Sumário

O Abelson (c-Abl) proto-oncogene codifica uma proteína cinase de tirosina nonreceptor altamente conservada que desempenha um papel na proliferação celular, diferenciação, apoptose e adesão celular. C-Abl representa um alvo específico anti-cancro no cancro da próstata como actividade aberrante de quinase esta tem sido implicada na estimulação do crescimento e a progressão do cancro da próstata. No entanto, o mecanismo de regulação de c-Abl não é conhecido. Aqui nós relatamos que quinases Abl são regulados por um romance microRNA, miR-4723, de câncer de próstata. Expressão de perfis de expressão de miR-4723 num grupo de amostras clínicas de cancro da próstata mostraram que a expressão de miR-4723 é amplamente atenuada no cancro da próstata. Baixa expressão de miR-4723 foi significativamente correlacionada com o resultado de sobrevivência pobres e nossas análises sugerem que miR-4723 tem um potencial significativo como um biomarcador da doença para diagnóstico e prognóstico no câncer de próstata. Para avaliar o significado funcional da expressão de miR-4723 diminuiu no cancro da próstata, o miR-4723 foi sobre-expresso em linhas celulares de cancro da próstata, seguido por ensaios funcionais. miR-4723 superexpressão levou a reduções significativas no crescimento celular, clonability, invasão e migração. Importante, a expressão de miR-4723 levou à indução dramática de apoptose em linhas celulares de cancro da próstata, sugerindo que o miR-4723 é um carcinogénese da próstata pró-apoptótica miARN regulação. Análise de alvos putativos miR-4723 mostrou que o miR-4723 tem como alvo a integrina alfa 3 e proteína de ligação a metil CpG para além ABL1 e Abl2 quinases. Além disso, descobrimos que a expressão de Abl quinase está inversamente correlacionada com a expressão de miR-4723 em espécimes clínicos de cancro da próstata. Além disso, ABL1 knockdown fenocópias parcialmente miR-4723 re-expressão em células de câncer de próstata sugerindo que Abl é um alvo funcionalmente relevantes de miR-4723 no câncer de próstata. Em conclusão, nós identificamos um microRNA romance que medeia a regulação das quinases Abl no cancro da próstata. Este estudo sugere que miR-4723 pode ser um alvo atraente para intervenção terapêutica no cancro da próstata

Citation:. Arora S, Saini S, Fukuhara S, Majid S, Shahryari V, Yamamura S, et al. (2013) MicroRNA-4723 inibe o crescimento do cancro da próstata através de inativação do Abelson Família de Nonreceptor proteína tirosina quinases. PLoS ONE 8 (11): e78023. doi: 10.1371 /journal.pone.0078023

editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de maio de 2013; Aceito: 07 de setembro de 2013; Publicação: 01 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Arora et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo Centro Nacional de pesquisa de Recursos dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) através Grant Número RO1CA 138642, RO1CA160079, T32DK007790 e VA Mérito Review and VA Projeto de Programa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é o tumor maligno mais comum do sexo masculino ea segunda principal causa de morte por câncer entre os homens nos Estados Unidos. Próstata metástase óssea do cancro é a principal causa de mortalidade nos doentes que sofrem [1]. Apesar de muitos avanços, manejo clínico de câncer de próstata é um desafio e é uma das principais causas de morbidade e mortalidade relacionada ao câncer. Os principais desafios incluem opções terapêuticas para metastático, doença resistente à castração e da incapacidade dos atuais testes de diagnóstico para distinguir facilmente indolente de tumores agressivos [2] limitado. Portanto, tem havido um grande interesse na identificação de novos, biomarcadores de cancro da próstata alternativos que podem levar ao desenvolvimento de melhores intervenções prognóstico, diagnóstico e terapêuticas para a doença.

