Abstract
crosstalk dinâmica entre os receptores do fator de crescimento, moléculas de adesão celular e da matriz extracelular é essencial para migração de células cancerosas e invasão. As integrinas são receptores transmembranares que se ligam a proteínas da matriz extracelular e permitir a adesão celular e organização do citoesqueleto. Eles também medeiam a transdução de sinal para regular a proliferação e sobrevivência celular. O receptor do factor de crescimento semelhante a insulina tipo 1 (IGF-IR) medeia o crescimento de células tumorais, a aderência e a inibição da apoptose em diversos tipos de cancro. Foi anteriormente demonstrado que β
1 integrinas regulam o crescimento independente de ancoragem de células de cancro da próstata (AEP), regulando a expressão de IGF-IR e as funções de transcrição mediada por receptor de androgénio. Além disso, foram recentemente relatado que o IGF-IR regula a expressão de β
1 integrinas em células de AEP. Temos dissecados o mecanismo através do qual o IGF-IR regula β
expressão 1 integrina na AEP. Aqui nós relatamos que o IGF-IR é crucial para o crescimento celular AEP e que β
1 integrinas contribuir para a regulação da proliferação de IGF-IR. Nós demonstramos que β
1 regulamento integrina pelo IGF-IR não ocorre no nível do mRNA. expressão exógena de um CD4 – β
1 integrina domínio citoplasmático quimera não interfere com essa regulamentação e não consegue estabilizar
1 β a expressão da integrina na ausência de IGF-IR. Isto parece ser devido à ausência de interacção entre o β
um domínio citoplasmático e o IGF-IR. Nós demonstramos que o IGF-IR estabiliza o β
1 subunidade, protegendo-o da degradação proteossómica. O α
5 subunidade, um dos parceiros de ligação de β
1, também é regulada negativamente, juntamente com β
1 em cima do knockdown de IGF-IR, enquanto nenhuma alteração é observada na expressão da α
2 , α
3, α
4, α
6 e α
7 subunidades. Nossos resultados revelam um papel mecanicista crucial para o α
5β
1 integrina, a jusante do IGF-IR, na regulação do crescimento do câncer
Citation:. Sayeed A, Fedele C, Trerotola M, Ganguly KK , Languino LR (2013) IGF-IR Para promover o crescimento do cancro da próstata através da estabilização α
5β
integrina 1 Níveis de proteína. PLoS ONE 8 (10): e76513. doi: 10.1371 /journal.pone.0076513
Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América
Recebido: 03 de julho de 2013; Aceito: 23 de agosto de 2013; Publicação: 09 de outubro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Sayeed et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Concessão contrato patrocinador: NIH; número de concessão do contrato: R01 CA-89720 e CA-109874 (LRL), P01 CA-140043 (LRL); American Cancer Society (ACS) -IRG-08-060-04 (a AS); Contrato de patrocinador concessão: Departamento de Saúde da Pensilvânia. Este projeto também é financiado, em parte, sob uma concessão Commonwealth University Research Program Enhancement com o departamento de Pensilvânia da Saúde (H.R.). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses: Dra. Languino, o autor correspondente, é um membro do conselho editorial para PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
A adesão das células à matriz extracelular (ECM) é primariamente mediado por integrinas e é crucial para o crescimento e sobrevivência celular. As integrinas são receptores transmembranares heterodiméricas, que consiste em subunidades a e p, que são não-covalentemente associado; eles ligar fisicamente a ECM para o citoesqueleto de actina intracelular, mas também é capaz de transduzir sinais bidireccionalmente através da membrana do plasma [1]. Através da ligação a ligandos de ECM, as integrinas são activados e capazes de regular funções celulares, iniciando cascatas intracelulares de sinalização. Até agora, 24 heterodímeros integrina, 18 α e 8 β subunidades e cinco β
1variantsubunits β
1Aβ
1Bβ
1Cβ
1C-2 e β
1D, gerado por splicing alternativo , têm sido descritas [2], [3]. As integrinas são reguladores críticos do crescimento, diferenciação, sobrevivência, migração e invasão [4], [5]. Tem sido relatado que a progressão do cancro da próstata (AEP) para estágios avançados está associada a alterações no perfil de expressão de integrina [6], [7], [8].
