Abstract

Um aumento do risco de câncer colorretal se relacionam com o desenvolvimento de síndromes metabólicas, incluindo hiperglicemia e hiperinsulinemia. Os elevados níveis circulatórios de glucose e /ou insulina ou a aplicação de insulina exógena pode promover a carcinogénese, a progressão do cancro e metástases, o que pode ser atribuído ao efeito Warburg ou glicólise aeróbica. Nós tentou resolver estas questões existentes, aplicando o análogo da glicose 2-deoxiglicose (2DG). De acordo com o

in vitro

estudos que realizamos, a glicólise de células de câncer colorretal pode ser interrompido por 2DG como diminuiu as produções celulares de ATP e lactato. Além disso, a apoptose induzida 2DG e paragem do ciclo celular e inibiu a proliferação, migração e invasão destas células. Uma vez que a insulina pode estimular a captação celular de hexose, incluindo 2DG, a combinação de 2DG e insulina melhorou a citotoxicidade de 2DG e, entretanto, superou os efeitos de promoção do cancro da insulina. Este

in vitro

estudo forneceu um ponto de vista de 2DG como um potencial agente terapêutico contra o câncer colorretal, especialmente para pacientes com hiperinsulinemia concomitante ou tratados com insulina exógena

Citation:. Zhang D, Fei Q, Li J, Zhang C, Sun Y, Zhu C, et ai. (2016) 2-Desoxiglucose Inverte o efeito promotor de insulina em células do câncer colorretal

In Vitro

. PLoS ONE 11 (3): e0151115. doi: 10.1371 /journal.pone.0151115

editor: Daotai Nie, Faculdade de Medicina da Universidade de Southern Illinois, United States |

Recebido: 30 de setembro de 2015; Aceito: 22 de fevereiro de 2016; Publicação: 03 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi financiado pela Prioridade Academic Programa de Desenvolvimento das Instituições de Ensino Superior Jiangsu (PAPD). Há potenciais conflitos de interesse foram divulgados

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é conhecido por ser fortemente. associada a um estilo de vida ocidental. A incidência aumenta rapidamente ao longo do século passado, em paralelo com o desenvolvimento económico em expansão [1] Perante o aumento da morbidade de síndromes metabólicas, foram realizados vários estudos para investigar a sua ligação com CRC. Evidências sugerem que o diabetes mellitus tipo 2 (DM), resistência à insulina, hiperinsulinemia são fatores de risco independentes para o cancro colorectal [2,3].

DM tipo 2 é caracterizada por hiperglicemia resultante da combinação de resistência à insulina e uma falta relativa de insulina. Alto nível de glicose circulante é susceptível de favorecer o desenvolvimento de câncer. A razão principal é que a maioria das células cancerosas predominantemente dependem de glicólise aeróbica para gerar a energia necessária para os processos celulares, um fenómeno conhecido como o efeito de Warburg [4]. Para além de ser a fonte de energia principal, a glucose é utilizado como uma fonte de carbono principal para reacções anabólicas [5] .Esta característica foi aproveitado para o cancro imagem em clínicas por aplicação de 2- (18F) -fluoro-2-desoxi-D -glucose (FDG) na tomografia por emissão de positrões (PET). Segmentação do metabolismo da glicose tornou-se uma estratégia potencial contra o câncer. Um dos inibidores mais promissores é glicolíticas 2-desoxiglucose (2DG) [6-8]. 2DG é um análogo sintético de glucose, que tem o grupo hidroxilo em C-2 substituídos por hidrogénio (Fig 1A). Após entrar na célula através de transportadores de glucose (Gluts), 2DG é convertido por hexoquinase para formar 2DG fosforilado que se acumula na célula, que leva à inibição não-competitiva do hexoquinase, diminuição da produção de ATP e o lactato, e, eventualmente, da célula de inibição de crescimento e de células morte (Fig 1B) [6-8].

