Abstract

Fundo

Um ligante indutor de proliferação (APRIL) é um membro do tumor factor de necrose (TNF) dos super-família. Ele liga-se aos seus receptores específicos e está envolvido em vários processos durante a tumorigénese e células de tumor a proliferação. Elevados níveis de expressão abril estão intimamente correlacionados com o crescimento, metástase, e 5-FU resistência aos medicamentos de cancro colo-rectal. O objectivo deste estudo era identificar um péptido específico abril de ligação (BP) capaz de bloquear a actividade de Abril, que poderia ser usado como um potencial tratamento para o cancro colorectal.

Métodos

Uma biblioteca de apresentação de fagos foi utilizada para identificar péptidos que se ligam seletivamente a abril humana recombinante solúvel (sAPRIL). Os péptidos com maior afinidade de ligação para sAPRIL foram identificados utilizando ELISA. Os efeitos de sAPRIL-PA sobre a proliferação de células e ciclo celular /apoptose

in vitro

foram avaliados utilizando o ensaio CCK-8 e citometria de fluxo, respectivamente. Um

in vivo

modelo do rato do cancro colorectal foi utilizado para determinar a eficácia anti-tumor do sAPRIL-BP.

Resultados

Três péptidos candidatos foram caracterizados de oito fago Os clones com elevada afinidade de ligação para sAPRIL. O péptido com a afinidade mais elevada foi seleccionado para posterior caracterização. O identificada sAPRIL-BP suprimiu a proliferação de células tumorais e a progressão do ciclo celular em células LOVO de uma forma dependente da dose.

In vivo

em um modelo de desafio rato colorectal, o sAPRIL-BP reduziu o crescimento de xenoenxertos de tumor em ratinhos nus inibindo a proliferação e induzir a apoptose intratumoral. Além disso, em um

in vivo

metástase modelo, sAPRIL-BP reduziu metástase hepática de células de câncer colorretal

Conclusões

crescimento do tumor significativamente suprimida.

sAPRIL-BP

em vitro

e

in vivo

e pode ser um candidato para o tratamento de câncer colorretal que expressam níveis elevados de abril

Citation:. Ele Xq, Guan J, Liu F, Li J, Ele Sr. (2015) Identificação do sAPRIL Binding Peptide e seus efeitos de inibição de crescimento nas células do câncer colorretal. PLoS ONE 10 (3): e0120564. doi: 10.1371 /journal.pone.0120564

Editor do Academic: Chih-Pin Chuu, Institutos Nacionais de Pesquisa em Saúde, TAIWAN

Recebido: 01 de agosto de 2014; Aceito: 05 de fevereiro de 2015; Publicação: 31 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 He et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:.. Este trabalho foi apoiado pelo objecto do Guangzhou Ciência e Tecnologia projectos planeados (2012J4300091)

Conflito de interesses: os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

o câncer colorretal é um dos cancros digestivos mais comuns em todo o mundo e os pacientes geralmente morrem de metástases de células de câncer [1]. A quimioterapia tradicional tem desvantagens, incluindo, diferentes graus de citotoxicidade celular e efeitos alvo fora que podem danificar os tecidos saudáveis, estes efeitos secundários têm um impacto negativo na qualidade de vida do paciente. É crucial para desenvolver uma terapia de câncer alvo que tem baixa toxicidade e é altamente seletivo para melhorar a taxa de prognóstico e sobrevida de pacientes com câncer colorretal.

A Proliferação Indutor Ligand (APRIL) é um ligando na necrose tumoral (TNF) superfamília que funciona como um factor solúvel [2]. APRIL está expresso principalmente por células hematopoiéticas e tem funções biológicas em sobrevivência de células B e a activação de células T [3-5]. tecidos normais expressam nível muito baixo de abril no entanto, linhas celulares de cancro e tumores, como o cancro digestivo, neoplasias hematológicas e câncer urotelial, expressam níveis elevados de Abril [6-9]. APRIL está envolvido em vários processos relacionados com a tumorigénese, tais como promover a proliferação de células tumorais e sobrevivência em vários tipos de cancro [10-14]. No cancro colorectal, elevada expressão de APRIL está estreitamente correlacionada com o crescimento de tumores, metástases, e 5-fluorouridina (5-FU) a resistência [12, 13, 15].