O Abelson (Abl) a família de altamente conservada nonreceptor proteína tirosina quinases desempenham um papel importante em diversos processos biológicos incluindo a sobrevivência celular, a proliferação, a adesão celular e motilidade [3]. As células de mamíferos têm duas famílias Abl kinases- ABL1 (c-Abl) e Abl2 (Abl-relacionado com o gene, Arg) – que são ubiquamente expressa [3], [4]. No centro das funções bioquímicas e fisiológicas das quinases Abl são a sua combinação de um regulada SH3-SH2-TK (Src homologia 3 Src homologia-2-tirosina cinase) com cassete domínio em proteínas do citoesqueleto e domínios de ligação ao ADN, uma combinação original que confere sinalização capacidades para estas proteínas [5]. A atividade de quinases Abl é estreitamente regulada por um conjunto complexo de interações intermoleculares que tenham implicações no domínio Abl quinase e levar a auto-inibição eficaz da actividade da tirosina quinase [6]. Rompimento de autoinibição, como por translocação de

ABL1

ou

Abl2

ao lado de uma variedade de genes diferentes (por exemplo,

Bcr

,

Tel

,

ETV6

), conduz à activação constitutiva, que acciona tumores malignos, particularmente leucemias [4], [7], [8]. Mutações no

gene ABL1

são comumente associados com leucemia mielóide crônica (LMC), onde o

gene ABL1

é ativado por ser translocados dentro da

Bcr

(região breakpoint cluster) gene no cromossoma 22, a criação de um novo gene de fusão,

Bcr-Abl

, que codifica para uma quinase não regulada, tirosina.

Embora ABL1 e Abl2 são bem conhecidos para dirigir o desenvolvimento de leucemia, o seu papel na tumores sólidos, tem sido observada apenas recentemente [4]. c-Abl e /ou Abl2 são activados em algumas linhas celulares de tumor sólido por via mecanismos únicos que não envolvem a mutação do gene /translocação, e a sua activação promove a proliferação, a degradação da matriz, invasão, tumorigénese, e /ou metástase, dependendo do tipo de tumor [4]. Evidências sugerem que a activação de c-Abl /Abl2 promove a progressão do cancro da próstata [4]. c-Abl e /ou expressão Abl2 foi significativamente aumentada (avaliada por imuno-histoquímica [IHC]) em vários tumores, incluindo o cancro da próstata [4], [9], [10]. Significativamente, silenciando c-Abl inibiu a proliferação de osteoblastos e promoveu a diferenciação de osteoblastos, o que indica que a inibição de c-Abl pode impedir o crescimento ósseo metastático [11]. Dasatinib (BMS-354825), uma cinase de dupla família Src (SFK) [12], e inibidor da cinase Abl [13] está sendo testado clinicamente para o tratamento de metástases ósseas do cancro da próstata e está actualmente na Fase 3 ensaios clínicos [14] – [ ,,,0],16]. Outra bosutinibe inibidor SFK /Abl (SKI-606) bloqueou a migração, invasão, crescimento independente de ancoragem, e proliferação de PC3 e 145 DU-células de cancro da próstata acompanhado por uma diminuição significativa na fosforilação de moléculas sinalizadoras (AKT, MAP quinase , quinase de adesão focal) [17]. Além disso, bosutinibe inibida

in vivo

PC3 crescimento do tumor por injecção subcuteaneous ou intraskeletal [4], [17]. A activação da c-Abl por factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) promoveu a sobrevivência de células de cancro da próstata [18]. quinases Abl também desempenhar um papel na regulação da motilidade do cancro da próstata /invasão e progressão [19] – [21]. Assim, as quinases Abl desempenham um papel importante no cancro da próstata e representam alvos importantes para a terapia específica anti-câncer. No entanto, o mecanismo molecular de sobre-expressão de quinases Abl no cancro da próstata não é conhecida. Aqui nós relatamos que quinases Abl são regulados por um romance microRNA, miR-4723, de câncer de próstata.

Os microRNAs (miRNAs) constituem uma classe evolutivamente conservada de pequenos RNAs não-codificantes que regulam negativamente a expressão de vários genes via sequence- interacções específicas com os 3′- regiões não traduzidas (UTRs) de alvos de ARNm cognato [22]. Ele tem sido firmemente estabelecida que miRNAs controlar vários processos celulares chave, tais como a proliferação, apoptose, diferenciação, o desenvolvimento [23], e estão implicados em doenças humanas, incluindo câncer [24]. miARNs foram identificados que funcionam como oncogenes clássicas ou genes supressores de tumor [24]. O acúmulo de evidências sugere que existem correlações entre a expressão miRNA e recorrência clínica, desenvolvimento de metástases e /ou sobrevivência [25], [26]. Devido aos seus padrões de expressão de tecido e de doenças específicas e potencial regulatório, miRNAs estão a ser avaliados como potenciais biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico de doenças malignas humanos [27].