As vias de integrina e factor de crescimento de sinalização são pensado para ser mecanicamente ligados porque a adesão de células a ECM é crucial para as células a responder a certos factores de crescimento [9]. sinalização do factor de crescimento pode perturbar adesões focais, os locais presumíveis de sinalização mediadas por integrina [9] e, consequentemente, modular a adesão celular mediada pela integrina e na motilidade. interacções físicas e funcionais entre as integrinas e componentes de vias de sinalização de factor de crescimento, incluindo o factor de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) ou as suas proteínas de sinalização a jusante [10], [11], têm sido relatados. O nosso laboratório demonstrou que β
1 integrinas modular selectivamente Tipo 1 receptor do factor de crescimento semelhante a insulina (IGF-IR) e de sinalização mediada por funções em AEP [10], [12]. IGF-1 também tem sido relatado para induzir a adesão e a migração em células de mieloma múltiplo humano, em parte, através da activação de β
1 integrinas [13]. Além disso, beta constitutivamente activa
1 integrinas promover fenótipo maligno nas células AEP e segmentação-los foi relatado para inibir metástase AEP [14].
IGF-1 é um polipéptido de cadeia única que, além de sua mais clássica papel endócrino, medeia crescimento autócrino ou parácrino e, portanto, atua como um crescimento potente e fator de sobrevivência. IGF-1 provoca a sua acção sobre as células ligando-se ao seu receptor, o IGF-IR. O IGF-IR é uma glicoproteína transmembranar heterotetramérica com actividade de tirosina-quinase [15]. O substrato do receptor da insulina (IRS) proteínas funcionam como proteínas de ancoragem específicos para o receptor de IGF-IR e de insulina (IR) [16]. IRS1 e IRS2 não contêm actividade de quinase intrínseca, mas sim a função através do recrutamento de proteínas para receptores, onde eles montam os complexos de sinalização de superfície. A sinalização das proteínas IRS resulta na activação de vias, incluindo fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) e activada por mitogénio proteína quinase (MAPK) [17], [18]. Curiosamente, ambos os percursos são também conhecidos por ser activado por integrina acoplamento [19], [20]. A associação entre as integrinas e IRS1 tem sido sugerido como um possível mecanismo de acção sinérgica de receptores do factor de crescimento e da matriz extracelular [21]. IGF-1 foi avaliado de sinalização a ser regulada por um mecanismo de feedback negativo através de ubiquitina /proteassoma degradação mediada de IRS2, pelo que a magnitude e a duração da resposta à insulina ou IGF-1 é regulada [22]. O nosso laboratório foi recentemente demonstrado que β
1 integrinas regulam a expressão de IGF-IR e são críticos para o realce do IGF-1 mediada por receptor de androgénio de actividade (AR) [23]. Nós também relataram que o IGF-IR firmemente regula β Expression
1 integrina nas células AEP [24], mas o mecanismo subjacente a este regulamento ainda não foi caracterizado.
Apesar do consenso limitado sobre os níveis de IGF expressão IR no epitélio da próstata benigna e maligna, vários ensaios clínicos visando o IGF-IR em tumores diferentes, incluindo AEP, estão em andamento. Identificar e compreender os efetores a jusante de IGF-IR ajudaria a definir melhor o papel funcional do eixo IGF-1 em AEP. Dada a evidência relatada de forte interação física e funcional entre β
1 integrinas e IGF-IR, este estudo investigou o mecanismo através do qual o IGF-IR regula β
1 integrinas. Relatamos uma nova via de diafonia entre o IGF-IR e β
1 integrinas, que promove a proliferação de células cancerosas, e demonstram que o IGF-IR estabiliza α
5β
1 integrina, protegendo-o da degradação do proteossoma.