abril exerce as suas funções biológicas interagindo com várias receptores. receptores ABRIL conhecidos inclui antígeno B maturação das células (BCMA), activador transmembrana e ligando ciclofilina interator (TACI) e proteoglicanos de sulfato de heparina (HSPGs) [7, 16]. BCMA é principalmente expresso em linfócitos B maduros [17], mas também é altamente expresso em células de mieloma múltiplo [18]. TACI é expresso principalmente nas células B e células plasmáticas maduras [19], e HSPGs são amplamente expressa na superfície de muitas células de mamífero [20]. Após a ligação a estes receptores, abril aumenta a proliferação, ou suprime a apoptose para promover a progressão do tumor através de múltiplos mecanismos moleculares. Em células B de leucemia linfocítica crónica (LLC-B), abril solúvel estimula a activação NF-μB, e protege as células B-CLL de apoptose espontânea ou induzida por drogas [21]. Em células B de linfoma não-Hodgkin (NHL), abril recombinante activa NF- μB, regula positivamente as proteínas anti-apoptóticos Bcl-2 e Bcl-XL e diminui a expressão da proteína pró-apototic Bax para inibir a apoptose [14]. Em células de glioma, a expressão ectópica de abril confere protecção contra a apoptose ligando morte /mediada por receptor, possivelmente por regulação positiva inibidor anti-apoptótica de proteínas X-ligada da proteína apoptose (XIAP) [22]. No mieloma múltiplo, APRIL promove a progressão do ciclo celular, aumentando a fase S e G

2-M fase [23]. Em células de câncer colorretal humanos, derrubando abril usando blocos de interferência RNA fator transformador de crescimento (TGF) -μ1 sinalização e activação de quinases reguladas por sinais extracelulares (ERK) para induzir a paragem do ciclo celular e apoptose [24].

Segmentação abril para suprimir o crescimento do tumor, proliferação e sobrevivência pode ser uma estratégia viável para o tratamento do cancro colo-rectal. Outros mostraram que o silenciamento abril reduz a proliferação de células tumorais e metástases no cancro colo-rectal [25-27]. Nós mostramos anteriormente que a regulação negativa de abril reduz a proliferação, aumenta a apoptose, e aumenta a sensibilidade para a quimioterapia 5-FU na linha celular LOVO colorrectal, que expressa elevados níveis de abril [28]. Gao

et al

. temos desenvolvido com sucesso um anticorpo monoclonal anti-APRIL e demonstrou o seu efeito anti-proliferativo

in vitro

e

in vivo

[29]. Outros grupos foram utilizados receptores sAPRIL recombinantes ou sAPRIL mutante para competir com sAPRIL endógena pela ligação aos seus receptores [30, 31]. Em comparação com outras estratégias de direccionamento abril, tais como siRNA ou anticorpos anti-APRIL, os polipéptidos possuem várias vantagens, incluindo a baixa imunogenicidade, um elevado grau de segurança, facilidade de síntese e purificação, a capacidade de penetrar no tecido e órgãos, e menor toxicidade. Identificar e sintetizar polipeptídeos anti-tumorais tornou-se uma estratégia popular para o desenvolvimento direcionados terapias anti-câncer [32, 33]. No entanto, não há polipéptidos específicos APRIL foram relatadas até à data. Portanto, o objetivo deste estudo foi identificar sAPRIL específica péptidos de ligação usando uma biblioteca de apresentação de fagos, e avaliar a sua

in vitro

In vivo

efeitos anti-câncer

e fornecer um candidato terapêutico para uso contra câncer colorretal que expressam níveis elevados de abril

Materiais e Métodos

In vitro panning

sAPRIL recombinante humana (R D, EUA). foi utilizado como a proteína alvo para o rastreio de uma biblioteca de apresentação de fagos de 12 péptido de acordo com o protocolo do fabricante (NEB, EUA). Em resumo, os fagos a partir da biblioteca foram adicionados placas de ELISA sAPRIL-revestidas e incubaram-se à temperatura ambiente durante 60 min. Os fagos não ligados foram removidos por lavagem com TBST (TBS + 0,1% [v /v] de Tween-20). Subsequentemente, os fagos ligados foram lavados com glicina-HCl (pH 2,0) e amplificado. Os fagos com afinidade de ligação para sAPRIL foram colhidas após quatro rodadas de ligação /amplificação. Exceto a primeira rodada, o tampão de lavagem para remover os fagos não ligados foi TBST (TBS + 0,5% [v /v] Tween-20).