miR-4723 é um recentemente descoberto miRNA [28], que não foi estudado. Analisou-se a expressão de miR-4723-5p (principal forma de miR-4723, referido como o miR-4723) na expressão de uma coorte de espécimes clínicos de cancro da próstata e descobriram que a expressão de miR-4723 é amplamente atenuada no cancro da próstata e é significativamente correlacionados com mau resultado sobrevivência e progressão tumoral. Estudos funcionais utilizando linhas celulares de cancro da próstata mostraram que a reconstituição de expressão de miR-4723 levou a reduções significativas no crescimento celular, clonability, invasão e migração. Significativamente, o miR-4723 re-expressão dramática conduziu à indução de apoptose em linhas celulares de cancro da próstata, sugerindo que o miR-4723 é um miARN pro-apoptótica que regula a carcinogénese da próstata. Além disso, nossos dados sugerem que este romance miRNA é um importante regulador de ABL1 e Abl2 quinases que, por sua vez regula a carcinogênese de próstata. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que (i) define romance miRNA regulação mediada por quinases Abl no câncer de próstata e (ii) identifica um romance supressor de tumor miRNA no câncer de próstata. Este mecanismo regulador será potencialmente útil para intervenção terapêutica no cancro da próstata.

Resultados

Expression miR-4723 é amplamente atenuada em cancro da próstata

Para avaliar o papel do miR- 4723 no cancro da próstata, a expressão de miR-4723 foi ensaiada em amostras humanas clínicos humanos da próstata (Fig. 1a). características clinicopatológicas dos pacientes estão resumidas na Tabela S1. Foram examinados os níveis de expressão de miR-4723 na captura de laser microdissecado tecidos (LCM) do cancro da próstata (n = 57) e combinados regiões normais adjacentes por meio de PCR em tempo real. Enquanto a expressão de miR-4723 era inalterado em 6/57 casos (10%) e maior em 9/57 casos (16%), uma grande fracção de amostras de tecido (42/57, ~74%) mostrou menor miR-4723 níveis relativos aos tecidos normais correspondentes. As diferenças foram estatisticamente significativas com o teste de classificações de Wilcoxon Signed (p 0,0001). Isto sugere que o miR-4723 é amplamente regulada negativamente no cancro da próstata e é um potencial supressor do tumor do cancro da próstata.

(A) análise de RT-PCR quantitativa de níveis de expressão de miR-4723 em relação microdissecados de captura laser (LCM) CaP tecidos (n = 57) e pacientes normais combinados regiões adjacentes. Os dados foram normalizados ao controle RNU48. Tabela resume os níveis de expressão de miR-4723 relativos nestas amostras. (B) Correlação de expressão de miR-4723 com características clínico-patológicas de pacientes com câncer de próstata, incluindo Gleason grau, estágio patológico e recorrência bioquímica.

regulação negativa do Expression miR-4723 está associada com a progressão do tumor no câncer de próstata

Nós determinamos se a expressão de miR-4723 em tecidos clínicos foram correlacionadas com características clínico-patológicas, como Gleason grau, estágio patológico e recorrência bioquímica do carcinoma (Fig. 1B). Redução da expressão de miR-4723 foi observada em 66% dos casos de baixo grau de Gleason (06/04), 74% dos casos de Gleason de grau 7 e em 75% dos casos de alto grau de Gleason (8-10). Esta tendência sugere que a expressão de miR-4723 tende a diminuir no cancro da próstata de grau mais elevado. Da mesma forma, a diminuição da expressão de miR-4723 foi observada em 68% dos casos de pT2 estágio patológico vs 73% dos casos de pT3 enquanto não houve correlação significativa com recorrência bioquímica.