(A) estrutura molecular da glicose e 2-deoxiglicose. (B) Por causa da semelhança estrutural com os da glucose, 2-desoxiglucose entra na célula através de glúteos, levando à interrupção da glicólise com produções diminuição de ATP e lactato [6-8]. L: glicose. 2DG:. 2-desoxiglucose

Em adição aos efeitos da hiperglicemia, resistência à insulina e a hiperinsulinemia compensatória também são importantes contribuintes para o desenvolvimento e progressão de diversas neoplasias [9]. A insulina foi confirmada como sendo capazes de estimular a captação de glicose em muitas células cancerosas [10], que pode promover o efeito Warburg. A insulina também pode exercer mitogênica e efeitos anti-apoptóticos [11-13]. Além disso, a insulina pode amplificar a biodisponibilidade de insulina como factor de crescimento 1 (IGF-1) [14-16]. Os doentes com cancro colorectal concomitante e DM tipo 2, que também pode utilizar a insulina está enfrentando a ameaça potencial que a insulina pode promover a progressão do câncer. Os estudos com modelos animais já confirmaram a suposição [17]. Embora atualmente a relação entre a insulina ou resistência à insulina e câncer colorretal não é explícito, ninguém pode ignorar os potenciais efeitos da insulina em vários estágios da carcinogênese.

Entendendo o metabolismo da glicose e a função da insulina em células do câncer colorretal irá promover o desenvolvimento de algumas novas abordagens para a sua prevenção e tratamento. Este

in vitro

estudo visa determinar os efeitos anticancerígenos de 2DG e os efeitos da insulina em linhas celulares de cancro colorrectal. Além disso, este estudo investigou a possibilidade de insulina no reforço da eficácia anti-câncer da 2DG.

Materiais e Métodos

cultura celular

Duas linhas celulares de cancro colorrectal (HCT116, LoVo ) foram obtidos a partir da Cell Bank of Type Culture Collection da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China) e cultivadas em alta concentração de glicose meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM) (4,5 g /l de glucose) contendo soro de bovino fetal a 10% (FBS ), 1% de penicilina-estreptomicina, numa atmosfera de 5% de CO

2 incubadora humidificada a 37 ° C.

Chemicals

2DG e insulina de pâncreas de bovino foram comprados a Sigma (St. Louis, MO). Os fármacos foram dissolvidos em meio de cultura completo. As soluções foram esterilizadas por filtração utilizando unidades de 0,22 mícrons seringa filtro (Beyotime Biotecnologia, Xangai, China).

A proliferação celular ensaio

celular Counting Kit-8 (CCK8) ensaio para a proliferação celular foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (Beyotime Biotecnologia, Xangai, China). As células foram tratadas com 2DG e /ou de insulina durante 24, 48 ou 72 h. Em seguida, os meios de cultura foram substituídos com meio fresco suplementado com o reagente de proliferação celular. Após incubação de 2 h, as medições foram realizadas utilizando um leitor espectrofotométrico placa com 96 poços (Sunrise-básica Tecan, Áustria) com o comprimento de onda de absorvância a 450 nm. Efeito da insulina sobre a proliferação celular foi avaliada e uma concentração apropriada de insulina foi determinada para se ter êxito estudos.

A citometria de fluxo em análise de apoptose e o ciclo celular

A citometria de fluxo em análise de apoptose foi realizada utilizando um método de coloração dupla com anexina-V-FITC e iodeto de propídio (PI). O ensaio foi realizado usando o kit de apoptose (KeyGen Biotech. Co. Ltd., Nanjing, China) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram cultivadas com 2DG e /ou de insulina durante 24 h e, em seguida, tratadas com tripsina, sem EDTA, lavadas com PBS, coradas com anexina V-FITC e PI e analisadas por citometria de fluxo (Becton-Dickinson, San José, CA). Os dados foram processados ​​pelo fluxo de Kaluza citometria de software de análise 1.2 (Beckman Coulter).

Para a análise do ciclo celular, ciclo celular Kit Análise de Beyotime Biotecnologia (Xangai, China) foi utilizado com base em instruções do fabricante. As células foram recolhidas, lavadas com PBS, fixadas em etanol frio a 75% e incubadas durante a noite a 4 ° C. Em seguida, as células foram lavadas e re-suspensas em solução de coloração contendo PI e ARNase e incubaram-se durante 30 minutos a 37 ° C antes da análise de citometria de fluxo. fracções do ciclo celular foram quantificadas com software WinCycle (Phoenix Fluxo Systems, San Diego, CA).