Materiais e Métodos
reagentes e anticorpos
foram utilizados os seguintes reagentes. A Opti-Mem e oligofectamine (todos da Invitrogen, CA), androgénio sintético R1881 (Perkin-Elmer, CA), inibidores de proteinase (Sigma, MO), IGF-1 recombinante (R D Systems, MN), MG132 e epoxomicina (Sigma , MO). Foram utilizados os seguintes anticorpos monoclonais murinos (mAbs): para p
1 integrinas (BD Transduction Laboratories, CA), para o IGF-IR para citometria de fluxo (αIR-3, EMD, NJ); para a
2 integrina (Abcam, Cambridge, UK); para a
7 integrina (8G2, EMD, NJ). Rato mAb para CD4 foi adquirido de Santa Cruz, CA. Foram utilizados os seguintes anticorpos policlonais de coelho (PABs): a IGF-IR (IGF-IR-β sc713), a AKT e ERK1 /2 (a partir de Santa Cruz, CA); �survivina (Novus Biologicals, CO). PAb de coelho para a
3, α
4, e α
5 específico para o domínio C-terminal de cada subunidade, foram uma gentil oferta do Dr. E. Ruoslahti, Universidade da Califórnia, Santa Barbara, Sanford Instituto de Pesquisa médica -Burnham, CA. O α
6 Ab (AA6A) específico para o domínio C-terminal de α humana
6 integrina foi uma simpática oferta do Dr. Anne Cress, Universidade do Arizona, AZ. oligonucleotídeos siRNA utilizados neste relatório foram descritos antes [24].
Células
células
LNCaP e C4-2B foram adquiridos da ATCC. As células foram cultivadas a 37 ° C e 5% de CO
2 em meio RPMI-1640 suplementado com 5% de FBS e 1% cada de piruvato de sódio, aminoácidos HEPES e não essenciais. Para avaliar o efeito de agonistas, após a transfecção as células foram privadas de soro com 2% de carvão despojado-(CSS) contendo meio, durante 24 h seguida por estimulação do ligando durante mais 24 h. células PC3 foram cultivadas a 37 ° C e 5% de CO
2 em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS. PC3-CH1, CH2 e PC3-PC3-Ch β
1C células utilizadas para a expressão induzível de construções quiméricas foram descritos anteriormente [25], [26]. As células foram privadas de soro durante 24 h e tratou-se com 75 ^ M ZnSO
4 durante 6 h. A construção quimérica Ch1 contém o domínio extracelular de CD4 de murino e os domínios de transmembrana e citoplásmicos do β
integrina 1A; Ch β
construto 1C (utilizado como um controlo) é o mesmo que Ch1 excepto que β
1A região de codificação de integrina é substituído por β
1C região de codificação. constructo CH2 representa um outro controlo e transporta o domínio extracelular de CD4 de murino ligado ao domínio transmembranar do β
uma subunidade de integrina. Todas as construções são expressos sob o controlo do promotor da metalotioneína de ratinho-1 e a expressão de variantes quiméricas é induzida por adição de ZnSO
4 ao meio de crescimento.
transientes siARN transfecção
transfecção transiente de células com oligonucleótidos de ARNip foi realizada como descrito [23]. Invertido-IGF-IR siRNA tendo uma sequência alvo inversa de IGF-IR siARN serviu como controlo.
Ensaio de Proliferação de células
LNCaP e C4-2B foram transientemente transfectadas com o controlo ou IGF-IR siRNA . Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram tratadas com tripsina e analisada para a eficácia do IGF-IR e β
1 integrina regulação negativa. As células transfectadas foram contadas e re-semeadas em triplicado em placas de 6 poços a 3 x 10
4 células por poço em 2% de meio contendo CSS na presença de 1 nM R1881. células vivas foram contadas para os próximos três dias consecutivos por hemocitómetro. Imagens de células vivas foram recolhidas no dia 2 e 3, antes de serem colhidas para contagem.
Anchorage-ensaio de crescimento independente
células LNCaP foram plaqueadas e foram transfectadas, com o controlo ou IGF-IR em combinação com ARNsi quer vector sozinho, pBJ1 ou um pBJ1-β
1 construção [27]. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram tripsinizadas e plaqueadas em agar mole em placas de 6 poços a 5000 células /poço. As células foram deixadas crescer durante duas semanas e as colónias contadas. O tamanho da colónia foi medida utilizando uma ocular equipado com um retículo de medição e as colónias com o tamanho de 0,1 mm foram contadas em diferentes amostras. As colónias foram fixadas e coradas com violeta de cristal e as imagens de colónias foram capturadas por microscópio estéreo.
