 ± 0,5 ug /mL. Os resultados mostraram que artonin E induzida apoptose e paragem do ciclo celular na fase S. Este composto também promoveu a activação de caspases-3, -8 e -9. Outras investigações sobre a depleção do potencial de membrana mitocondrial e a libertação de citocromo
C
revelou que artonin tratamento E apoptose induzida através de regulação da expressão de pró-sobrevivência e pro-apoptóticos membros da família Bcl-2. Os níveis de proteínas survivina e HSP70 expressão também foram regulados em células SKOV-3 tratadas com artonin E. Propomos que artonin E induziu um efeito anti-proliferativo que levou à interrupção do ciclo celular fase S e apoptose através da desregulação das vias mitocondriais, particularmente a pro – e vias de sinalização anti-apoptose
Citation: Rahman MA, Ramli F, Karimian H, Dehghan F, Nordin N, Mohd Ali H, et al.. (2016) Artonin E induz a apoptose via mitocondrial A desregulação em SKOV-3 células de câncer de ovário. PLoS ONE 11 (3): e0151466. doi: 10.1371 /journal.pone.0151466
editor: Irina V. Lebedeva, Universidade de Columbia, Estados Unidos
Recebido: 05 de fevereiro de 2015; Aceito: 29 de fevereiro de 2016; Publicação: 28 de março de 2016
Direitos de autor: © 2016 Rahman et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos relevante os dados estão incluídos dentro do papel
Financiamento:. os autores agradecem a Universidade de Malaya para fornecer as bolsas de investigação no âmbito do projecto UMRG (RG077- 12BIO), Instituto de Gestão de investigação e Monitorização Research Grant (PG162-2014B) e Ministério do Ensino Superior Malásia sob High Impact Research Grant (UM-Mohe UM.C /625/1 /HIR /Mohe /SC /09) pelo apoio financeiro para a realização desta pesquisa.
Conflito de interesses :. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de ovário é considerada a doença maligna ginecológica mais letal [1]. Globalmente, mais de 230.000 novos casos de câncer de ovário são reportados a cada ano, com cerca de 140.153 mortes por ano [2]. Estudos epidemiológicos mostraram que as taxas de incidência de câncer de ovário são mais elevadas nos países ocidentais industrializados e em desenvolvimento. Em 2012, quase 22.280 novos casos de câncer de ovário foram diagnosticados nos Estados Unidos, com cerca de 15.520 mortes esperadas [3]. Na Malásia, em particular na Península da Malásia, câncer de ovário é o quarto câncer mais comum entre as mulheres, tornando-se 5% de todos os casos de câncer do sexo feminino [4].
Quase 75% dos pacientes com câncer de ovário apresentam doença metástase além o ovário por causa da localização do câncer [5, 6]. Não há testes de triagem estão atualmente disponíveis para a detecção precoce do cancro do ovário. Portanto, após a cirurgia citorredutor, a quimioterapia tem sido a principal abordagem do tratamento do câncer de ovário. A maioria dos procedimentos terapêuticos atuais para pacientes com câncer ovariano são baseados em drogas derivadas da platina em conjunto com o paclitaxel [7, 8]. A cisplatina e carboplatina são os mais potentes drogas quimioterápicas derivados de platina utilizados no tratamento do cancro do ovário. Embora a quimioterapia e cirurgia cytoreductive são acessíveis para o tratamento de câncer de ovário, estas abordagens são consideravelmente ineficaz e altamente tóxico, com baixas taxas de sobrevivência. Além disso, o desenvolvimento de resistência aos fármacos que ocorre ao longo do tempo torna o tratamento do cancro do ovário mais desafiadora. Toxicidade e resistência a drogas quimioterápicas atuais têm incentivado pesquisadores a explorar novos candidatos a fármacos de produtos naturais, com foco em apoptose como o processo fisiológico que oferece uma abordagem poderosa, não-incendiário para expelir as células lesadas a partir de tecidos, consequentemente, garantir a homeostase do tecido [9]. Dado que as células cancerosas desenvolveram várias vias para resistir a indução de apoptose, que exploram os produtos naturais que podem ter a capacidade para suprimir, matar, bloco, e inverter o processo de tumorigénese pode proporcionar novas oportunidades de desenvolvimento de fármacos do cancro, particularmente no tratamento do cancro do ovário [ ,,,0],10].