Seleção de clone positivo por ELISA

Vinte única as colónias foram recolhidas a partir do último ciclo de prospecção e incubadas com o

e

.

coli ER2738

estirpe hospedeira durante 4,5 h a 37 ° C com agitação. Uma placa de ELISA sAPRIL-revestidos foi bloqueada com albumina de soro bovino a 5% (BSA) durante a noite e, em seguida, o sobrenadante de uma suspensão única colónia de fagos foi adicionado durante 1 h. Para detectar fagos ligados, uma peroxidase de rábano (HRP) marcado com anticorpo anti-M13 (GE Healthcare, EUA) foi adicionado durante 1 h, seguido de tetrametilbenzidina (TMB) durante 10 minutos, e, em seguida, a reacção foi interrompida com um H

2SO

4 solução. Colónias com um A

450 que foi pelo menos 6 vezes maior do que o controlo positivo foram considerados positivos para a ligação sAPRIL.

A análise da sequência de clones positivos seleccionados e síntese de peptídeos

As sequências de os clones positivos foram analisados ​​e traduzida em sequências de aminoácidos, e os péptidos correspondentes foram sintetizados e purificados (Hangzhou chinês Peptide Company). Os péptidos de ligação sAPRIL foram então testados quanto à sua afinidade para o TNF e sAPRIL BAFF membro da superfamília por ELISA. O peptídeo que teve a maior actividade de ligação para sAPRIL foi escolhido para experiências de acompanhamento.

cultura celular

As linhas celulares de cancro do cólon colorretais SW620, LOVO, HCT116, HT29, e SW480 foram adquiridos a partir de ATCC. Todas as linhas celulares foram cultivadas em RPMI-1640 com FBS a 10%, e 100 KU /L de penicilina estreptomicina a 37 ° C com 5% de CO

2.

In vivo modelo

Todos os estudos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais, e aprovado pelo Comitê Animal Care e Uso a Hospital Nanfang. BALB ratinhos nus /c (4-6 semanas de idade) foram adquiridos a partir de Guangdong Laboratório de Medicina Animal Center e mantido sob condições gnotobióticos. Células LOVO (2 × 10

6 células em 100 ul de PBS) foram injectadas subcutaneamente (100 ul /injecção; um local de injecção /tumor) e o tamanho do tumor foi medido a cada 3 dias. Após 3 semanas, o nódulo subcutâneo foi considerado um tumor quando atingiu 100-200 mm

3. Os ratinhos foram divididos em três grupos e injectados intratumoralmente com PBS (controlo), 20 mg /kg sAPRIL-BP (dose baixa), ou 40 mg /kg sAPRIL-BP (dose elevada) de dois em dois dias, durante duas semanas. O volume do tumor (V) foi calculada utilizando a fórmula: V = AB

2/2, em que A é o diâmetro máximo, e B é o diâmetro perpendicular à linha de A.

Para a colorrectal modelo de metástases do cancro do fígado, células LOVO (2×10

6 células /100 uL) foram injectadas no baço após laparotomia. Três semanas após a injecção, os murganhos foram randomizados para 3 grupos (n = 5) e injectados intraperitonealmente com PBS (200 mL) como um controlo, a baixa dose de sAPRIL-PA (20 mg /kg), ou a dose elevada de sAPRIL- BP (40 mg /kg) nos dias 22, 24, 26, 30, 32, e injeção de 34 pós tumor. Os ratinhos foram sacrificados no dia 35. Os fígados foram recolhidos e determinou-se o número e tamanho dos nódulos metastáticos.

transcriptase reversa de reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR)

ARN a partir da célula do cancro colo-rectal linhas foi extraída com Trizol (Invitrogen, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. ARN de cada amostra foi utilizada para a síntese de ADNc, utilizando RevertAID Kit (Fermentas, Canadá). O PCR foi realizado utilizando PCR pré-mistura (SBS Genetech, China). As sequências dos iniciadores para abril foram: para a frente 5′-AGAAGAAGCAGCACTCTGTC-3 ‘e reverso 5′-CCATGTGGAGAGAGGTTAAG-3′ (produto de 394 pb). GAPDH foi usada como um controlo interno. Os iniciadores GAPDH foram: para a frente 5’-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3 ‘e inverso 5′-AGGGTCTACATGGCAACTG-3’ (produto de 240 pb). As condições da reacção PCR foram: 95 ° C durante 3 min, 94 ° C durante 50 s, 58 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 1 min, durante 32 ciclos, seguido de extensão a 72 ° C durante 7 min. Os produtos de PCR foram separados usando electroforese em gel de agarose e visualizadas com radiação UV.