A migração celular e invasão ensaio

A migração e invasão de células de câncer colorretal foram avaliados utilizando Transwell Apoia permeáveis (Corning Incorporated, Corning, NY, MA) com filtros de 8,0 tamanho de poro, 6,5 mm de diâmetro. As suspensões de células do cancro em DMEM (5 x 10E5 células /ml, 100 �) suplementado com ou sem drogas foram adicionadas ao compartimento superior da câmara e 600μL DMEM contendo 10% de FBS foi adicionado ao compartimento inferior. Após a incubação de 24 horas, os filtros foram colhidos e imersos em violeta de cristal. Células na superfície superior do filtro foram enxugadas com cotonetes. O número de células que passaram através do filtro foi contado em cinco campos ao microscópio. Para as

In vitro

ensaio de invasão, Matrigel (BD Biosciences) foi adicionado à superfície superior (50 ul /cm

2) para formar uma barreira de matriz e a concentração de células foi inoculado 1 × 10E6 células /ml .

conteúdo ATP analisa

O conteúdo ATP intracelular foi determinado utilizando um método baseado em luciferina-luciferase. As células foram incubadas com 2DG e /ou de insulina durante 24 h. Em seguida, as células foram tripsinizadas, contadas e processados ​​usando ATP Assay Kit (Beyotime Biotecnologia, Xangai, China) e as medições foram realizadas utilizando um luminómetro (GloMaxTM 20/20, Promega Corporation, Madison, WI). A produção de ATP foi normalizada para o número de celular e expressas como percentagem dos valores de ATP normalizados encontrados em células de controlo. Analisa

A produção de lactato

análises produção de lactato foram realizadas utilizando kit de ensaio de lactato (Beyotime Biotecnologia, Shanghai , China). Após o tratamento de 24 horas com 2DG e /ou insulina, as células foram raspadas com um raspador de células e os números de células foram contadas. Em seguida, as suspensões foram sonicadas em gelo durante 3 ciclos. Cada ciclo consistiu de sonicação 5s com uma potência de 100W a partir de um disruptor de células ultrassónico Qsonica (Newtown, CT) seguido por 30 incubação. As amostras sonicadas foram ensaiadas para determinar todo o níveis de lactato seguintes instruções do fabricante. níveis de lactato extracelular também foram determinados como os meios de cultura foram recolhidos e testados. As medições foram realizadas utilizando um leitor de placas Tecan espectrofotométrico com o comprimento de onda de absorvância a 540 nm. As produções de lactato foram normalizados para o número de células e expressa como percentagem do controlo.

Extracção de proteínas e Western blotting

As células foram tratadas com 20uU insulina e /ou 5 mM de 2DG, durante 24 h e, em seguida, foram lisadas com tampão de radioimunoensaio ensaio de precipitação (RIPA) (Beyotime biotecnologia, Xangai, China) suplementado com 1% de fluoreto de phenylmethanesulphonyl (PMSF) (Beyotime biotecnologia). As concentrações de proteína foram determinadas utilizando um kit de ensaio de proteína BCA (Beyotime biotecnologia). As amostras foram misturadas com 5 x SDS-PAGE tampão de carregamento de amostra. Quantidades iguais de extractos de proteína total foram submetidos a electroforese através de um gel de poliacrilamida e transferido para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Billerica, MA) através de transferência electroforética molhado. As membranas foram bloqueadas em leite desnatado a 5% em Tris-tamponada salina mais 0,1% de Tween 20 (TBS-T) e, em seguida, incubadas durante a noite com anticorpos primários indicados a seguir a Phospho-AMPKα (Thr172) (Cell Signaling Technology), AMPKα (Cell Signaling Technology) , SLC16A3 /MCT4 (Abcam), LC3A /B (Cell Signaling Technology), GAPDH (Cell Signaling Technology), Mcl-1 (Cell Signaling Technology), Survivin (Cell Signaling Technology), MMP2 (Cell Signaling Technology), p62 (Cell Signaling Technology). As manchas foram então lavadas e incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., EUA) e visualizadas com Immobilon ™ Ocidental HRP quimioluminescente Substrato (Millipore Corp., EUA) utilizando o sistema FluorChem E (ProteinSimple, Santa Clara, CA ).