o gênero
Artocarpus
(Moraceae) compreende cerca de 55 espécies, que são amplamente distribuídos em todas as áreas tropicais e subtropicais, incluindo Malásia, Indonésia, Nova Guiné, e no Pacífico Sul [11 ]. Certas espécies deste gênero fornecer essencial, comida deliciosa, como
Artocarpus chempeden
(Chempedak),
A
.
heterophyllus
(jaqueira), e
A
.
altilis
(breadfruit) Muitos membros são reconhecidos como tendo valor medicinal no tratamento de um número de doenças, incluindo a malária, inflamação, úlcera, diarreia e [12, 13]. Em particular,
Artocarpus elasticus
Reinw. Ex Blume é uma importante fonte de alimento saboroso, madeira e medicina popular tradicional para muitas doenças.
Artonin E é um flavonóide prenilada conhecido. Este composto é encontrado em vários
Artocarpus
plantas, tais como
A
.
elasticus
,
A
.
nobilis
[14],
A
.
gomezianus
[15], e
A
.
communis
[16]. Estudos anteriores sobre a ação de artonin E contra linhas celulares de cancro selecionados, incluindo MCF-7 (adenocarcinoma de mama), HCT-8 (ileocecal), MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama), KB (carcinoma epidermóide de cavidade bucal humana), vero celular de linha e células P388 (leucemia) linhas, apresentado resultados antiproliferativa interessantes [11, 17, 18]. Este composto também exibiu fortes propriedades de eliminação de radicais contra o radical DPPH [19], e mostrou-se um potente inibidor de araquidonato 5-lipoxigenase com um valor de IC
50 valor de 0.36μM [20]. Além disso, aumenta artonin E anoikis (apoptose induzida por descolamento) de células H460 (cancro do pulmão) de uma forma dependente da dose [21]. Este composto também as células sensibilizadas pela regulação negativa da proteína anti-apoptótica myeoloid leucemia de células-sequência-1 (MCL1) [21]. Mais recentemente, artonin E exibiu propriedades anti-imigração e anti-invasão promissores em células de câncer de pulmão humanos H460 [15]. Tanto quanto é do nosso conhecimento, o mecanismo de artonin E como um agente anti-cancro e de indução de apoptose em células de cancro humano do ovário não foi elucidado. Assim, o presente estudo teve como objetivo analisar as propriedades de indução de apoptose de artonin E em células de câncer de ovário humano e os possíveis mecanismos envolvidos.
Materiais e Métodos
O material vegetal
as cascas do caule de
A
.
elasticus
foram coletadas de Ulu Langat, Selangor, na Malásia, em 2010. A coleção de material vegetal não exigem a autorização de qualquer autoridade local porque a planta não é uma espécie em extinção. As amostras foram identificadas pelo Dr. Rusea Go, do Departamento de Biologia da Faculdade de Ciências da Universidade Putra Malaysia. Um espécime voucher (S94408) foi depositado no herbário departamento [22].
extração vegetal
A casca seca de
A
.
elasticus
(1,5 kg) foi pulverizado e, subsequentemente, extraiu-se à temperatura ambiente utilizando-se hexano, EtOAc, e metanol como solventes. Os solventes em excesso foram concentradas utilizando um evaporador rotativo para se obter 1,55 g, 40,22 g, e 30,52 g de semi-sólido castanho escuro extracto, respectivamente. O extracto em bruto de EtOAc (38,22 g) foi revestido com sílica gel e submetido à precipitação usando cromatograf ia líquida de vácuo. A coluna foi eluída com misturas de hexano, hexano /CHCl
3, CHCl
3 /EtOAc, EtOAc /MeOH e MeOH para dar 60 fracções de 200 mL cada. As fracções semelhantes foram combinadas com base no perfil de TLC. A cristalização das fracções 26-36 proporcionou 2,3 g (0,06%) de um pó amarelo. O composto foi então recristalizado em hexano e acetona para se obter artonin E com o ponto de fusão (p.f.) de 232-233 ° C [23] e m.p.of 231-232 ° C, respectivamente. O extracto de metanol foi fraccionado usando chromatoghraphy coluna vácuo (semelhante para aspirar cromatografia de coluna) para produzir um outro lote de produto artonin E (0,6 g, um sólido amarelo).