Western Blotting

Western blotting foi realizado de acordo com protocolos padrão. Os anticorpos usados ​​foram abril, ciclina D1, ciclina A, ciclina E, ciclina B1, CDK4, CDK6, p53, p27, e p16 (1: 1000, Abcam, EUA) e de coelho anti-GAPDH (1: 2000, ZSGB- BIO, China).

proliferação celular ensaio

células LOVO e SW620 foram semeadas em placas de cultura de 96 poços (2 × 10

3 células /poço) num volume de 200 ul durante a noite . Cinco doses de péptido de ligação sAPRIL recombinante (5 | iM, 10 uM, 20 uM, 40 uM e 80 uM) foram adicionadas durante 24 h, 48 h e 72 h. A proliferação celular foi determinada utilizando o kit de CCK-8 (Beyotime Instituto de Biotecnologia, China) de acordo com as instruções do fabricante.

ciclo celular e apoptose análise

células LOVO foram semeadas em placas de cultura de 6 poços placas (1 × 10

5 células /poço /ml). Após 24 h, o péptido (20 pM ou 40 pM) de ligação sAPRIL foi adicionado durante um adicional de 48 h. Para a análise do ciclo celular por citometria de fluxo (BD LSR citómetro de fluxo, BD Biosciences, EUA), as células foram recolhidas e fixadas com 7% de etanol durante 24 h a 4 ° C. Após lavagem com PBS, as células foram coradas com iodeto de propídio (PI) solução (50 ug /mL de PI, 100 ug /ml de ARNase A, 0,2% de Triton X-100) durante 30 min a 4 ° C. Os dados foram analisados ​​usando o software Modfit LT. Para a análise da apoptose por citometria de fluxo, as células colhidas foram coradas com um kit de detecção de apoptose (Beyotime, China) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram coradas com 500 ul de tampão de ligação, 5 uL de anexina V-FITC, e 5 mL de PI para 5-15 min à temperatura ambiente no escuro.

coloração imuno-histoquímica

Todos os tumores de xenoenxerto foram fixadas com formalina a 10% e parafina-embedded para seccionamento. Para a recuperação de antigénio, as secções de tecido foram colocados num tampão 0,01 M de citrato a pH 6,0 e depois aquecida a 98 ° C a 100 durante 15 min num forno de microondas. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação das secções em peróxido de hidrogénio a 3% (em metanol fresco) durante 15 min à temperatura ambiente. Em seguida, as secções de tecido foram coradas com anticorpos primários específicos para o Ki-67 (1: 100, Abcam, EUA) e caspase-3 (1: 200, a CST, EUA). Um anticorpo de coelho conjugado com IgG anti-ratinho secundário (1: 200, Abcam, EUA) foi utilizado. A coloração positiva foi visualizada com DAB. As imagens foram capturadas usando um microscópio óptico Olympus BX41. A percentagem de células tumorais Ki67-positivas (índice proliferativo) e a percentagem de células de tumor a caspase-3 clivada-positiva (índice de apoptose) foram determinados para três campos separados contendo, pelo menos, 1000 células adjacentes para cada lâmina.

estatísticas

Todos os resultados foram analisados ​​com SPSS versão de software 17.0. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (SD) salvo indicação em contrário. A significância estatística foi avaliada utilizando uma ANOVA one-way ou bicaudal teste t. A diferença entre os grupos foi considerado significativo quando