Análise estatística

Os dados foram expressos como média ± SD de pelo menos três experiências independentes. A análise estatística foi realizada com base em teste t de Student. Um valor de P inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. As operações estatísticas foram realizadas utilizando Statistical Package for Social Science versão 19 (SPSS, Chicago, IL).

Resultados

A insulina aumentou a indução de anti-proliferação e apoptose de 2DG

in vitro

na primeira série de experimentos, examinamos se 2DG possuía qualquer efeito anti-proliferativo em linhas celulares de cancro colorrectal. ensaio de proliferação celular foi realizada a cada 24 horas durante 72 horas. Os dados mostraram que 2DG exerceu um efeito inibidor significativo sobre a proliferação de ambas as células em comparação com o controlo (Fig 2B1 e 2C1). O efeito inibitório foi dose e tempo-dependente. Em contraste, a insulina geralmente exibiu uma promoção modesto sobre a proliferação celular (Fig 2A), o que não aumentam em paralelo com o aumento da concentração de insulina. 20μU /ml de insulina perto do limite superior de nível fisiológico normal em jejum foi selecionado para suceder estudos. A combinação de insulina e 2DG (20μU /ml) resultou em um significativamente maior supressão da proliferação celular em comparação com o tratamento sozinho 2DG (Figura 2B e 2C).

percentagens de células viáveis ​​em diferentes pontos de tempo (24,48 , 72h),. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão dos resultados obtidos a partir de três experiências independentes. (A) A proliferação celular em resposta a concentrações de ingrediente insulina. células de cancro colo-rectal HCT116 LoVo (B e C) e foram tratados com 2DG em concentrações indicadas, com ou sem a presença de insulina (20μU /ml). (D) As células foram tratadas durante 72 h com 5 mM de 2DG e /ou 20μU /ml de insulina. As curvas de crescimento celular foram construídos. *, diferenças significativas em comparação com os controles (P 0,05). #, Diferenças significativas versus controlo ao mesmo tempo (P 0,05).

A análise celular apoptose por citometria de fluxo mostrou um ligeiro aumento da apoptose de células cancerígenas após o tratamento 2DG

in vitro

(Figura 3). As proporções de células de anexina V-positiva /PI-negativo, indicando células precoce apoptóticas e células de Anexina V-positiva /PI-positivas, indicando apoptose tardia ou células necróticas, aumentou de uma forma dependente da dose (dados não mostrados) sob o efeito de 2DG. A análise Western blot mostrou que 2DG inibiu as expressões de proteínas de sobrevivência Mcl-1 e de survivina (Fig 4). Embora não seja estatisticamente significativa, a insulina tende a suprimir a apoptose de células de cancro. Quando a insulina foi administrada concomitantemente, as células apoptóticas foram ainda aumentada em comparação com a monoterapia 2DG (Figura 3). Os resultados dos ensaios de proliferação e apoptose celulares sugeriu que a insulina promovido os efeitos anticancerígenos de 2DG e que 2DG inverteu o cancro promover efeitos da insulina.

análise de citometria de fluxo da apoptose das células foi detectada por coloração com PI e Anexina V-FITC (A: HCT116; B: LoVo). As células foram tratadas com 5 mM de 2DG e /ou 20μU /m insulina. O experimento foi realizado em triplicado. Imagens representativas foram mostrados. *, P 0,05. #, Diferenças significativas em comparação com os controles (P 0,05)

A análise Western blot de Mcl-1 e survivin.. GAPDH foi utilizado como um controlo de carga.