Isolamento de artonin E
Artonin E foi isolado como um pó amarelo (3 g), pf 232-233 ° C [23] p.f. 231-232 ° C, a partir de metanol e os extractos de casca de acetato de etila de
A
.
elasticus
. Os isolados foram submetidos à identificação e posterior análise, e que produziu os seguintes resultados: IR
v
max cm
-1 de 3417 (OH), 2979 (CH saturada), 1644 (C = O), 1462, e 1354; UV λ
nm, de 351 (0,35), 268 (1,29), 209 (1,01) (ε log);
1H-NMR (400 MHz, acetona
-d
6
) de δ 13,19 (
s
, 1H, OH-5), 6,82 (
s
, 1H, H-6 ‘), 6,57 (
d
,
J
= 11 Hz, 1H, H-14), 6,54 (
s
, 1H, H-3 ‘), 5,62 (
d
,
J
= 10,1 Hz, 1H, H-15), 5,08 (
t
,
J
= 6,3 Hz, 2H, H-10), 3,1 (
d
,
J
= 7.36Hz, 2H, H-9), 1,52 (
s
, 3H, H-13), 1,41 (
s
, 3H, H-12), 1,39 (
s
, 3H, H-17), e 1,39 (
s
, 3H, H-18); APT-RMN (100 MHz, acetona
-d
6
) de δ 182,4 (C = O), 161,8 (C-2), 161,4 (C-7), 159,1 (C-5), 152,4 (C-8a), 148,9 (C-2 ‘), 148,6 (C-4’), 138,2 (C-5 ‘), 131,5 (C-11), 127,2 (C-15 ), 121,6 (C-10), 120,8 (C-3), 116,2 (C-6 ‘), 114,6 (C-14), 110,5 (C-1’), 104,7 (C-4a), 103,8 (C- 3 ‘), 100,7 (C-6), 98,8 (C-8), 77,9 (C-16), 29,1 (C-18), 29,1 (C-17), 27,4 (C-13), 23,7 (C- 9), e 16,8 (C-12); EIMS
m /z
(% intensidade) 436 (M
+, 45), 421 (100), 393 (24), 203 (66), 182 (22), e 69 (15 ). Com base nos dados físico-químicos e espectrais acima referidos, o composto foi identificado como uma flavona conhecido chamado artonin E (Figura 1) [23].
cultura celular
adenocarcinoma metastático do ovário (SKOV- 3) e linhas de células normais de ovário de hamster chinês (CHO), foram originalmente obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). As células SKOV-3 foram cultivadas em meio de McCoy 5A e células CHO foram cultivadas em meio F12K. Uma linha de células de fibroblastos do ligamento periodontal humano foi adquirido a partir de Lonza, EUA e mantidas em meio basal das células de estroma [24]. T1074 (linhagem humana de células epiteliais da superfície do ovário imortalizada normal) foi originalmente comprado de Materiais Biológicos Aplicadas (ABM
®) Canadá e cultivadas em Prigrow 1 médio [25, 26].
ensaio de viabilidade celular
Os efeitos inibidores de artonin e e dois controlos positivos paclitaxel e carboplatina foram examinados por ensaio MTT. Células a uma densidade de 5 x 10
3cells /cavidade foram colocados numa placa de 96 cavidades e deixados repousar durante 24 h, para se anexar. As células fixadas foram expostas a artonin E, paclitaxel, carboplatina e a diferentes concentrações e incubado durante 24, 48, e 72 h. Subsequentemente, 20 uL de 5 mg /mL de solução de MTT foi adicionado após o tratamento de droga e a mistura resultante foi incubada durante 4 horas, para formar formazano púrpura. Em seguida, 100 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) foi transferido para cada poço para dissolver o formazano púrpura, e os resultados foram medidos utilizando um leitor de microplacas (Tecan Infinito H 200 PRO, Männedorf, Suíça) a uma absorvância de 570 nm. As concentrações de metade do máximo que causaram inibição do crescimento celular (IC
50 valores) foram obtidos a partir da curva de crescimento viabilidade MTT.