p

. 0,05

Resultados

Identificação de ligação sAPRIL específico peptídeo

A biblioteca de fagos foi usada identificar 20 clones individuais que expressam péptidos que se ligam potenciais sAPRIL. Os clones foram selecionados aleatoriamente após quatro rondas de panning. Oito clones individuais foram identificados como “positiva” que indica uma elevada afinidade de ligação (definida como uma DO ≥6 vezes o OD do controlo positivo) para sAPRIL por ELISA (Fig 1A). Os oito clones representados três sequências de ADN que correspondem às seguintes polipéptidos de ligação (BP): AAAPLAQPHMWA, SSTTTSDKYLSA, e SNLHDNNTEKNV (Tabela 1). A afinidade para sAPRIL foi medida para cada polipéptido por ELISA e comparados com um polipéptido não relacionado (HWDPFSLSAYFP) como um controlo negativo. Os três péptidos identificados utilizando a biblioteca de fagos tinham afinidades de ligação sAPRIL que eram 13,7, 10,8, e 9,3 vezes maior do que o péptido de controlo, respectivamente (Figura 1B). A afinidade de ligação do sAPRIL-BPs foi também testado contra a outra TNF ligando FABF superfamília (factor de activação das células B da família TNF). As afinidades de ligação para cada sAPRIL-BP foram de 1,2, 1,1, e 0,9, respectivamente (Figura 1B). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o sAPRIL-BP liga especificamente a APRIL e não reagem de forma cruzada com BAFF. sAPRIL-BP1 (AAAPLAQPHMWA) teve a maior afinidade de ligação e posteriormente foi utilizado

in vitro

para avaliar se ele foi capaz de inibir sAPRIL obrigatório em linha colorectal humana fixo de células de câncer células LOVO (Fig 1C). sAPRIL-BP1 mostraram um efeito inibitório dependente da dose sobre sAPRIL ligação às células LOVO. Portanto, sAPRIL-BP1 (daqui em diante sAPRIL-BP) foi escolhido para caracterização funcional adicional.

(A) A afinidade de ligação dos clones de fagos No.1-20 para sAPRIL foram determinados por ELISA. O clone 21 foi usada como um controlo positivo. A mudança de dobragem da densidade óptica foi normalizada para o controlo positivo. Clones que tinham pelo menos um de 6 vezes maior afinidade do que o controlo positivo foi considerado “positivo” para a ligação sAPRIL. (B) três péptidos de ligação foram sintetizados e a sua afinidade de ligação com sAPRIL (barras pretas) foi determinada e comparada com o controlo negativo (CN) utilizando ELISA. A reactividade cruzada foi avaliada através da medição da afinidade de ligação a BAFF (barras cinzentas). (C) Clone BP1 (sAPRIL-BP) foi misturado com sAPRIL em doses diferentes para competir pela ligação com células LOVO fixos.

Os efeitos anti-proliferativa de péptidos de ligação sAPRIL em células LOVO

Para avaliar o papel de abril no cancro colorectal, expressão abril foi examinado em cinco linhas humanos colorretais celulares por RT-PCR (Fig 2A e 2B) e western blot (Fig 2C e 2D). A HCT116 e linhas de células LOVO tinham níveis significativamente mais elevados de ARNm de APRIL (

P

0,05) e proteína (

P

0,05) do que as linhas de células SW480, SW620, HT29 e. Portanto, o efeito de sAPRIL-BP foi avaliado em LaVO e HCT116 (APRIL

altos) células, e SW620 e (APRIL

Menor) células HT-29. Para determinar se havia efeitos da dose, a proliferação celular foi medida a diferentes concentrações de sAPRIL-BP. A taxa de proliferação foi significativamente inibida (

P 0,05

) por tratamento com sAPRIL-PA em células LOVO e HCT116 (Figura 3A) em um tempo e dose-dependente maneira. No entanto, isto não foi o caso em SW620 e células HT-29 (Figura 3B). Lá resultados sugerem que os efeitos anti-proliferativa de sAPRIL-BP são específicos para abril

células de alta.

expressão abril foi avaliada em cinco linhas de células colorrectal humano (indicado) usando RT-PCR (A) e western Blotting (C). Imagens de gel representativos são mostrados. GAPDH foi usada como um controlo interno. As densidades ópticas do ARNm de APRIL (B) e as bandas de proteína (D) foram analisados ​​e normalizada para o controlo interno. *

P

. 0,05 em comparação com SW620, HT-29, ou SW480

(A) abril

alta LaVO e células HCT116 e (B) abril

baixo SW620 e células HT-29 foram tratadas com as doses indicadas de péptidos de ligação sAPRIL por 24, 48, e 72 h, e a proliferação foi determinada utilizando o kit de CCK-8. A taxa de inibição da proliferação foi calculada como: (%) = [(média de OD

controle média de OD

experimental) /média de OD

controle] × 100%

.