miR-4723 é um diagnóstico potencial e prognóstico marcador no cancro da próstata

Tendo em vista a regulação baixa generalizada observada de miR-4723 em amostras clínicas de câncer de próstata, foi avaliada a importância clínica potencial de expressão de miR-4723. Para determinar a capacidade potencial de miR-4723 como um biomarcador de diagnóstico para câncer de próstata, foi realizada ROC (Receiver Operating Characteristic) análises sobre a coorte de amostras clínicas (Fig. 2A). A análise ROC mostrou que a expressão de miR-4723 pode ser um único parâmetro importante para discriminar entre tecidos normais e tumorais com uma área sob a curva ROC (AUC) de 0,727 (Cl 95%: 0,655-0,792, p 0,0001). Além disso, nós estratificada nosso cancro da próstata coorte clínica com base na expressão de miR-4723 e realizada análise de sobrevivência de Kaplan-Meier. Esta análise mostrou que a sobrevivência foi significativamente reduzida em pacientes com baixa expressão de miR-4723 (Fig. 2B) (p = 0,0431). Estas análises indicam que o miR-4723 tem um potencial significativo para ser utilizado como um marcador de diagnóstico e de prognóstico para cancro da próstata.

(A) análise ROC curva que mostra a capacidade de expressão de miR-4723 para discriminar entre malignas e não- amostras de tecido da próstata malignas. curvas de sobrevida (B) de Kaplan-Meier para pacientes com câncer de próstata, estratificada com base em miR-4723 expressão (baixo e alto). valor p baseado no teste de log rank (* p 0,05).

miR-4723 superexpressão Suprime tumorigenicidade de células cancerosas da próstata

Para avaliar o potencial de um papel supressor de tumor de miR-4723, que sobre-expressa o miR-4723 em linhas celulares de cancro da próstata (LNCaP e PC3) seguido por ensaios funcionais (Fig. 3). transfecção transiente de miR-4723 precursora levou a sobre-expressão de miR-4723 como determinado por PCR em tempo real (Fig. S1). Expressão de miR-4723 conduziu a alterações morfológicas marcadas em ambas as linhas celulares (Fig. 3a). Especificamente, uma diminuição pronunciada na fracção de células alongadas, em forma de fuso foi acompanhada por um aumento das células arredondadas, apoptóticas. As alterações morfológicas observadas com a sobre-expressão de miR-4723 sugeriu um aumento em células apoptóticas. Um decréscimo significativo na viabilidade das células foi observada ao longo do tempo em PC3 /células LNCaP que sobre-expressam o miR-4723 (Fig. 3B) em comparação com células que expressam o controlo miR (miR-CON). a sobre-expressão de miR-4723 também diminuiu clonogenicidade de células PC3 /LNCaP em comparação com miR-CON (Fig. 3C). Transwell migração e ensaios de invasão mostraram que a expressão de miR-4723 reduziu a migração (Fig. 3D) e invasão (Fig. 3E) de ambas as linhas celulares. Estas observações sugerem que a superexpressão de miR-4723 suprime a tumorigenicidade de células cancerosas da próstata.

Para avaliar o significado funcional de miR-4723 no cancro da próstata, o miR-4723 precursora foi sobre-expresso em linhas celulares PC3 /LNCaP por transfecção transiente seguido por ensaios funcionais (realizada 72 horas pós-transfecção). (A) alterações morfológicas em PC3 /células LNCaP após expressão de miR-4723 avaliada por microsopy de contraste de fase. (B) ensaio de viabilidade celular, ensaio de invasão (C) ensaio de formação de colónias, (D) Ensaio Transwell-migração e (E) em células PC3 /LNCaP zombar transfectadas ou transfectadas com miR-CON ou miR-4723 (* P 0,05 ).

a superexpressão de miR-4723 induz a apoptose em células cancerosas da próstata

Nós medidos apoptose no controle (simulada ou miR-CON transfectadas) e as células miR-4723-transfectadas pelo fluxo A análise de citometria de anexina-V-FITC-7-AAD células PC3 corados (Fig. 4A-B). Observou-se que as fracções de células apoptóticas médios (início apoptótica + apoptóticas) foram significativamente aumentada após o miR-4723 reexpressão (12% + 5%) em comparação com o miR-CON ou células falsamente transfectadas (3% + 1%), com uma diminuição concomitante na população de células viáveis. Isto aponta para um papel pro-apoptótico de miR-4723 e sugere que o miR-4723 afecta vias apoptóticas na regulação da tumorigenicidade.