2DG prisão induzida ciclo celular G1

in vitro

células cancerosas proliferam rapidamente são viciados em quantidades aumentadas de glicose não só para a produção de energia, mas também para a biossíntese de ácidos nucleicos, proteínas, lípidos e [18]. A interferência com o metabolismo da glicose pode parar ou atrasar a progressão do ciclo celular. A citometria de fluxo de análise da distribuição do ciclo celular mostraram que a incubação de células com 2DG resultou num aumento da percentagem de células em fase G1 (Figura 5). Por outro lado, a insulina induziu um aumento acentuado de células em fases S e G2. No entanto, a paragem do ciclo celular G1 por 2DG foi atenuada, mas não promovido pela insulina

a distribuição do ciclo celular de células cancerosas tratadas sob diferentes condições. (A: HCT116; B: LoVo). O experimento foi realizado em triplicado. Imagens representativas foram mostrados. *, P 0,05. #, Diferenças significativas em comparação com os controles (P 0,05).

Combinando 2DG com insulina migração de células cancerosas marcadamente suprimida e invasão

in vitro

Para determinar se 2DG poderia atenuar potencial metastático, Transwell Apoia permeáveis ​​foram utilizados com e sem revestimento de Matrigel para avaliar a invasão e migração, respectivamente. Em comparação com o grupo controle, invasão e migração foram significativamente inibido em ambas as células tratadas com 2DG (Fig 6). Por outro lado, a insulina aumentou significativamente a migração celular e invasão do cancro. O número de células que migraram e invadiram foram, respectivamente, 1,28 e 1,32 dobras dobras dos controlos no HCT 116, 1,25 dobras e pregas 1,42 em LoVo. Em comparação com a monoterapia 2DG, a migração e invasão em ambas as células foram ainda deprimido pela combinação de insulina e 2DG. O número de células que migraram e invadiram caíram mais de 50% das pessoas em grupos de controle. A análise Western blot mostrou que a insulina promove a expressão da proteína-MMP2 um membro chave entre as metaloproteinases de matriz, que poder explicar em certa medida a invasão efeito promotor da insulina. Em contraste, 2DG inibiu a expressão de MMP2 (Fig 7B).

na migração e analisa invasão das células cancerosas, foram analisados ​​cinco campos seleccionados aleatoriamente. Imagens representativas são mostrados. O número de células que migraram e invadiram foram apresentados. Os dados foram representados como média ± SD. #, diferenças significativas em comparação com os controles (P 0,05). * P 0,05.

(A) Os níveis totais extracelulares e de lactato foram mostradas para as células tratadas com 2DG e /ou de insulina durante 24 h. O lactato intracelular foi determinado como a diferença entre os do total e extracelular. #, diferenças significativas em comparação com os controles (P 0,05). * P 0,05. (B) Análise de Western blot de SLC16A3 /MCT4, MMP2. GAPDH foi utilizado como um controlo de carga.

Combinando 2DG com insulina levou a uma diminuição marcada na ATP e lactato de produção

in vitro

Com base do anticancerígeno efeitos, em seguida, investigaram o efeito da 2DG da glicólise

in vitro

. Rapidamente as células cancerosas proliferam são caracterizados por glicólise elevada, portanto, a hipótese de que 2DG levaria à supressão da glicólise devido ao seu caráter nonmetabolizable e inibição de algumas enzimas da glicólise. ATP e níveis de lactato em resposta a 2DG foram analisados. reduções significativas nos níveis totais de ATP intracelular foi observado após a administração 2DG (Fig 8A). A incubação de células HCT116 e LoVo com 2DG no 5mM durante 24 h conduziu a níveis de ATP a 53% e 42% dos níveis em células não tratadas, respectivamente. A presença de insulina não afectou a produção de ATP. Quando as duas drogas foram aplicadas em conjunto, o conteúdo de ATP foram ainda mais diminuída. Como consequência de privação de ATP, 2DG induzida a supra-regulação e activação da proteína cinase activada por AMP (AMPK), como demonstrado por análise de Western blot (Figura 8B). 2DG também induziu a regulação positiva de LC3I e a conversão de LC3I para LC3II (Fig 8B), o que sugeriu a regulação positiva de autofagia. Outro marcador de autofagia – p62- diminui com a elevação da autofagia, uma vez que pode ser degradado no presente processo [19]. Tal como mostrado na Fig 8B, 2DG reduzido o nível de p62. 2DG assemelha estruturalmente glicose, mas ela não pode ser metabolizado para gerar energia mimetizando assim o efeito de privação de glicose e activação autofagia.

