Abstract

Objectivos

O papel de sonic hedgehog (SHH) em epitelial mesenquimal (EMT) de câncer pancreático (PC) é conhecido, no entanto, o seu mecanismo não é claro. Porque SHH promove o desenvolvimento do tumor predominantemente através Gli1, buscou-se compreender o seu mecanismo através da identificação de alvos GLI1 em células de câncer de pâncreas.

Métodos

Em primeiro lugar, nós investigamos invasão, migração e EMT em células PC transfectadas com vetores de lentivírus de interferência Gli1 ou SHH sobre-expressão vetores

in vitro

e

in vivo

. Em seguida, foram determinados os perfis de genes alvo de Gli1 em células PC usando ensaios de cDNA microarray. Finalmente, as redes reguladoras primárias a jusante de SHH-Gli1 de sinalização em células PC foram estudados através de análises funcionais destes alvos.

Resultados

Os nossos resultados indicam que há diminuição da expressão da caderina-E sobre o aumento da expressão de SHH /Gli1. A migração de células PC aumentou significativamente de uma forma dependente da dose dentro de 24 horas de expressão Gli1 (

P

0,05). A proporção de metástases do fígado e metástases miniatura interna do baço aumentou acentuadamente após a activação de sinais de SHH-Gli1 em ratinhos nus. Usando cDNA microarray, identificamos 278 upregulated e 59 genes reprimidos após expressão Gli1 em células AsPC-1. Os dados indicam que os sinais de SHH-GLI1 promover EMT mediando uma rede de sinalização complexo, incluindo TGF, Ras, Wnt, fatores de crescimento, PI3K /AKT, integrinas, transmembrana 4 superfamília (TM4SF) e S100A4.

Conclusão

os nossos resultados sugerem que a segmentação das ligações moleculares estabelecidas entre SHH-Gli1 de sinalização e EMT poderia fornecer terapias eficazes para PC

Citation:. Xu X, Zhou Y, Xie C, Wei Sm, Gan H , Ele S, et al. (2012) Screening Genome-Wide revela uma rede Molecular EMT Mediada pela Sonic Hedgehog-Gli1 sinalização em células do cancro do pâncreas. PLoS ONE 7 (8): e43119. doi: 10.1371 /journal.pone.0043119

editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne Escola de Medicina da Universidade de Estado, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de junho de 2012; Aceito: 17 de julho de 2012; Publicação: 10 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações do National Science Foundation Natural da China (81072005 e 81172312) e do Comitê de Xangai Ciência e Tecnologia (10ZR1423300). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

sonic hedgehog (SHH) está envolvido na organogénese embrionário como um morfogénio. inapropriada ativação de sinais de SHH durante pâncreas formação resulta em agenesia e várias doenças pancreáticas [1]. SHH é excluído do pâncreas em desenvolvimento, bem como o órgão maduro, mas é regulada na pancreatite crónica, os primeiros pancreáticas neoplasia intra-epitelial lesões (pancreáticas intraepiteliais) e câncer pancreático invasivo (PC) [2]. upregulation SHH aberrante foi relatada em células PC humanos subtotal e pode ser um mediador crítico primária de desenvolvimento PC [3].

The Hedgehog (HH) via de sinalização está intimamente relacionado com a metástase do tumor eo prognóstico em estudos clínicos e é necessária para a metástase do tumor PC em modelos ortotópicos de ratinho [3], [4]. Recentemente, esta via foi pensado para orquestrar a reprogramação de células cancerosas através mesenquimais transição epitelial (EMT). Curiosamente, a evidência recente descobriu que SHH foi significativamente regulada em células PC gemcitabina resistentes que expressam simultaneamente com células-tronco do câncer (CSCs) marcadores [5]. Porque os produtos de genes alvo induzida por SHH poderia contribuir para a auto-renovação, a sobrevivência, e a migração de células progenitoras do cancro e Gli1 pode desempenhar um papel fundamental no comportamento maligno das células PC [6], [7], a identificação de alvos GLI1 é um passo lógico para entender seu mecanismo em células PC.

O objetivo deste estudo foi o de fornecer um quadro para as redes reguladoras primárias a jusante de SHH-Gli1 de sinalização em células PC. Nós também procuraram determinar se os genes-alvo GLI1 específica conectar SHH-Gli1 sinalização e EMT, proporcionando assim uma estratégia terapêutica para PC.