de ensaio (A) a apoptose em células PC3, após (painéis da esquerda) ou o miR-CON miR- 4723 (painéis da direita) transfecção durante 72 horas tal como avaliado por coloração de anexina V-FITC /7-AAD. (B) Representação das fracções médias apoptóticos (início + apoptóticos tarde) em cada grupo (* p 0,05)

miR-4723 Induz G2-M prisão em células cancerosas da próstata

FACS (activadas por fluorescência separação de células) a análise mostrou que a expressão de miR-4723 em células PC3 levar a um aumento significativo no número de células na fase G2-M do ciclo celular em comparação com o miR-CON (Fig. 5) . Isto sugere que o miR-4723 expressão induz a paragem G2-M em células de câncer de próstata.

análise do ciclo celular após a simulação (painel esquerdo) /miR-CON (painel do meio) ou tratamentos miR-4723 (painel da direita), mostrando indução de /paragem G2 fase M por miR-4723. 72 horas pós-transfecção. As células foram coradas com corante nuclear DAPI para análise FACS.

Metas miR-4723 Abl cinases em células cancerosas da próstata

Para identificar efetores de miR-4723, uma lista de potenciais alvos de miRNA foi criada combinando objectivos previstos a partir das miRDB predição alvo algoritmo [29], [30] e o perfil da expressão de genes relacionados com a apoptose e o ciclo celular usando via centrou matrizes de PCR. Consistente com os efeitos observados de miR-4723 sobre a apoptose e o ciclo celular, encontramos várias moléculas chave destes processos celulares como potenciais alvos de miR-4723. Profiling de genes relacionados com apoptose e ciclo de células mostraram consistentemente a regulação negativa do gene ABL1 (Fig. 6A-B). Para validar estes resultados, foi realizada a análise de RT-PCR para examinar os niveis de expressão de ARNm relativos de ABL1 e descobriram que o miR-4723 superexpressão leva à diminuição da expressão ABL1 (Fig. 6C). Isto sugere que o miR-4723 reprime ABL1 via degradação do mRNA.

(A) Profiling de genes apoptóticos e, genes (B) do ciclo celular relacionados após a sobre-expressão de miR-4723 em células PC3 mostrando regulação negativa da ABL1 por miR- 4723. (C) a expressão de ARNm relativa do gene ABL1 como avaliado por RT-PCR. (D) Representação esquemática da ABL1 e Abl2 3′-UTR que mostra as posições relativas dos locais de miR-4723 de ligação putativos. (E) Imunotransferência de endógena ABL1, Abl2 e outros alvos de miR-4723 em células PC3 transfectadas, como indicado. GAPDH foi utilizado um controlo de carga. (F) ABL1 UTR 3 ‘construto que engloba os sítios de ligação de miR-4723 ou a construção de controlo foi co-transfectado em células PC3 com miR-4723 ou miR-CON e ensaiadas quanto à actividade de luciferase relativa (* p 0,05)

o

in silico

análises mostraram que ABL1 possui cinco potenciais locais alvo miR-4723 no seu 3′-UTR (Fig. 6D). Sites 2-5 são evolutivamente conservada em primatas (chimpanzé, gorila, macaco rhesus) (Fig. S2). Além disso, verificou-se que o Abl2 intimamente relacionado possui um potencial de miR-4723 local alvo no seu 3′-UTR (Fig. 6D, painel inferior). Este site é conservado em chimpanzés e gorilas (Fig. S2).

Guiados por esses achados, foi realizada análise de Western blot para putativos alvos miR-4723 em células PC3 que eram ou transfectadas ou transfectadas com miR-4723 simulada /miR-CON (Fig. 6E). Curiosamente, a sobre-expressão de miR-4723 levou à diminuição dos níveis de proteína de ABL1 e Abl2 que codificam a família de quinases de proteína de Abelson tirosina nonreceptor. Além disso, descobrimos que o miR-4723 reprime proteína Metil CpG vinculativo (MeCP2) e integrina alfa 3 (ITGA3). A 3’UTR de MeCP2 possui dez potenciais locais alvo miR-4723 enquanto que a de ITGA3 têm quatro potenciais locais alvo miR-4723 (Fig. S3).