A imunoprecipi tacão e imunotransferência
A imunoprecipitação de células PC3 foi realizada tal como descrito anteriormente [28]. Os lisados celulares foram usadas para imunotransferência como descrito [12]. Para analisar os lisados celulares PC3 transfectadas com construções quiméricas, as células PC3-CH1 e PC3-CH2- foram transfectadas com o controlo ou IGF-IR siRNA e 24 h mais tarde, as células foram cultivadas em meio livre de soro durante 24 h seguido por tratamento com 75 uM de ZnSO
4 durante 6 h e, em seguida, colhidas para imunoblotting. A intensidade de cada banda foi avaliada por análise ImageJ e normalizada com controle de carga.
análise FACS
células PC3-CH1 e PC3-Ch2 foram tratados como acima e colhidas para análise FACS. As células foram coradas com 1 ug /ml de Ab para CD4 ou IgG de rato como controlo negativo, seguido por coloração com Ab secundário conjugado com FITC. perfis de expressão foram adquiridos utilizando instrumento FACS Calibur (BD) e os dados foram analisados por software FlowJo (Árvore Star Inc., OR).
proteossómica ensaio de inibição
células LNCaP foram transfectadas com o controle ou IGF -IR siRNA e 24 h mais tarde, as células foram privadas em 2% de meio contendo CSS durante 24 h. As células foram tratadas com 1 nM R1881 com ou sem 10 uM MG132 durante 6 h. PC3-2 células foram transf ectadas da mesma maneira como as células LNCaP e 24 h após a transfecção tratadas com 10? M MG132 para 6 ou 24 h, e analisadas por imunotransferência. Para a inibição específica da função do proteassoma usando epoxomicina, as células LNCaP foram transfectadas tal como acima, fome com 2% de meio contendo CSS durante 24 h, seguido por tratamento com 1 nM R1881 em conjunto com 0, 100, 250 ou 500 nM de epoxomicina durante 18 h e colhida. Os lisados foram analisados por imunotransf erência. intensidades de banda relativas de β
1 integrina
subunidades
quantitativa PCR em tempo real
em tempo real A análise de PCR foi realizada como descrito anteriormente [23]. Cada reacção foi realizada, pelo menos em triplicado; desvios-padrão e significância foram calculados utilizando o software Excel (Microsoft). As sequências dos oligonucleótidos utilizados são como se segue: β
1 integrina, (sentido: CTCAAGCCAGAGGATATTAC, anti-sentido: TCATTGAGTAAGACAGGTCC), IGF-IR, sentido: AATGAGTGCTGCCACCCCGA, anti-sentido: ACACAGCGCCAGCCCTCAAA), GAPDH, (sentido: GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT, anti-sentido: GTTCTCAGCCTTGACGGTGC) , β-actina, (sentido: TCCATCATGAAGTGTGACGT, antisense: GGAGGAGCAATGATCTTGAT).
A análise estatística
A significância estatística (valor de P e t-teste) entre conjuntos de dados foi calculada usando o software Excel (Microsoft). Um valor de P nos dois lados da ≤0.02 foi considerado estatisticamente significativo. Os resultados foram plotados em um gráfico usando 4,5 software DeltaGraph (Rockware).
Resultados
Perda de IGF-IR e β
1 integrinas inibe a proliferação de células AEP
Foi anteriormente demonstrado que β
1 integrinas são cruciais para a proliferação celular ancer C de IGF-IR mediada por [10]. Desde IGF-IR regula rigidamente β
expressão 1 integrina, foi avaliado o efeito direto da depleção de IGF-IR na proliferação celular. células LNCaP e C4-2B foram transitoriamente empobrecido de IGF-IR e re-plaqueadas em 2% de meio contendo CSS na presença de 1 nM de androgénio sintético (R1881). Perda de IGF-IR notavelmente inibe a proliferação celular em ambas as linhas celulares (
* P 0,02) (Figura 1A, os painéis de topo.). expressão reduzida de IGF-IR e β
1 integrina subunidades para ambas as linhas de células foi confirmada por imunotransferência (Fig. 1A, os painéis inferiores). R1881 foi utilizado para reforçar os níveis de IGF-IR e β
1 de expressão e para aumentar os efeitos destes receptores na proliferação. Foram também observados efeitos significativos sobre a proliferação das células na ausência de R1881 em LNCaP e células C4-2B após a depleção de IGF-IR (dados não mostrados). densidade celular reduzida em condições de cultura é claramente observada na análise de células C4-2B com sub
1 os níveis de IGF-IR e p reduzidos em comparação com células com expressão endógena de ambos os receptores (Fig. 1B). Imagens representativas densidade de células de ensaios de dia 2 e dia 3 de proliferação são mostrados. Estes dados mostram que o IGF-IR e β
1 integrinas são essenciais para a proliferação de células de AEP.