Materiais e métodos

cultura celular

A linhas de células PC (BxPC3, AsPC-1, Panc-1 e foram todos salvo pela Academia chinesa de Ciências.) foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com soro de vitelo fetal a 10% (FCS). Todas as células foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 no ar.

A construção do vector e infecção de células

vectores de transferência lentivirais para Gli1 shRNA humano ou cDNA SHH foram construídas por Genechem Co., Ltd, Shanghai, China. Esse sistema inclui o pLVTHM lentiviral vector, o plasmídeo envelope pMD2G, e os plasmídeos de empacotamento PRSV-REV e pMDlg-pRRE. O lentivírus-SHH (L-SHH) contém um 3,3-kb SHH sequência de codificação e o lentivírus-Gli1i (L-Gli1i) contém uma pequena hairpin RNA Gli1 à sequência de direccionamento do shRNA, como anteriormente descrito (5′-3-CTCCACAGGCATACAGGAT ‘) [8]. O lentivírus-controlo (G-C) não incluem sequências de interferência GLI1 ou sequências de cDNA SHH e serviu como controlo. lentivirais construções foram verificadas por sequenciação de ADN. lentivírus recombinante foi produzida por transfecção de células transientemente 293T seguindo um protocolo padrão. Quando BxPC3, AsPC-1, e células Panc-1 eram aproximadamente 50% confluentes (em meio RPMI-1640 contendo FCS a 2%), que foram infectadas com as construções de lentivírus em MOI de 5. As células foram colhidas após 72 horas para outras experiências. Para identificar funcional L-SHH e L-Gli1i constrói, nós rotineiramente analisados ​​expressão SHH e Gli1 por qRT-PCR

A:. A expressão de SHH, Gli1, Patched1 e mRNAs E-caderina na presença de L -Gli1i e SHH transdução. B:. Western Blot expressão mostrando proteína de Gli1, E-caderina, e GAPDH em linhas celulares de cancro do pâncreas

extração de RNA e em tempo real ensaios de RT-PCR

O RNA total foi extraído com o reagente de Trizol (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. O ARN total (100 ng) foi transcrito de modo reverso num volume de 20 uL de ADNc e 2 ul foi utilizado para a PCR, de acordo com as instruções do fabricante. (Takara Biotecnologia, Dalian, China). As sequências dos iniciadores são mostrados na Tabela 1. Os valores CT (limiar de ciclo) foram normalizados para os valores de TC de GAPDH

A1-9:. Cristal violeta coloração de células PC através de poros de membrana de policarbonato (200 × de ampliação). B: As contagens de células da migração de células PC, tal como analisada por ensaio Transwell. C1-3: A proliferação celular, tal como determinado por MTT (C1: células BxPC-3; C2: células AsPC-1; C3: células Panc-1). *

P Art 0,05, **

P

. 0,01

A extração de proteínas e ensaios de transferência Western

A proteína total foi extraída com tampão RIPA de acordo com métodos padrão e as amostras foram normalizadas para o teor de proteína usando um kit disponível comercialmente (Bio-Rad Laboratories Inc Philadelphia, PA EUA). As amostras de proteína foram separadas por 6% de SDS-PAGE (para a proteína Gli1) e 12% de SDS-PAGE (para SHH, E-caderina, e GAPDH). As proteínas foram transferidas para membranas de PVDF e membranas foram incubadas durante 2 h em tampão TBST, seguido por incubação durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários [1:1000 (v /v) para SHH, E-caderina, ou GAPDH e 1: 500 (v /v) para Gli1] em solução de bloqueio e a visualização utilizando o sistema de detecção ECL (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ, EUA)

a:. metástases de tumores baço e de fígado num espécime macroscópicas do grupo L-SHH. B: tumores baço e metástases do fígado num espécime macroscópicas do grupo G-C. C, D, e E: as imagens de microscopia de fluorescência. F, G e H: imagens Lightmicroscopy. (C, F: tumores do baço a partir do grupo L-Gli1i; D, L: metástases em miniatura interna do baço a partir do grupo L-C; E, H: metástases do fígado a partir do grupo L-SHH). *

P Art 0,05, **

P

. 0,01

Transwell ensaios

ensaios celular Invasion (24 Bem kits de amostras; Chemicon, Bedford, MA, EUA) foram utilizados para estudar invasão da linha de células PC e de migração. Resumidamente, as células PC (1 × 10