Nós investigamos se o proto-oncogene c-Abl é uma direta funcional alvo de miR-4723 no do cancro da próstata. transfecção transitória de células de cancro PC3 humanos com o plasmídeo ABL1 3’UTR juntamente com miR-4723 precursora levou a uma diminuição significativa na actividade de promotor quando comparado com o vector de controlo (Fig. 6E) sugerindo que o miR-4723 directamente reprime este gene. Estas observações levaram-nos a concluir que miR-4723 regula uma coorte de genes que desempenham um papel importante na sobrevivência celular, adesão, invasão e metástase quinases particularmente Abl.

ABL1 Knockdown Parcialmente fenocópias miR-4723 reexpressão no cancro da próstata células

para determinar se Abl é um alvo funcionalmente relevantes de miR-4723 no câncer de próstata, que inibiu a expressão ABL1 usando siRNA para ver se ABL1 knockdown funcionalmente imita os efeitos da sobre-expressão de miR-4723. Nós tratada células PC3 com ABL1 siRNA seguido de

in vitro

ensaios funcionais (Fig. 7). Dois conjuntos de ARNsi contra Abl1- ABL1 siRNA1 e siRNA2- foram usadas para alcançar knockdown eficiente como avaliado por análise de imunotransferência (Fig. 7A). siRNA não específica (NS) foi utilizada como um controlo. Um decréscimo significativo na viabilidade das células foi observada em células PC3 tratadas ABL1 siRNA em comparação com as células tratadas com ARNsi de controlo (Fig. 7B). ABL1 knockdown também levou à diminuição da clonogenicidade de células PC3 comparação com o controlo (Fig. 7C). Análise do ciclo celular mostraram que ABL1 knockdown levou a prisão fase G2-M semelhantes a superexpressão de miR-4723 (Fig. 7D). Ensaio de apoptose mostraram que as fracções de células apoptóticas foram significativamente aumentados após ABL1 knockdown em comparação com células de controlo tratadas com siRNA, um efeito semelhante ao observado em cima do miR-4723 reintrodução nas células PC3 (Fig. 7e). Estes resultados sugerem que ABL1 é um determinante importante das propriedades tumorigénicas das células cancerosas da próstata e que a inibição ABL1 fenocópias parcialmente os efeitos anti-tumorigênicos de miR-4723 no câncer de próstata.

células PC3 foram transfectadas com ABL1 siRNA /siRNA de controlo não específico (NS) durante 72 h seguido por vários ensaios. Dois conjuntos de ARNsi contra Abl1- ABL1 siRNA1 siRNA2- e foram utilizadas para ensaios funcionais. (A), a expressão da proteína ABL1 Relativa após transfecções siRNA como avaliado por imunotransferência. GAPDH foi usada como um controlo de carga. (B) ensaio de viabilidade celular, (C) Ensaio de formação de colónias, (D) análise do ciclo celular, de ensaio (E) a apoptose em células PC3, após NS siRNA (painel da esquerda) /ABL1 siRNA1 (painel do meio) /ABL1 siRNA2 (painel da direita) tratamentos.

a expressão de Abl cinase é inversamente correlacionada com a expressão de miR-4723 no cancro da próstata

Para confirmar ainda mais Abl como um alvo patologicamente relevantes de miR-4723

in vivo

, examinamos a correlação entre o miR-4723 e expressão Abl em um subconjunto de nossa coorte clínica. Foi realizada coloração imuno-histoquímica para Abl em tecidos CaP (n = 12) e observou-se uma correlação negativa entre Abl e expressão de miR-4723 (Fig. 8). As amostras clínicas com baixa expressão de miR-4723 (em relação ao tecido normal adjacente) mostraram níveis elevados de expressão Abl (Fig. 8).

Nós examinamos a correlação entre o miR-4723 e expressão Abl em um subconjunto da nossa clínica coorte efectuando coloração imuno-histoquímica em tecidos de Abl PCA (n = 12). os níveis de expressão relativa de Abl (como marcado por IHC) e miR-4723 (como determinado por RT-PCR) para as amostras analisadas estão representados no gráfico de barras.