Estudo morfológico usando um microscópio invertido normais
O SKOV-3 As células foram colocadas numa placa de 6 poços e deixado durante 24 h para anexar. A IC
50 de artonin E às 48 h pós-tratamento (8 ug /ml) com base nos resultados do ensaio de viabilidade celular MTT foi utilizado para tratar as células ao longo das experiências, excepto para o ensaio clonogénico. As células fixadas foram tratadas com artonin E por 24, 48, e 72 horas e observados sob um microscópio invertido normal a 200 × ampliação. As mudanças morfológicas celulares foram avaliadas e comparadas com as células não tratadas viáveis.
clonogénicas ensaio
As células SKOV-3 foram tratadas com tripsina, centrifugadas, e suplementado com meio fresco. As células foram imediatamente contados e semeado (300 células /placa) em uma placa de Petri 60 milímetros, e deixado durante a noite para anexar. As células fixadas foram tratadas com 0, 1, 5, 10, 15, e 20 ug /mL de artonin E durante 24 h. Após a incubação, os meios foram removidos e tratados foram adicionados meios frescos. As células foram incubadas durante três semanas para formar colónias. As colónias sobreviventes foram fixadas com 90% de etanol e coradas com violeta de cristal.
Avaliação morfológica de células apoptóticas por laranja de acridina e iodeto de propídio dupla marcação
O efeito da artonin E na indução de morte celular em SKOV -3 células foi determinada utilizando laranja de acridina (AO) e iodeto de propídio (PI) a coloração dupla. As células SKOV-3 foram semeadas a 5 × 10
5cells em um T75cm
2 balão e incubadas durante a noite para permitir a ligação. As células foram então expostas a 8 ug /ml de artonin E para 24, 48, e 72 h. Após a incubação, as células tratadas foram lavadas com PBS, e depois tratadas com tripsina e centrifugou-se a 1500 rpm durante 5 min. As células foram então ressuspensas em PBS frio e centrifugadas duas vezes para obter peletes limpos frescos. Os peletes frescas foram misturadas com um volume igual de solução de coloração corante fluorescente (1: 1), compreendendo 10 ng /mL de AO e 10 ug /mL de PI (dissolvida em PBS). A suspensão de células coradas foi recentemente cair sobre uma lâmina de vidro e observados sob um microscópio de UV-fluorescência (Leica ligado com Q-Flora Software) dentro de 30 min, antes de desvanecimento da fluorescência. Os critérios morfológicos utilizados para a classificação das células saudáveis, apoptóticos e necróticos são os seguintes: (i) células viáveis mostrar um núcleo verde com estrutura intacta round; (Ii) a apoptose início exibe um núcleo brilhante e verde denso, com condensação da cromatina; (Iii) apoptose tardia apresenta uma área de laranja denso devido à condensação de cromatina; e (iv) de necrose secundária mostra um /núcleo intacto laranja vermelha [27].
anexina V ensaio
Um ensaio de anexina V foi realizada utilizando uma BD Pharmingen
TM anexina V-FITC apoptosis Detection Kit (ApoAlert Annexin V, Clontech, Califórnia, EUA). As células foram colocadas numa placa de 6 poços e deixadas durante a noite para anexar. As células foram então tratadas com 8 ug /ml de artonin E para 24, 48, e 72 h. As células tratadas foram tratadas com tripsina e centrifugadas a 1.500 rpm durante 10 min para remover os meios residuais. Subsequentemente, 1X tampão de ligação foi adicionada a lavar os granulados frescos antes da sua re-suspensão em 200 uL de tampão de ligação. As células foram depois misturadas com 5 mL de Anexina V e 10? L de PI e incubou-se durante 15 min no escuro à temperatura ambiente. As células preparadas foram imediatamente analisadas utilizando a análise de citometria de fluxo (FACS Canto 11 Becton-Dickson). Em seguida, 300 ul de tampão de ligação foram adicionados a cada amostra para ajustar o volume de reacção de, pelo menos, 500 uL para a análise de citometria de fluxo. As células tratadas com DMSO (0,1%, v /v) foram usados como controle.