Efeitos de sAPRIL péptidos de ligação sobre o ciclo celular e a apoptose em células LOVO

Uma vez que a proliferação de células de cancro é principalmente regulada pelo ciclo celular, que determinado que próxima fase do ciclo celular foi afectada por sAPRIL tratamento. Com base nos resultados de proliferação (Fig 3A), optou-se por teste de 20 uM e 40 uM de sAPRIL-PA em células LOVO para determinar a inibição sAPRIL alterada do ciclo celular e apoptose. Por citometria de fluxo, sAPRIL-PA aumentou significativamente a percentagem de células em G

0 /L

1 fase com a dose baixa (20 | iM sAPRIL-BP: 73,1 ± 0,6%;

P

0,001), e a dose mais elevada (40 pM sAPRIL-BP: 76,2 ± 0,1%;

P

0,001) quando comparado com o controlo de veículo (65,2 ± 0,8%). sAPRIL-BP também reduziu significativamente a percentagem de células em G

2 /M, fase em comparação com o controlo de veículo (24,3 ± 0,8%) com a dose baixa (20 | iM sAPRIL-BP: 15,1 ± 0,5%;

p

0,05) e a dose mais elevada (40 pM sAPRIL-BP: 13,7 ± 0,5%;

P

0,001; Figura 4A e 4B). Isto sugere que os efeitos anti-proliferativos de sAPRIL-PA em células LOVO são devido a uma acumulação de células na L

0 /L

uma etapa, que bloqueia a progressão do ciclo celular. Em relação aos efeitos apoptóticos de sAPRIL-BP, citometria de fluxo mostrou que sAPRIL-BP teve efeitos dependentes da dose sobre a percentagem de células LOVO em apoptose precoce (PI

– Anexina V

+ células). Em comparação com o controlo de veículo (1,76 ± 0,12%) a dose baixa (20 | iM sAPRIL-BP: 2,49 ± 0,23%;

P

0,05) e dose elevada (40 pM sAPRIL-BP: 3,82 ± 0,36 %;

P

0,05) significativamente aumentados células apoptóticas no início (Fig 4C e 4D). Além disso, investigamos o possível mecanismo molecular subjacente ao efeito de sAPRIL-BP na progressão do ciclo celular. O tratamento com sAPRIL-PA não teve efeito sobre a ciclina A, B, E1, CDK6, p53, p27, e a expressão de p16 (Figura 5A). Mas a expressão do G1 /S-específicas da ciclina D1 proteína (Figura 5A e 5B) e cinase de divisão celular cinase dependente da ciclina 4 (CDK4) (Figura 5A e 5C) foram regulados negativamente de um modo dependente da dose pelo tratamento com sAPRIL- BP.

células LOVO foram tratados com as doses indicadas de sAPRIL-BP durante 48 h. As células foram coradas com PI para análise do ciclo celular (A e B) e PI + anexina V para a análise de apoptose (C e D) por citometria de fluxo. *

P

0,05 comparado com o controlo do veículo; #

P

0,05 comparado com o grupo de dose baixa

células LOVO foram tratados com as doses indicadas de sAPRIL-BP durante 48 h.. (A) Os níveis das proteínas do ciclo celular indicadas de expressão foram avaliados através da análise de Western Blotting. GAPDH foi usada como um controlo interno. O tamanho da proteína de Ciclina D1 é de 34 kDa, Ciclina A 49 kDa, Ciclina E 50 kDa, ciclina B1 de 55 kDa, CDK4 34 kDa, CDK6 de 37 kDa, o p53 53 kDa, p27 de 27 kDa, de p16 de 40 kDa, e de GAPDH de 36 kDa. As densidades ópticas da ciclina D1 (B) e as bandas de proteína CDK4 (C) foram analisadas e normalizada para o controlo interno, tal como mudança de dobragem. *

P Art 0,05 comparado com o grupo do veículo; #

P Art 0,05 em comparação com 10 do grupo? M, †

P Art 0,05 em relação ao grupo de 20 mM

Efeito da sAPRIL-BP na. xenotransplante crescimento do tumor

em seguida, o

in vivo

efeito da sAPRIL-BP foi avaliado no modelo de xenoenxerto de cancro colorectal. células LOVO foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus, seguido de controlo, de baixa (20 mg /kg) ou elevada (40 mg /kg) a dose sAPRIL-PA injectado intratumoral uma vez que o tumor foi estabelecido. Os ratinhos foram sacrificados no dia 14, imagens representativas dos ratinhos e os tumores são mostrados na Fig 6A. O tratamento com sAPRIL-BP dependente da dose, reduziu o volume do tumor (Figura 6A) e o peso do tumor (Fig 6B) no modelo de ratinho. A partir do dia 8 de injecção sAPRIL-BP, o tamanho do tumor de grupos de baixa e alta dose foi significativamente