Discussão

um corpo expansivo da literatura mostra que miRNAs são significativamente alterada no cancro da próstata [31]. Como as interações moleculares de miRNAs com seus genes-alvo cognatos estão sendo exploradas, o presente estudo teve como objetivo identificar novos miRNAs que regulam a carcinogênese de próstata. Neste estudo, identificamos uma novela miRNA tumor-supressor, miR-4723, de câncer de próstata. miR-4723 é um miARN recentemente descoberto [28], que não foi ainda explorado. Expressão de perfis de expressão de miR-4723 num grupo de amostras clínicas de cancro da próstata mostraram que a expressão de miR-4723 é amplamente regulada negativamente no cancro da próstata. Em virtude da sua baixa expressão, avaliamos o potencial de miR-4723 como um biomarcador de câncer de próstata. As nossas análises sugerem que a baixa expressão de miR-4723 pode ser um parâmetro importante para discriminar entre os tecidos tumorais da próstata e normais. Além disso, a baixa expressão de miR-4723 foi significativamente correlacionada com mau resultado sobrevivência e progressão do tumor em amostras clínicas. Estes resultados sugerem que este romance miRNA tem um potencial significativo como um biomarcador da doença para diagnóstico e prognóstico do câncer de próstata.

A regulação negativa observada de expressão de miR-4723 em amostras clínicas CaP também sugeriu que este romance miRNA pode possuir tumor-supressora atividade. Para testar isso, realizamos estudos funcionais com cancro da próstata linhas celulares PC3 e LNCaP. Nós overexpressed miR-4723 nestas linhas celulares de CaP seguido por ensaios funcionais. Nossos dados sugerem que a sobre-expressão de miR-4723 em células CaP suprime tumorigenicidade, confirmando o papel tumor-supressora de miR-4723 no câncer de próstata. miR-4723 superexpressão levou a reduções significativas no crescimento celular, clonability, invasão e migração. Mais importante, estes estudos indicam que o miR-4723 é um miARN pro-apoptótica que regula a carcinogénese da próstata. Este é o primeiro relatório implicando um papel supressor de tumor para este miRNA no cancro da próstata onde mostramos que tem um importante papel pró-apoptótica.

Em células de mamíferos, miRNAs causa silenciamento de genes de seus genes-alvo através tanto de translação inibição e a degradação do mRNA e um miARN indivíduo é capaz de regular dezenas de ARNm distintos [22]. Para entender o papel funcional de miR-4723 na carcinogênese da próstata, nós olhamos para os genes alvo putativos que desempenham um papel importante na sobrevivência celular, adesão, invasão e metástase. Nossos dados sugerem que c-Abl proto-oncogene e Abl2 /Arg são importantes alvos funcionais de miR-4723 no câncer de próstata. ABL1 e Abl2 codificar a família de quinases de proteína de Abelson tirosina nonreceptor que são ubiquamente expressa e altamente conservada na evolução de metazoários [3]. Estas cinases desempenham um papel na regulação da proliferação celular, diferenciação, apoptose, adesão celular e respostas de stress [3]. A actividade aberrante de tirosina-quinases estes têm sido implicados na estimulação do crescimento do cancro e progressão de vários tumores, em especial leucemias. Os estudos sugerem que a activação de c-Abl /Abl2 promove a progressão do cancro da próstata [4]. Em tumores da próstata, c-Abl e /ou expressão Abl2 foi aumentada significativamente tal como determinado por imuno-histoquímica [IHC]) [4], [9], [10]. A activação da c-Abl por factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) promoveram a sobrevivência das células do cancro da próstata por indução da expressão da proteína anti-apoptótica, MCL-1, através de uma via de sinalização de p68 /β-catenina [18]. quinases Abl também desempenhar um papel na motilidade /invasão de células de cancro da próstata, tal como a fosforilação de c-Abl /Arg-mediada de galectina-3 impedido a sua clivagem por PSA aumentando assim de comprimento completo de galectina-3 e promoção da migração extracelular e invasão de células CaP [19], [21]. Um papel de c-Abl na progressão do cancro da próstata tem sido demonstrada devido à sua capacidade para fosforilar um de Wiskott-Aldrich família de proteínas síndrome, membro 3 (WASF3), uma proteína que controla a motilidade celular e a invasão e é regulada positivamente em avançado CaP metastático [20 ]. Assim, essas quinases são alvos importantes para a terapia anti-específico do cancro e inibidores da cinase abl está actualmente em ensaios clínicos para o tratamento de metástases do cancro da próstata osso. Dasatinib (BMS-354825), uma quinase dupla Src família (SFK) [12] e inibidor da quinase Abl [13] está atualmente na Fase 3 de testes clínicos [14] – [16]. Dasatinib suprime a proliferação e diferenciação dos osteoblastos aumenta, indicando que a inibição de c-Abl pode impedir o crescimento ósseo metastático [11]. Bosutinibe (SKI-606), outro inibidor da SFK /Abl, inibe o crescimento do câncer de próstata células