ciclo celular análise
SKOV-3 de células a uma concentração de 5 × 10
5 células eram banhado em uma T75cm
2 balão e incubadas durante a noite para permitir a ligação. As células fixadas foram tratados com 8 ng /mL de artonin E em diferentes pontos de tempo. Após o tratamento, as células foram tratadas com tripsina e centrifugadas a 1.500 rpm durante 10 min. Os peletes frescas foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas com 500 uL de etanol frio a 70%, e incubou-se à temperatura de -20 ° C durante a noite. O etanol restante foi então removido e as células foram ressuspensas em PBS contendo 20 ul de ARNase A (10 ug /mL) e 2 mL de PI (2,5 ug /mL). A mistura resultante foi incubada durante 30 min a 37 ° C no escuro. As amostras foram imediatamente analisadas usando FACS Canto 11 Becton-Dickinson citometria de fluxo. Para cada amostra, 10.000 células foram medidos. ModFit LT software (Verity Software House, Topsham, ME) foi utilizado para analisar a porcentagem de células em diferentes fases.
Detecção de geração de espécies reativas de oxigênio
2 ‘, 7’-Dichlorofluorescin diacetato (DCFH-dA) foi utilizado para examinar a produção de espécies reactivas de oxigénio intracelulares nas células SKOV-3 tratadas com artonin E. as células SKOV-3 foram semeadas na placa preta de 96 poços e incubadas durante a noite para anexar. As células foram então tratadas com 8 ug /ml de artonin E para 24, 48, e 72 h. solução salina equilibrada de Hank sem soro foi usada para lavar as células. Em seguida, 100 ul de solução de DCFH-DA foi adicionado a cada poço designado, e a placa foi incubada a 37 ° C durante 30 min. Os resultados foram analisados usando um leitor de microplacas de fluorescência (Tecan Infinito M 200 PRO, Männedorf, Suíça) a 485 nm de excitação e 520 nm de emissão.
multiparamétrica da citotoxicidade 3 de alto teor de triagem
Cellomics Multiparameter citotoxicidade 3 kit (Thermo Scientific
TM, Pittsburgh, PA, EUA) foi utilizado para realizar a detecção simultânea dos eventos apoptóticos cruciais em SKOV-3 células tratadas com artonin E. Resumidamente, SKOV-3 células foram semeadas a uma densidade de 5000 células /poço em placas de um preto de fundo plano de 96 poços (PerkinElmer, Inc., Wellsley, MA, EUA) e deixadas durante a noite para anexar. As células fixadas foram tratadas com 8 ug /ml para E artonin 24, 48, e 72 h. As células tratadas foram então expostos a 50 ul de solução de coloração de células vivas durante 30 min. O excesso de solução de coloração de células vivas médio e foram suavemente removido e as células foram então fixadas com 16% de paraformaldeído. Após a fixação, as células foram expostas com tampão de permeabilização seguido de tampão de bloqueio durante 15 minutos à temperatura ambiente. Primária citocromo
foram adicionados C
anticorpos e secundário DyLight 649 de cabra conjugado com IgG anti-rato e permitiu a interagir durante 1 h cada um. Hoechst 33342 corante foi usada para corar núcleos em células SKOV-3. Coradas células SKOV-3 em placas de 96 poços foram analisados utilizando o sistema de rastreio de alto-ArrayScan conteúdo (HCS). Todos os experimentos foram realizados em triplicata e os experimentos foram repetidos duas vezes.
O citocromo c liberando ensaio de apoptose
O citocromo c liberando kit ensaio de apoptose (ab65311) foi comprado de Abcam
® (Cambridge, UK ). O ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células SKOV-3 foram induzidas com artonin E em diferentes pontos de tempo. As células induzidas e induzidas por un foram recolhidas e centrifugadas a 6,00 ×
g
durante 5 minutos a 4 ° C. As células foram lavadas duas vezes com 10 ml de PBS gelado, centrifugado e recolhido a pelete. Os peletes frescas foram, em seguida, re-suspensas com 1,0 ml de 1X tampão de extracção mistura citosol contendo DTT e Inibidor de Protease e incubadas em gelo durante 10 minutos. As células foram então Dounce-homogeneizada antes de centrifugação a 7000 ×
g
durante 10 min a 4 ° C. O sobrenadante foi recolhido e guardado como fracções citosólicas. Os peletes restantes foram ressuspensos em 0,1 ml de tampão de extracção mitocondrial, agitada em vórtice durante 10 segundos e guardado como fracções mitocondriais. Ambas as fracções citosólicas e mitocondriais foram aplicados para análise de proteínas e prosseguiu com procedimento padrão de Western blot.