(A) Os seguintes níveis de ATP no tratamento de 2DG e /ou insulina (20μU /ml) durante 24h em células de câncer colorretal. os níveis de ATP foram normalizados a amostra de controlo não tratada. Os dados são média ± SD de 3 ensaios independentes. #, diferenças significativas em comparação com os controles (P 0,05). * P 0,05. (B) Análise de Western blot de Phospho-AMPKα (Thr172) representando AMPK ativa, AMPKα representando total de AMPK, p62, LC3A /B. GAPDH foi usada como um controlo de carga.

Quanto à determinação da produção de lactato

In vitro

, suspensões de células foram sonicadas e analisadas para os níveis totais de lactato (Fig 7A). A diferença entre os níveis totais extracelulares e lactato pode indicar indirectamente o nível intracelular lactato. Os resultados mostraram que ambos os níveis totais e extracelulares de lactato foram aumentadas pela insulina em comparação com o controle, enquanto surpreendentemente os níveis de lactato intracelulares foram diminuiu ligeiramente em ambas as células. Colocámos a hipótese de lactato pode ser consumido por estas células normóxicas para o anabolismo ou exportado muito mais fortemente sob a influência de insulina. Como esperado, 2DG diminuiu significativamente a produção de lactato. A combinação dos dois agentes levou a uma diminuição ainda mais o nível de lactato enquanto o lactato intracelular parecia ser ligeiramente aumentada. Monocarboxilato transportador 4 (MCT4), envolvido na extrusão de lactato, foi significativamente regulada negativamente pela combinação como mostrado por Western blot (Figura 7B), o que pode explicar o aumento na concentração de lactato intracelular em certa medida.

Discussão

para DM tipo 2 pacientes, hiperglicemia pode aumentar o risco do cancro, que em certa medida, pode ser atribuída ao efeito de uma Warburg fenómeno que a maioria das células cancerosas predominantemente produzir energia pela glicólise, em vez de fosforilação oxidativa, seguido por uma secreção elevada de ácido láctico, mesmo na condição de tensão de oxigénio suficiente [5]. A hiperinsulinemia pode também ser um contributo potencial para cancro como o efeito metabólico da insulina pode promover o efeito Warburg. Uma dose elevada (suprafisiológica) de insulina exógena é muitas vezes necessária no tratamento de diabetes para alcançar a normoglicemia. Enquanto melhora o controle metabólico, elevado nível de insulina pode aumentar o risco de câncer de efeitos dose-dependentes em celular diferenciação, crescimento, proliferação, migração e invasão [20]. Para pacientes com cancro da diabetes, o desenvolvimento de resistência à insulina é relatado para ser combinado com a sobre-expressão frequente receptor de insulina e o aumento da actividade da insulina em células cancerosas [12]. A insulina também pode impedir a eficácia de muitos medicamentos quimioterapêuticos [21-23]. Embora ainda continua a ser uma questão de saber se, e em que medida, a terapia de insulina exógena provoca a progressão do câncer em pacientes, ninguém pode ignorar a ameaça potencial de insulina, que foi confirmada pela

In vivo

estudos com animais [11 ].

quanto ao câncer colorretal, diabetes tem sido sugerido como um factor-chave para o seu desenvolvimento [11]. Estudos epidemiológicos observaram uma correlação positiva entre hiperglicemia de jejum (≥ 6,1 mmol /l) ea incidência de câncer colorretal. Apesar dos avanços significativos no tratamento médico e cirúrgico, cancro colorectal permanece um tumor maligno altamente prevalente e letal em países desenvolvidos. Com base nos pontos de vista acima, sugerimos que a segmentação do metabolismo da glicose no tratamento do cancro colorectal é promissor. Embora, muitas células cancerosas são sensíveis e vulneráveis ​​à glicose privação [24]. Esta estratégia é impraticável em mamíferos porque o processo de gluconeogénese, ocorrendo principalmente no fígado, fornecendo uma fonte de glicose a partir de substratos de carbono não-hidratos de carbono, tais como o lactato, o glicerol. Assim, é possível e sustentável para imitar a privação de glicose