(p

0,05). Menor do que o grupo controle (Fig 6C)

células LOVO foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus e deixou-se crescer durante 3 semanas. Uma vez que o tumor foi fixada, os ratinhos foram divididos em 3 grupos (n = 5) e tratados com PBS (controlo), baixa (20 mg /kg), ou uma dose elevada (40 mg /kg) de sAPRIL-BP em dias alternados . (A) Os exemplos representativos dos tumores de cada grupo são apresentados. Painel superior: Barra de escala, 8 mm. Painel inferior: Barra de escala, 7 mm. (B) Os ratinhos foram sacrificados após duas semanas de tratamento com os pesos dos tumores foram registados sAPRIL-BP e. *

p Art 0,05 em relação ao controle. #

P

0,05 comparado com o grupo de dose baixa. (C) O volume do tumor foi registado a cada dois dias durante o tratamento. *

p

. 0,05 em relação ao controle

Efeito da sAPRIL-BP sobre a proliferação celular e apoptose na

tumor xenoenxerto

Para investigar mais o mecanismo pelo que sAPRIL-BP inibe o crescimento do tumor de xenoenxerto, foi realizada com H e de coloração (figura 7A) sobre os tecidos tumorais e descobriram que o tratamento com quer a dose baixa ou elevada dose de sAPRIL-PA não tiveram efeitos significativos sobre a morfologia de células de tumor e arquitectura massa tumoral . Observou-se um pequeno número de espaços vazios maiores entre as células tumorais no grupo da dose mais elevado do que os outros dois grupos. Além disso, a coloração imuno-histoquímica para o marcador de proliferação Ki67 em tumores de xenoenxerto (figura 7B e 7D) mostrou proliferação de células de cancro inibiu significativamente sAPRIL-PA

In vivo

de uma forma dependente da dose. Em contraste, a coloração imuno-histoquímica para o marcador de apoptose caspase-3 (Fig 7C e 7E) mostrou tratamento sAPRIL-PA resultou num aumento significativo e dependente da dose na apoptose de células tumorais. . Estes resultados indicaram a sAPRIL-BP inibe o crescimento do tumor por inibição da proliferação e indução de apoptose

foram usadas embebido em parafina tecidos de tumor para a análise morfológica com H E de coloração (A), a análise de proliferação com coloração de Ki67 (B), e análise de apoptose com a caspase-3 clivada (CLE-casp-3) coloração (C). imagens representativas dos tumores de cada grupo são apresentados (ampliação de × 200). O índice de proliferação (D) e índice de apoptose (E) foram calculados e normalizados para o grupo controle (Con). *

p Art 0,05 em relação ao controle. #

p

. 0,05 em comparação com 20 mg /kg grupo

Efeito da sAPRIL-BP sobre a metástase de tumor xenoenxerto

Para investigar se sAPRIL- BP tratamento de inibição de metástases, foi estabelecido um modelo de metástase hepática através da injeção de células LOVO no baço. imagens representativas do tumor metastático do fígado foram mostrado na Fig 8A. O tratamento com sAPRIL-BP reduziu o número de nódulos metastáticos de um modo dependente da dose (Fig 8B;

P

0,05). A distribuição dos tamanhos dos nódulos era semelhante em cada grupo (Figura 8C). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem tratamento sAPRIL-PA não só o crescimento do tumor reduzido, mas também diminui a metástase do fígado num modelo de ratinho de cancro colo-rectal.

células LOVO foram injetadas nos baços de ratinhos nus para observar a metástase do fígado experimental. Três semanas após a injecção, os ratinhos foram divididos em 3 grupos (n = 5) e tratado com PBS (controlo), baixa (20 mg /kg), ou elevada (40 mg /kg) doses de sAPRIL-BP em dias alternados. Os ratinhos foram sacrificados após duas semanas de tratamento com sAPRIL-BP. (A) Imagens representativas dos tumores metastáticos do fígado a partir de cada grupo são apresentados. (B) O número de nódulos metastáticos por rato foram registrados. *

P Art 0,05 em relação ao controle. #

P

0,05 comparado com o grupo de dose baixa. (C) O número de nódulos metastáticos com o tamanho indicado foram registrados. Total de número de nódulos metastáticos:. N = 197 (CON), n = 130 (20 mg /kg) e n = 84 (40 mg /kg)

Discussão

neste estudo, foram identificados e caracterizados um sAPRIL-PA que poderia ser um potencial terapêutico para o cancro colorectal.