células LNCaP e C4-2B (A) foram transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi de RI-FCI e 24 h mais tarde, as células foram tripsinizadas e contadas. As células foram novamente plaqueadas em triplicado em 3 × 10
5 células por poço em placas de 6 poços, com 2% de meio contendo CSS na presença de 1 nM R1881, colhidas e contadas no dia 1, 2 e 3 após a re-plaqueamento . Cada ensaio experimental foi realizada em triplicado e as barras de erro representam o desvio padrão de três valores independentes (
* P 0,01), em relação aos respectivos tratamentos ARNsi de controlo. Um conjunto paralelo de lisados celulares de LNCaP e C4-2B foi analisada para a eficiência de IGF-IR e β
1 integrina subunidade regulação negativa por imunotransferência (painéis inferiores). (B) Imagens representativas de densidades celulares C4-2B relativos no dia 2 e dia 3 são mostrados.
expressão exógena da β
1 subunidade integrina restaura o crescimento independente de ancoragem prejudicada da AEP células sobre regulação baixa IGF-IR
os resultados que o IGF-IR regula β
1 a expressão da integrina e que a revogação de IGF-IR comprometeu o crescimento das células cancerosas, nos levou a investigar se β
1 integrinas desempenham um papel na regulação do crescimento do IGF-IR mediada. A fim de determinar se β expressão
1 integrina iria inverter a inibição do crescimento independente de ancoragem induzida por depleção de IGF-IR, as células LNCaP foram transfectadas com IGF-IR siRNA, com ou sem β ADNc
1 de integrina, e permitiu a crescer e formam colônias em soft-agar durante duas semanas. depleção de IGF-IR reduz significativamente o crescimento de colónias em ágar mole (
** P 0,01) (Fig. 2). expressão exógena da β
uma subunidade no entanto, alivia parcialmente a supressão do crescimento induzida por knockdown IGF-IR conforme medido pelo número de colónias com o tamanho ≥100 uM (
* P 0,02). Imagens representativas de colónias vivas foram capturados sobre um microscópio invertido e são mostrados no painel inferior (Fig. 2). Esses dados enfatizam o papel de β
1 integrinas na regulação do crescimento do IGF-IR mediada em células de AEP.
células LNCaP foram co-transfectadas quer com controlo ou IGF-IR siRNA e quer com o pBJ1 -β
1 construção ou a pBJ1 controle de vetores. As células foram plaqueadas em soft-agar e deixadas a crescer durante 2 semanas. O tamanho das colónias foi medida usando um microscópio invertido equipado com uma ocular contendo um retículo de 25 mm e colónias com o tamanho total de ≥100 uM foram contadas. Os números mostrados no gráfico representam as contagens médias de três amostras independentes (
* P 0,02;
** P 0,001). Imagens representativas de colónias vivas reflectindo a variação no tamanho das colónias, com ou sem β exógeno
1 estão apresentados nos painéis inferiores. As barras de medição representam um tamanho de 100 mm.