In vivo

através da inibição do metabolismo da glucose através da aplicação de agentes farmacológicos tais como 2DG. Uma vez transportada para as células via Gluts, 2DG é fosforilada pela hexoquinase para formar 2DG-6-fosfato que não pode ser posteriormente metabolizado através de glicólise, mas em vez acumula e noncompetitively inibe hexoquinase e inibe competitivamente a isomerase de fosfoglucose [18,25,26]. Portanto, o metabolismo da glucose normal é perturbado, levando a privação de energia e, eventualmente, morte celular. Aqui, nós propusemos 2DG como um candidato em potencial contra o cancro colorectal. Especialmente, quando a insulina exógena é administrado ou hiperglicemia circulatório é combinado, a eficiência de 2DG pode ser ainda melhorada uma vez que a insulina pode promover a absorção celular de hexose.

O

In vitro

estudo realizado de ensaios funcionais células de cancro colo-rectais, tais como a proliferação celular, apoptose, migração e invasão. Glicólise foi analisado pelas produções de ATP e lactato. 2DG e insulina foram aplicados para o tratamento destas células, quer isoladamente ou em combinação. Os resultados mostraram que tinha 2DG efeitos inibidores sobre células de cancro, enquanto a insulina teve efeitos promotores directos. Quando a insulina foi combinada, os efeitos anticancerígenos de 2DG foi melhorada e o cancro promover efeitos da insulina foram invertidos. A inibição da glicólise de 2DG também foi promovida pela insulina.

A análise Western blot de proteínas de sobrevivência, incluindo Mcl-1 e survivina, foi também analisado. O resultado mostrou que 2DG inibiu a expressão de ambas as proteínas (figura 4). Survivina é um membro da família inibidor de apoptose (IAP). Ele é altamente expressa na maioria das células cancerosas humanas. Survivina podem inibir a activação da caspase e suprimir a apoptose. [27,28]. Mcl-1 é um membro anti-apoptótica da família Bcl-2. É localiza para a mitocôndria, antagoniza os membros pró-apoptóticos da família Bcl-2, e inibe a apoptose induzida por estímulos citotóxicos. Mcl-1 é referida como estando envolvida na morte celular induzida por inibição do metabolismo da célula. Mcl-1 downregulation desempenha um papel crucial na apoptose induzida 2DG [7,29].

2DG administração com uma dose baixa não foi muito eficiente na indução de morte celular e apoptose. Enquanto, migração e invasão foram marcadamente suprimida por 2DG, a qual foi atribuída a improvável a citotoxicidade modesta de 2DG com essa dose. Sottnik et ai. informou que 2DG foi altamente eficiente para inibir o fenótipo metastático de uma grande variedade de tipos de tumor tanto