In vitro

estudos demonstraram efeitos tanto anti-proliferativa e pró-apoptóticos de sAPRIL-BP. Consistentemente, sAPRIL-BP reduziu

in vivo

o crescimento do tumor, reduzindo a proliferação de células intratumoral e aumentando a apoptose celular intratumoral. Além disso, sAPRIL-BP reduziu significativamente a metástase do fígado de células de cancro colorrectal num modelo de ratinho. Os efeitos da sAPRIL-BP identificados neste estudo terão de ser testados mais em ensaios clínicos. polipéptidos anti-cancro tem várias vantagens, tais como a síntese e purificação fácil, baixa imunogenicidade, e alta taxa de penetração. Este sAPRIL-BP pode ser uma estratégia viável para o tratamento de abril

cancros elevados [34-38].

Uma biblioteca de apresentação de fagos contém um grande número de diversos polipéptidos expressos na superfície de fagos [39]. Esta técnica é amplamente utilizado para objectivos de rastreio de drogas, agonista do receptor /antagonista, análise de antigenes de epitopo, o desenho da vacina, e análise da estrutura proteica [40-42]. Nós empregamos este método para desenvolver péptidos de ligação específicos sAPRIL. Uma vez que um dos mecanismos subjacentes a tumorigénese é a perturbação do equilíbrio entre a proliferação celular e a apoptose, estratégias anti-cancro que incluem a proliferação de inibição e /ou indução de apoptose em células de cancro são recomendados [43, 44]. Nossa hipótese é que os péptidos de ligação, que competem com os receptores ABRIL endógenas para vincular a forma solúvel de abril, teria eficácia terapêutica contra abril

cancros elevados. Estratégias similares segmentação abril, tais como, usando as formas solúveis de receptores de engodo para competir com a ligação do ligando e silenciar abril, foram mostradas para inibir o crescimento tumoral em certos tipos de cancros. Por exemplo, a forma solúvel de BCMA foi mostrado para inibir a actividade proliferativa de abril

In vitro

e diminuir a proliferação de células de tumor em ratinhos nus [45]. Downregulation de abril por RNAi mediada por lentivírus efetivamente inibe o crescimento de células de câncer de pâncreas

in vitro

e

in vivo

[46]. Wang

et al

. [15, 26] também usou siRNA para silenciar abril em um modelo de cancro colorectal ratinho nu e descobriu que abril knockdown aumento da apoptose de células cancerosas e reduziu o crescimento de tumores e metástases. Do mesmo modo, mostrámos previamente que mediada por lentivírus RNAi knockdown de abril inibe a taxa de crescimento de células LOVO e aumenta o número de células na fase G0 /G1 e diminui o número na fase G2 /M [28]. Coerente com o trabalho anterior, este estudo mostrou que a segmentação abril usando sAPRIL-BP tem alguma eficácia contra linhas de cancro colorrectal.

trabalhos anteriores [14, 21, 22, 24] sugeriu que os mecanismos anti-apoptóticos de sAPRIL -BP pode ser atribuída ao bloqueio de sinalização NF-kB, e a regulação das proteínas anti-apoptóticos (Bcl-2, Bcl-XL, XIAP, ERK, e TGF-ß) ou proteínas pró-apoptóticos, tais como Bax. No entanto, os mecanismos moleculares detalhados através do qual sAPRIL-BP aumento da apoptose em células LOVO continuam a ser investigado. Além disso, o sAPRIL-PA foram identificados mostrou afinidade de ligação específica com sAPRIL e capacidade significativa para inibir competitivamente a ligação a receptores sAPRIL Abril sobre células LOVO. HSPG é o único receptor de abril encontrado em células LOVO (dados não mostrados). Portanto, se sAPRIL-BP e HSPG compartilham os mesmos epítopos vinculativas sobre sAPRIL, e a semelhança estrutural entre HSPG e sAPRIL-BP requer estudos adicionais.

Abril- proliferação celular regulada tem sido implicado em muitos cancros diferentes, mas até o momento existem poucos estudos publicados que demonstram o mecanismo molecular subjacente a regulação do ciclo celular abril mediada. Wang

et al

. demonstrou uma redução na ciclina D1 e CDK4, que são reguladores críticos da transição G1 /S, quando abril foi derrubado em células de cancro colorrectal.