A activação de caspases-3, -8 e -9 ensaio
ensaio calorimétrico da activação de caspases -3, -8, -9 e foi conduzida usando P kit sistema D, EUA. Resumidamente, num T75cm
2 balão de 90% confluentes células SKOV-3 foram induzidas com artonin E para 24, 48, e 72 h. As células induzidas foram tratadas com tripsina e centrifugou-se a 1800 rpm durante 10 min. Os peletes frescas foram lavadas com PBS frio e imediatamente lisadas com tampão de lise de proteína. O lisado celular foi, então, mantida em gelo durante 10 min, centrifugou-se a 10000 g durante 15 min, e transferidas para um novo tubo. O lisado celular fresco (50 mL), que continha 100-200 ^ g de proteína, foi adicionado a uma placa de 96 poços em triplicado. Cinquenta microlitros de tampão de reacção e 5 uL de caspase foram então transferidas para cada poço designado antes de incubação da placa num CO
2 incubadora a 37 ° C durante 2 h. Um leitor de microplacas (Tecan Infinito M 200 PRO, Männedorf, Suíça) foi utilizado para análise em um comprimento de onda de 405 nm.
fragmentação do DNA ensaio
células SKOV-3 foram tratados com artonin E em diferentes pontos de tempo, e colhido pela adição de tripsina para promover descolamento. As células isoladas foram centrifugadas e lavadas duas vezes com PBS frio. O ADN a partir de células em suspensão foi extraído utilizando o suicídio Pista
kit de isolamento de ADN TM escada (Calbiochem, EMD Bioscience, Alemanha). As células foram então lisadas por mistura de 55 ul de TE (Tris e EDTA) tampão de lise e 20 ul de enzima A (RNase A). A mistura resultante foi incubada a 37 ° C durante 1 h. Subsequentemente, adicionou-se 25 uL da enzima de B (de proteinase K) e o lisado foi mantido num banho de água a 50 ° C durante a noite. A seguir à incubação, 2 ul de Pellet Paint, 60 uL de acetato de sódio 3M e 662 ul de 2-propanol foram adicionados ao lisado, e a solução foi rapidamente misturada por inversão e incubou-se à temperatura ambiente durante 2 min. O DNA foi então precipitado por centrifugação das amostras a 16000 x
g
durante 5 min. O sobrenadante foi removido e os sedimentos foram lavados frescos duas vezes com 70% e etanol a 100% arrefecido em gelo. Os peletes foram secos ao ar à temperatura ambiente durante alguns minutos para descartar o etanol e ressuspenso com 50 mL de tampão de ressuspensão do ADN. As amostras de escada de ADN preparadas foram carregadas numa electroforese em gel de 1,5% configurar e executar a 50 volts constantes, durante 3 h. Uma vez a electroforese foi completada, o gel foi imediatamente corado com SybrGreen ™ e a banda obtida foi visualizada utilizando o sistema de documentação de gel de UV (410 Biospectrum, UVP).