regulação IGF-IR de β
1 a expressão da integrina não ocorre no nível do mRNA
efeito cooperativo desses receptores em o crescimento de células de cancro levou-nos a investigar o mecanismo pelo qual o IGF-IR regula β
1 expressão. Demonstrámos anteriormente que o IGF-IR regula a expressão de β
1 subunidades de integrina nas células de AEP [24]. Esta regulação pode ocorrer na transcrição, pós-transcrição, translação ou níveis pós-traducionais. regulação de ARNm de β
1 integrinas pelo IGF-IR foi analisada em células LNCaP pela redução da expressão de IGF-IR por interferência de ARN, seguido de tratamento com R1881 e /ou IGF-1. análises em tempo real de transcritos de ARNm indicam que o ARNm de IGF-IR induzida é de 8 vezes após R1881 e 2,5 vezes sobre o IGF-1 de tratamento (Fig. 3). No entanto, não houve mudanças significativas em β
1 níveis de mRNA integrina são detectados após ambos os tratamentos. Depleção de IGF-IR expressão resulta em redução de quatro vezes de ARNm de IGF-IR após tratamentos de ligandos. Os dados indicam que os níveis de transcrição β
1 integrina não altere significativamente sobre knockdown IGF-IR. Análise do perfil de expressão GAPDH nesta experiência serviu como um controlo de referência adicional. Os resultados indicam claramente que o IGF-IR não regula p
1 subunidades de integrina ao nível do ARNm.
células LNCaP foram transfectadas quer com controlo ou IGF-IR siARN. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram cultivadas em meio contendo 2% de CSS durante mais 24 h e tratou-se com um veículo, 1 nM R1881 ou 100 ng ml de IGF-1 /durante mais 24 h. ARN isolado a partir destas células foi avaliado para níveis de transcritos de IGF-IR, β
1 integrina e GAPDH utilizando PCR em tempo real quantitativa. Expressão valores foram normalizados em relação aos níveis de transcrição de β-actina e os dados são apresentados como a expressão relativa. Cada reacção foi realizada em triplicado e erro barras representam o desvio padrão (
* P 0,01) em relação a amostras não tratadas
expressão indutível de CD4-β
1A integrina quimera citoplasmática de domínio faz. não proteger o β endógena
1 integrina subunidade de degradação induzida por IGF-IR depleção
Para investigar se a expressão exógena do domínio citoplasmático de β
1A altera regulação de IGF-IR mediada por endógeno β
1 subunidades de integrina, construções quiméricas constituídas por transmembranar e domínio citoplasmático de β
foram usadas integrina 1A com CD4 domínio extracelular (CH1). O domínio citoplasmático da β
uma subunidade existe em cinco formas de splicing diferentes; a forma mais amplamente expresso no cancro, β
1A, regula β
uma localização, proliferação e migração celular [2]. Especulamos que a ligação do domínio citoplasmático de β
1 integrinas para o IGF-IR iria conduzir a alguma competição para a ligação de IGF-IR a diferentes formas de β
1 e resultar em uma β
1 protectora efeito em condições de IGF-IR esgotados. Expressão da quimera Ch1 (células CH1), ou CH2 quimera, que corresponde ao domínio de transmembrana de β
1 mais o domínio extracelular de CD4 (células CH2), em células PC3 foi induzida por ZnSO
4 de tratamento. depleção de IGF-IR em células transfectadas de forma estável foi confirmada por imunotransferência de análise (Fig. 4A, painel superior esquerdo). Indução da β citoplasmática
variante 1 foi confirmada por FACS (Fig. 4A, os painéis inferiores). Após a indução, seria de esperar que o IGF-IR para redistribuir e se ligam a ambos o β endógena
1 e variante citoplasmática exógeno. indução exógena da β
1 domínio citoplasmático, no entanto, não altera a regulação IGF-IR mediada por β endógena
1 níveis integrina (Fig 4A, painel superior direito). A fim de investigar se o β
1A variante citoplasmática interage fisicamente com o IGF-IR, a imunoprecipitação de CD4 em PC3-CH1 e β PC3-Ch
1C células (transf ectadas de forma estável com o domínio citoplasmático de β
1C integrina mais o domínio extracelular de CD4 [29]) foi realizada após a incubação das células com ZnSO
4. Os shows immunoblot (painel superior) a presença de IGF-IR no ligado celular, mas não em amostras CD4 imunoprecipitadas. O painel inferior mostra que CD4 foi eficientemente imunoprecipitado; uma banda irrelevante foi também detectada nas amostras IgG imunoprecipitadas. Os dados indicam que o domínio citoplasmático da β
variante 1A integrina não interagir com o IGF-IR (Fig. 4B).