in vitro

e

in vivo

, que foi associado com a reorganização do citoesqueleto e inibição da catepsina L expressão [ ,,,0],30]. Neste estudo, detectou o nível de expressão de MMP2. As metaloproteinases de matriz (MMPs) são uma família de enzimas proteolíticas zinco e dependentes que estão envolvidas na quebra da matriz extracelular e fenótipo metastático de cancros. Como um membro chave das MMPs, MMP2 foi mostrado ser capaz de degradar o colagénio IV, o principal componente estrutural da membrana basal [31-33] análise .western blot mostrou que a insulina promove a expressão da proteína de MMP2, que pode, até certo ponto explicar a sua promoção da invasão. Em contraste, 2DG inibiu a expressão de MMP2. A glicólise foi marcadamente inibida por 2DG como demonstrado pelas produções restritas de ATP e de lactato. Devido a depleção de ATP e aumento da relação intracelular de AMP /ATP, AMPK, um sensor de energia celular chave, é activado. ativação da AMPK tenta recuperar geração de ATP através de ligar o catabolismo e desligar o anabolismo. processos ATP-consumindo tais como a biossíntese, o crescimento e proliferação celular são contidos [34,35]. a progressão do ciclo celular pode ser parado na transição de fase G1-S [36]. Elevados resultados glicólise na geração de grandes quantidades de lactato, que tem de ser transportado para fora das células, a fim de impedir o envenenamento si. transporte de ácido láctico através da membrana plasmática é mediada por uma família de transportadores ligada monocarboxilato-protão (MCTs) [37]. A expressão aumentada de MCT4 em células tumorais tem sido relatado previamente [38]. Os nossos resultados mostraram que o tratamento 2DG levou a uma diminuição da produção e a regulação negativa da MCT4 lactato. As inibições de produção e extrusão de lactato são aspectos importantes nos efeitos anticancerígenos de 2DG desde lactato elevado durante o metabolismo da glicose geralmente prova ser benéfico para as células cancerosas. Por um lado, lactato resultados da exportação na acidificação do microambiente que facilita a angiogénese tumoral e fornece uma condição favorável para a activação das catepsinas e metaloproteinases levando a degradação da matriz extracelular e a metástase de células tumorais [38,39]. Por outro lado, a acidificação extracelular contribui indirectamente a resistência das células cancerosas a radiação e alguns fármacos citotóxicos, tais como doxorrubicina [40]. Além disso, o lactato é capaz de inibir a diferenciação de monócitos a células dendríticas e inactivação de libertação de citoquinas, assim, contribuir para a fuga imunitária de células cancerosas [40]. Lactato, também pode favorecer o crescimento de células tumorais aeróbia adjacente, uma vez que pode ser consumida para tomar o lugar da glucose para a fosforilação oxidativa [38].

Com base em diversas pesquisas recentes, a toxicidade após o tratamento 2DG poderia ser explicado em mais de um mecanismo de acordo com o perfil metabólico de um tipo de célula do cancro específico. Imitando a privação de glicose, 2DG é capaz de induzir autofagia [41-43]. A conversão de LC3-I lc3-II é um processo representativo para o fluxo autofagia [19]. A expressão significativamente regulada positivamente de proteína LC3 II foi detectada em células tratadas 2DG cancro colorectal. Além LC3, p62 é um outro fabricante de autofagia. p62 é uma proteína de ligação de ubiquitina e é necessário para a formação de agregados de proteína ubiquitinadas. p62can ser incorporadas seletivamente em autophagosome através da ligação a LC3, levando os agregados de proteína para degradação. a degradação lisossómica de autofagossomas leva à diminuição da p62 [19,44]. A análise Western blot mostrou diminuição dos níveis de p62 após a administração de 2DG. Embora a autofagia é comumente conhecido como um mecanismo de sobrevivência celular sob estresse, uma vez amplamente ativado, o auto-preservação pode se transformar em destruição em massa [45]. Apesar da inibição da glicólise e indução de autofagia, 2DG pode provocar a alteração da glicosilação N-ligada e intensificação do stress oxidativo [25,26,46].

Considerando os efeitos colaterais de 2DG, outro altamente glucose tecidos dependentes apesar células cancerosas, tais como cérebro, coração, retina e testículos, são todas as potenciais vítimas [38]. ensaios clínicos anteriores comprovaram que a administração de 2DG foi geralmente seguro e bem tolerado pelos pacientes. Curiosamente, embora a administração intravenosa de 2DG poderia causar hiperglicemia, os efeitos secundários observados eram bastante semelhantes às de hipoglicemia [47-49].

Em relação à associação entre CRC e diabetes, meformin também foi encontrado para ser um potencial droga contra o câncer colorretal através da regulação da AMPK e alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) -signaling caminho [50]. Semelhante a 2DG, meformin pode inibir a geração de energia de célula de câncer e afetar o metabolismo celular. A combinação de metformina e 2DG foi investigada a ser muito mais eficaz na supressão de células de cancro através da indução de apoptose.