Western blot
SKOV-3 células foram semeadas num frasco de cultura de 75 centímetros
2 e expostas a artonin e para 24, 48, e 72 h. O tampão de lise (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 120 mM, 0,5% de NP-40; e PMSF 1 mM) foi utilizado para extrair a proteína total. A concentração de proteína foi determinada utilizando um kit de reagente de ensaio de proteína BCA (Bio-Rad, EUA). Quantidades iguais de proteína (40 ug) de extracto foram sujeitos a SDS-PAGE e electrotransferidas para uma membrana de polyvinylidenedifluoride (Bio-Rad). As manchas foram então bloqueadas com leite magro a 5% em TBS-Tween tampão 7 (Tris-base de 0,12, NaCl 1,5 M, e 0,1% de Tween 20) durante 1 h à temperatura ambiente. Após incubação com o anticorpo primário apropriado durante a noite a 4 ° C, as membranas foram lavadas e depois incubadas com peroxidase de rábano conjugada com anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente. As bandas de proteína foram detectadas usando o pico ou femto quimioluminescência (sistema ECL) e visualizada utilizando um sistema de documentação de gel de UV. Os anticorpos primários subsequentes, que incluem aqueles para β-actina (1: 10.000), Bax (1: 10.000), Bcl-2 (1: 10.000), HSP-70 (1: 10.000), survivina (1: 10.000), caspases -3 (1: 10.000), caspase -8 (1: 10.000), caspase -9 (1; 10 mil) e citocromo c (1: 200). foram adquiridos a Abcam, Cambridge, Reino Unido
a análise estatística
Média datafrom pelo menos três medições para cada amostra testada foram normalizados para os resultados não tratados. A análise estatística foi realizada usando SPSS-16.0 pacote e GraphPad Prism 5.0. Os dados foram apresentados como média ± SD e
p .. 0
05
foi considerado significativo
Resultados
Artonin E inibe selectivamente o crescimento do câncer as células normais e as células
in vitro
os efeitos antiproliferativos de artonin e em várias linhas celulares foram avaliadas utilizando o ensaio de MTT, tal como mostrado na Tabela 1. Esta experiência foi estabelecido com base na capacidade de o NADP (H) da enzima oxidoredutase celular dependente para reduzir o corante tetrazólio amarelo para o seu formazano insolúvel púrpura, que reflecte a proporção de células viáveis presentes. Entre as linhas celulares testadas, foram observadas as mais baixas IC
50 valores para as células SKOV-3 após 24 horas de tratamento. A IC
50 valores de SKOV-3 células tratadas com artonin E marcadamente diminuída após 48 e 72 h de tratamento, respectivamente, como mostrado na Tabela 2. Por outro lado, as células do ovário humanos normais (T1074), as células de fibroblastos humanos normais ligamento periodontal , e células CHO normais tratados com artonin e foram menos tóxicos. O IC
50 valores de células SKOV-3 tratadas com artonin E foram ligeiramente menor do que a tratada com carboplatina, que é uma droga quimioterapêutica bem conhecida (Tabela 2). O paclitaxel e carboplatina foram usadas como controlo positivo. Ambas as drogas diminuiu a viabilidade celular em células SKOV-3 de um modo dependente do tempo (Tabela 2).
Artonin E diminui a sobrevivência de células
As alterações morfológicas em SKOV-3 células tratadas com artonin E foram observados sob microscopia invertida normal (Figura 2). A estrutura morfológica dissociada das células tratadas foi evidente após 24 h de exposição para artonin E. vesículas de membrana celular foram observados com um decréscimo acentuado do número de células, indicando que a inibição de crescimento tinha ocorrido. A formação de corpos apoptóticos foi observada depois de um tempo de exposição mais longo. Em contraste, as células normais SKOV-3 permaneceram saudáveis com uma estrutura intacta.
(A) As células não tratadas. (B) células após 24 h de tratamento. (C) As células após 48 horas de tratamento. (D) células após 72 horas de tratamento. IC: estrutura celular intacto; DC: dissociar estrutura celular; MB: formação de bolhas de membrana; e AB:. corpo apoptótica
Artonin E inibe a formação de colônia em Skov-3 células
ensaio clonogênica foi realizada para examinar o efeito de longo prazo de células SKOV-3 tratado com artonin E . Os resultados na Figura 3 mostram que artonin E inibe a formação de colónias de uma maneira dependente da dose. A 5 ug /mL de artonin E, quase metade das colónias foram reduzidos, diminuindo acentuadamente a uma concentração de 10 ug /mL. Sem colónias foram formados depois de as células terem sido tratadas com 15 e 20 ug /mL de artonin E, sugerindo assim que este composto tem um efeito anti-proliferativos em células SKOV-3.
As células foram expostas a diferentes concentrações e de artonin durante 24 h e depois incubou-se durante três semanas para formar colónias. As colônias formadas foram fixadas com etanol e coradas com violeta de cristal.