5) foram semeadas separadamente em meios isentos de soro, em Matrigel câmaras pré-revestidos Transwell (câmara superior), que continha as membranas de policarbonato com poros de 8 ^ m. Meio contendo FCS a 2% foi adicionado para dentro da câmara inferior. As câmaras Transwell foram então colocados sobre as placas de 24 poços. Após incubação durante 24 horas, a migração de células PC foi determinada através de fotografar a membrana através do microscópio. As contagens foram registrados a partir das 5 áreas com as maiores concentrações de células com alta ampliação de potência (× 200). O valor médio dos campos de contagem foi considerada a migração de células PC

A:. Conjunto de dados cDNA microarray comparando células L-Gli1i G-C e. B: classificação funcional de genes expressos diferencialmente. Veja também Tabela 2.

ensaios de crescimento celular

O crescimento celular foi determinada utilizando MTT [3- (4, 5 dimetil-2-tiazolil) -2.5 -diphenyl- 2H-tetrazólio] ensaios. Resumidamente, as linhas celulares de PC foram plaqueadas em placas de 96 poços. ensaios MTT foram realizadas após 12, 24, 48, e foram determinadas 72 horas e as densidades ópticas a um comprimento de onda de 490 nm.

metástases hepáticas indução por injecção esplénica

Três grupos de AsPC-1 células (lentivírus-Gli1i, lentivírus-controlo, e lentivírus-SHH) foram usados ​​para detectar metástases após a inoculação interna do baço em ratinhos nus como descrito anteriormente [9]. Resumidamente, os ratinhos foram anestesiados com metoxiflurano, um menor abdominal incisão flanco esquerdo foi feita, eo baço foi exposto. células AsPC-1 foram injectados no baço com uma agulha de calibre 30. O baço foi retornado para o abdómen, e a ferida foi fechada em uma camada com grampos de sutura. Após 8 semanas, eu colhi do fígado e baço e produzido secções congeladas contínuas. Nós manchado as secções com hematoxilina e eosina e tumores do baço contados, metástases em miniatura interna do baço e metástases hepáticas sob um microscópio de fluorescência e microscopia óptica. Todos os protocolos experimentais animais utilizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Pesquisa Animal da Universidade de Tongji

A: genes-alvo e de sinalização envolvidas na EMT regulada por Gli1 em células PC;. B:. O modelo crosstalk putativo dentro da rede molecular EMT mediado por sinalização de SHH-Gli1

analisa cDNA microarray

células AsPC-1 transduzidas com L-Gli1i e LC foram utilizados em ensaios de cDNA microarray com a matriz GeneChip Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0. Três experiências foram realizadas na preparação de um ARN total a partir das células única. Os valores de sinal são apresentados como a média de 3 experiências em replicado. ensaios de cDNA microarray e análises estatísticas dos resultados de expressão gênica foram realizados como descrito anteriormente [10].

Análises Estatísticas

Para todas as análises estatísticas, foi utilizado o software SPSS17.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL, EUA). As variáveis ​​contínuas são expressos como a média ± SE. testes t não pareado de Student foram utilizados para a avaliação estatística.

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Lentivirus-Gli1i e -SHH eficiência de transdução celular e PC EMT é regulada por SHH-Gli1 sinalização

Nós transfectadas três linhas celulares PC com o lentiviral Gli1 vector interferência (L-Gli1i), SHH sobre-expressão vector (L-SHH) e vetor de controle (LC). Verificou-se alterações na activação de sinalização de SHH-Gli1 através da avaliação da expressão de Shh, Gli1, e usando Patched1 em tempo real de RT-PCR. O dados em tempo real de RT-PCR revelou que os genes GLI1 e Patched1 foram significativamente regulada negativamente por transdução de L-Gli1i, enquanto Gli1 e Patched1 foram regulados positivamente por transdução de L-SHH em comparação com LC (

P

0,01; Figura 1A). Gli1 e Patched1 foram genes alvo na maioria dos tipos celulares com SHH sinalização activada, por conseguinte, os resultados sugerem que os vectores lentivirais eficientemente mudou a activação de sinais de SHH-Gli1. Os níveis de ARNm de caderina-E foram drasticamente reduzida pelo aumento da SHH /Gli1-expressão em células PC. Uma tendência semelhante foi observada com a proteína E-caderina.