in vitro

e

in vivo

[17]. Em geral, estes estudos sugerem que as quinases Abl desempenham um papel importante no cancro da próstata. No entanto, os mecanismos de regulação das actividades de Abl quinase não são completamente compreendidos. Aqui nós relatamos um regulamento mediada romance miRNA destas cinases no câncer de próstata.

regulação MicroRNA mediada de ABL1 e Bcr-Abl tem sido explorado em malignidades hematopoiéticas. Bueno

et al.

Mostrou que ABL1 é um alvo direto de miR-203 em malignidades hematopoiéticas. miR-203 é silenciado por mecanismos genéticos e epigenéticos em malignidades hematopoiéticas expressam ambos os níveis ABL1 e Bcr-ABL1 e proliferação celular inibida [32] ABL1 ou Bcr-ABL1, e restauração de miR-203 expressão reduzida, [33]. Num estudo recente, o miR-451, também tem sido demonstrado que regulam negativamente a expressão de Bcr-Abl na leucemia mielóide crónica [34], [35]. No entanto, esses estudos são escassos no câncer de próstata. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório para mostrar romance miRNA inactivação mediada de quinases Abl no câncer de próstata. Em vista dos resultados deste estudo, sugere-se que os efeitos observados de miR-4723 na apoptose, proliferação, migração e invasão são mediados pela sua capacidade de reprimir quinases Abl.

Um miARN indivíduo é capaz de regular várias distinta ARNm [36], [37], e tem sido demonstrado que a supressão pleiotrópico de múltiplos alvos a jusante pode explicar as alterações fenotípicas observadas por níveis alterados de certos miARNs [38] – [42]. Descobrimos que miR-4723 também reprime proteína Metil CpG vinculativo (MeCP2) e integrina alfa 3 (ITGA3). MeCP2 é uma proteína multifuncional nuclear envolvida em vários processos celulares, tais como a reorganização da cromatina, arquitetura e regulação da transcrição [43]. Nos últimos anos, um papel para MeCP2 surgiu no crescimento e proliferação das células [44]. No cancro da próstata, estudos sugerem que MeCP2 é necessária para o crescimento de células de cancro da próstata [45], [46]. A inibição da expressão MeCP2 por ARN gancho de cabelo curto estável parou o crescimento de ambas as células normais e de cancro da próstata humana enquanto que a expressão ectópica MeCP2 conferida uma vantagem de crescimento às células de cancro da próstata humanos. As células dependentes de androgénio importante, a sua expressão deixados crescer de forma independente da estimulação de androgénio e de reter propriedades tumorigénicas em condições de depleção de andrógeno [45]. Em outro estudo, o silenciamento de MeCP2 em células PC3 levou a uma diminuição da proliferação e aumento da apoptose [46]. Integrina a3 (ITGA3), uma molécula de adesão celular da família das integrinas, tem um número de papéis essenciais em processos necessários para a progressão do cancro, incluindo a proliferação, a sobrevivência, invasão e metástase [47]. Isto forma receptor de integrina complexos com vários membrana do citoesqueleto e moléculas sinalizadoras de regular a adesão celular, migração, transdução de sinal através das membranas celulares, e organização do citoesqueleto [47], [48]. As integrinas são alvos atraentes para terapias anti-câncer e tem havido pré-clínicos e desenvolvimento clínico de antagonistas de segmentação integrinas [49].

Em conclusão, nosso estudo identifica miR-4723 como um miRNA importante que regula o crescimento do câncer de próstata através inactivação das quinases Abl, MeCP2, ITGA3. Nosso estudo estabelece que a baixa expressão de miR-4723 está associada a uma pior sobrevida e progressão do câncer de próstata. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes eo estudo foi aprovado pelo Comitê de UCSF em Pesquisa com Seres Humanos (Número de aprovação: H9058-35751-01).