A quantificação da apoptose usando AO-PI dupla marcação
foi empregada a análise
AO-PI para examinar as mudanças no nuclear morfologia em SKOV-3 células tratadas. As células em apoptose foram avaliados com base na condensação nuclear e fragmentação. Neste estudo, 200 células de cada experiência foram marcados e quantificado aleatoriamente. Os resultados revelam (Fig 4) que artonin E desencadeou alterações morfológicas que se relacionam com a apoptose tão cedo quanto 24 h após o tratamento. A principal característica da apoptose precoce foi observada com AO intercalados dentro do DNA fragmentado. Neste ponto de tempo, e vesiculação da membrana marginação do núcleo foram claramente visto. Mais 48 h de exposição mostraram que as células tratadas tinham sofrido apoptose tardia com a formação de bolhas observadas e vermelho /cor de laranja. necrose secundária com cor vermelha brilhante característica foi observado 72 horas após o tratamento por causa de PI de ligação ao ADN das células mortas. Em contraste, as células não tratadas exibiram uma estrutura nuclear intacta verde. Um estatisticamente significativa
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diferença na indução da apoptose em células tratadas (Figura 5). Além disso, foi observado um concomitante aumento na morte celular (necrose secundário)
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após o tempo de exposição prolongado, isto é, 72 horas após o tratamento (Figura 5) . Estes resultados mostraram uma gerados típicos dependentes do tempo morfológicas associadas à apoptose após tratamento artonin E nas células SKOV-3.
As células tratadas foram expostas a 8 ug /ml de artonin E para 24, 48, e 72 h . (A) As células não tratadas. (B) células após 24 h de tratamento. (C) As células após 48 horas de tratamento. (D) células após 72 horas de tratamento. VI: células viáveis; BL: blebbing das membranas celulares; LA: lateapoptosis; . E SN: necrose secundária
(EA: apoptose precoce; LA: apoptose tardia, e SN: necrose secundária). Os resultados são apresentados como média ± DP de três réplicas. * Indica diferença significativa a partir do controlo de cada fase (
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).
Artonin E induz a apoptose em células SKOV-3
A apoptose tem duas caracterizações morfológicas e bioquímicas distintas. Alterações nas células apoptóticas morfológicas, tais como a perda de assimetria de membrana plasmática e do acessório, vesiculação da membrana plasmática, condensação do citoplasma e núcleo, são sempre acompanhados por várias modificações bioquímicas [28]. Os nossos resultados até agora mostraram as características morfológicas típicas de apoptose em células tratadas artonin E SKOV-3. coloração Anexina V por citometria de fluxo /PI duplo foi empregue a fim de investigar as alterações bioquímicas em artonin tratada células SKOV-3. Uma das alterações bioquímicas anteriores em eventos de apoptose é um diferentes cinéticas de fosfatidilserina (PS) exposição no folheto exterior da membrana plasmática. Anexina V, um de Ca
2 + proteína de ligação ao fosfolípido -dependente se sabe que interage especificamente e fortemente com PS e pode ser utilizado para detectar a apoptose por direccionamento a perda de assimetria membrana plasmática [29]. A coloração AV- /PI- indica células viáveis devido ao PI não permeável na membrana celular intacta, ao passo que AV + /PI- coloração representa as células apoptóticas precoces, devido à perda de assimetria de membrana de plasma e forte afinidade de AV-FITC com PS. Em vez disso, a av + /PI + representa apoptose tardia e AV- /PI + representa fase necrótico, que é devido à diminuição da membrana do plasma e a integridade da membrana nuclear permite que PI para passar através das membranas e intercalar no ácido nucleico. Como ilustrado na Figura 6, mais de 40% das células nas fases precoces e tardios de apoptose após 24 e 48 h após o tratamento, respectivamente, indicando dependente do tempo significativo
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incremento quando comparado com células não tratadas. Além disso, o tratamento com artonin E também mostrou diminuição dependente do tempo em células viáveis com simultâneo aumento das células necróticas. Portanto, os resultados actuais sugerem que a antiproliferação e apoptose em células SKOV-3 tratadas estão intimamente relacionados.
[A] de controlo (não tratado), [B] 24 h de tratamento, [C] 48 h de tratamento, e [D ] 72 h de tratamento. [E] Histograma. Os resultados são apresentados como média ± DP de três réplicas.