(A) PC3-Ch1 (expressando domínio extracelular de CD4 de murino e a domínios transmembranar e citoplasmático de β
1) e de controlo de células PC3-CH 2 (que expressam o domínio extracelular de CD4 de murino ligado ao domínio transmembranar do β
1) foram transfectadas quer com controlo ou IGF-IR siARN. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram colhidas para avaliar a eficiência do knockdown de IGF-IR (painéis superior esquerdo). células PC3-CH1 e PC3-CH2- foram deixados em jejum em meio isento de soro durante 24 h, e quando indicado, induzida com 75 uM de ZnSO
4 durante mais 6 h para promover a expressão de proteínas quiméricas. As células foram colhidas para análise de β
1 expressão subunidade (painéis superiores à direita). Um conjunto paralelo de amostras foi processado para confirmar a expressão indutível das quimeras por análise FACS utilizando um Ab de CD4 (painéis inferiores). 10.000 células em cada amostra foram obtidos e os dados estão apresentados os histogramas com o eixo x que representa a expressão de CD4 média relativa e o eixo dos y representa o número de células. (B) PC3-CH1 e PC3-Chβ
1C (células de controlo que expressam domínio extracelular de CD4 de murino e os domínios transmembranar e citoplasmático da β
1C) incubadas com 75 uM de ZnSO
4 para induzir a expressão do domínio citoplasmático de β
1A ou β
1C sub integrinas, respectivamente. Os lisados foram imunoprecipitados com IgG de controlo ou Ab contra domínios CD4 quiméricos. Os imunocomplexos foram analisados para a expressão de IGF-IR por imunotransferência. Os lisados foram de entrada ser executado como controlos.
degradação aumentada proteossómica de β
1 subunidades de integrina, na ausência de IGF-IR
Depois de demonstrar que o IGF-IR não regula β
1 integrina transcrições, procurou-se determinar se o regulamento de β
1 níveis integrina IGF-IR mediada iria ocorrer em nível de pós-translacional. depleção de transientes de IGF-IR nas células LNCaP foi seguido por tratamento R1881 sozinha ou em combinação com um inibidor de proteassoma, MG132, durante 6 h. R1881 foi utilizado para reforçar os níveis basais de expressão de IGF-IR e β
uma subunidade de integrina, como relatado anteriormente pelo nosso grupo [23] e os lisados celulares foram analisados. A redução dos níveis β
1 integrina induzidas pela depleção IGF-IR foi abolida após tratamento com células com este inibidor do proteassoma (Fig. 5A). Os resultados desta experiência foram confirmados em células PC3, após transfecção com qualquer um ARNsi de controlo ou ARNsi de IGF-IR, seguido por tratamento com MG132 para 6 ou 24 h (Fig. 5B). Nós adicionalmente corroborado estes resultados usando doses diferentes de epoxomicina, outro inibidor de proteassoma altamente específica [30]. As células LNCaP foram transfectadas quer com controlo ou IGF-IR siRNA como anteriormente e tratados com concentrações crescentes de epoxomicina. β
1 subunidades integrina estão presentes em qualquer precursor ou formas maduras (110 e 130 kD, respectivamente) e ambos são reprimidos após a perda IGF-IR. Os dados mostram que epoxomicina bloqueia a degradação da forma madura do β
1 subunidade integrina (Fig. 5C). O β madura
1 receptor sozinho parece seguir a degradação proteossómica após a internalização. A forma de precursor de β
1 (110 kD), que precisa de modificações pós-tradução mais de sofrerem maturação não é recuperado por inibição proteossoma. Os dados mostram que o IGF-IR estabiliza expressão β subunidade
1 integrina, inibindo o seu degradação proteossómica. Células LNCaP
(A) foram transfectadas quer com controlo ou IGF-IR siARN. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram cultivadas em meio contendo 2% de CSS durante mais 24 h e tratou-se com um veículo, 1 nM R1881 e /ou 10 fiM MG132 durante 6 h. Os lisados celulares foram analisados quanto à expressão de β
uma subunidade de integrina e de IGF-IR por imunotransferência. AKT foi utilizado como um controlo de carga. As intensidades de banda da β
subunidade de integrina 1 foram quantificados por análise ImageJ e normalizados com os de AKT como um controlo de carregamento. Os valores de intensidade relativa são expressos como percentagem da amostra de controlo transfectadas com ARNsi de controlo sozinho. (B) As células PC3 foram transfectadas quer com controlo ou IGF-IR siARN. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram tratadas com 10? M MG132 para 6 ou 24 horas em meio RPMI contendo 10% de soro. Os lisados celulares foram analisados quanto à expressão de β
uma subunidade de integrina e de IGF-IR por imunotransferência. AKT foi utilizado como um controlo de carga. β
1 subunidades de integrina foram quantificados por ImageJ como acima e os valores normalizados com os de controlo de carga de AKT. Os valores de intensidade relativa β
1 são expressos como percentagem da amostra de controlo transfectadas com ARNsi de controlo sozinho. células LNCaP (C) foram transfectadas tal como acima e 24 h mais tarde as células foram cultivadas em meio contendo 2% de CSS durante mais 24 h, seguido de tratamento com 0, 100, 250 ou 500 nM de epoxomicina em combinação com 1 nM de R1881 durante 18 h. Os lisados celulares foram analisados quanto a formas maduras e precursoras de β
uma subunidade de integrina e de IGF-IR por imunotransferência. AKT serve como um controlo de carga. intensidades de banda relativas de β madura
1 integrina foram determinados por análise ImageJ como acima.
Análise de α subunidades de integrina sobre a regulação negativa de IGF-IR
As integrinas são heterodímeros constituídos por α e p subunidades. Existem 24 possíveis heterodímeros com a capacidade para activar as vias de sinalização específicas [19]. β
1 integrinas, entre outras subunidades, são conhecidos para heterodimerizar com α2, α3, α4, α5, α6 e a7 subunidades de integrina, que são expressos em células LNCaP. Uma vez que a redução de níveis de expressão de IGF-IR leva à regulação negativa do β
uma subunidade de integrina, decidimos determinar qual subunidade de integrina foi afectada pela regulação negativa de IGF-IR. Nós demonstrar uma redução significativa da subunidade de integrina α5 em conjunto com diminuição de IGF-IR e p
1 níveis (Fig. 6). Nenhuma mudança foi detectada nos níveis de outros parceiros heterodiméricas integrina alfa de expressão (Fig. 6 e dados não mostrados). Estes resultados são consistentes com as nossas observações anteriores em células PC3, onde revogação de β
1 integrinas por shRNA levou a uma redução significativa na expressão de superfície de subunidade de integrina α5 [3]. Os nossos dados demonstram que o complexo principal regulada por IGF-IR é α5β
1 integrina.
células LNCaP foram transfectadas quer com controlo ou IGF-IR siRNA e tratada com 2% de meio contendo CSS durante 24 h seguido por tratamento com 1 nM de R1881 durante 24 h. IGF-IR e integrina β1 downregulation foi avaliada por imunocolorações. Os lisados foram então analisadas quanto à expressão de várias sub-unidades a de integrina. Abs específicos contra α
2, α
4, α
5, α
6 e α
7 subunidades de integrina foram usadas para identificar o parceiro α integrina da β
1 integrina subunidade, que é regulada negativamente sobre a depleção de IGF-IR.
Discussão
Este estudo descreve uma nova observação de que funções de IGF-IR em células AEP são parcialmente mediadas por β
1 integrinas. Para dissecar o mecanismo pelo qual o IGF-IR regula β
expressão da integrina 1, que demonstram que o IGF-IR Melhora β
1 integrina estabilidade, reduzindo a sua degradação proteossoma. Mostramos também que a α
5 integrina subunidade associado a β
1 é seletivamente reprimidos após a perda IGF-IR.
Os dados epidemiológicos e pré-clínicos substanciais identificaram a via IGF-IR como um importante regulador de biologia de células tumorais. Os resultados decepcionantes, no entanto, a partir de vários estudos clínicos com o objectivo de inibir o IGF-IR, o que levou os pesquisadores estão a desenvolver biomarcadores preditivos para melhorar a selecção de pacientes que beneficiariam de terapias dirigidas IGF-IR. Além disso, uma compreensão mais clara dos proporções relativas dos complexos de IGF-IR e IR em tumores é necessário.