invasão de células PC e de migração é regulada por SHH-Gli1 sinalização

Os dados dos ensaios de Transwell mostrou que um aumento do número de células a partir da linhas celulares PC invadido de uma forma dependente da dose Gli1 através do filtro de Matrigel-revestido dentro de 24 horas (

P

0,05; Figura 2A1-A9, B).

a SHH-Gli1 via de sinalização regula a proliferação celular PC

Nossos dados MTT mostrou que a L-Gli1i transdução /SHH não influenciou significativamente a proliferação celular em 24 horas. No entanto, após 48 horas, a proliferação das células PC aumentou com a transdução virai (Figura 2C1-C3).

metástases hepáticas após a injecção de células ASPC-1 em ratinhos nus é regulada por SHH-Gli1 sinalização

os nossos dados do modelo de ratinhos nus mostraram que 8 semanas após a injecção interna do baço de células ASPC-1, foram baço tumores em 8 de 10 ratos no grupo L-Gli1i, 8 dos 9 ratos no grupo CL, e 9 de 9 animais no grupo L-SHH. Os números médios de tumores em miniatura esplénicos foram de 2,6, 4,9 e 8,9, respectivamente. A incidência de metástases do fígado foi de 3 de 8 ratos no grupo L-Gli1i, 5 de 8 ratinhos no grupo L-C, e 8 de 9 animais no grupo L-SHH. Os números médios de metástases hepáticas foram de 2,7, 4,2 e 6,7, respectivamente (Figura 3, Tabela 2).

analisa cDNA microarray de genes alvo GLI1 em células ASPC-1

O gene Patched1 , um alvo directo de Gli1, foi regulado positivamente 1,71341 vezes neste estudo. Portanto, vamos definir regulamentação 1,7 vezes como o padrão gene alvo. Usando este limite, os dados do perfil do gene alvo mostrou que 278 genes foram regulados positivamente e 59 genes foram reprimidos em cima Gli1 em células AsPC-1. (Tabela 3). Os genes regulados foram classificados em diferentes categorias com base no bem documentada e estabelecida função biológica ou patológica. Os genes regulados por Gli1 pertencem principalmente pertencem às seguintes categorias: a invasão de células /migração, angiogénese, a sobrevivência celular, transporte, metabolismo, transdução de sinal, e a defesa do sistema imunitário (Figura 4). Em seguida, compararam estes genes-alvo com dados prévios através de pesquisa na base de dados Medline para triagem de genes diferencialmente expressos PC e genes-alvo via de sinalização SHH. Utilizando esta abordagem, foram identificados 58 genes regulados positivamente (Tabela 4) e um gene reprimidos mediante inibição Gli1 em nossa tela que foram sido declarado anteriormente não regulamentados de igual modo no PC. Usando o mesmo método, encontramos 22 genes regulados positivamente sobre a inibição Gli1 que foram encontrados anteriormente estar correlacionada com a sinalização do SHH (Tabela 4). Além disso, 15 dos 22 genes que foram relatados para ser sobre-expresso em PC foram envolvidos em metástase de células, incluindo ITGB4, ANG, VEGFA, S100A4, genes WNT5A, e TGFB2, bem como a sobrevivência da célula, tais como a BCL2, BIRC3, IGFBP6, KLF4, e PLAU. Pelo menos 8 genes (genes WNT5A, BCL2, IGFBP6, PTCH1, MSX2, TGFB2, HOXC6 e SOX13) foram previamente demonstrado ser alvos diretos da sinalização SHH [10], [11].

Discussão

neste estudo, os genes alvo de sobrevivência celular pode ser dividido em vários tipos: (1) os genes relacionados com a proliferação, tais como IGFBP6, IGF1R, IRS1, EGFR, e ALOX5, (2) genes relacionados com apoptose, tais como BIRC3 e Bcl-2, (3) os genes relacionados com o ciclo celular, tais como CCNG2, CDC2L6, e CDK6, e (4) CSC orCSCs genes associados à manutenção. O fenótipo de células estaminais predominantemente incluídos EMT, anti-tratamento, e marcadores de células estaminais. A via de sinalização de IGF foi uma via relacionada com a proliferação de chave e da família Bcl-2 foi uma importante via de sinalização apoptótica clássico. Foi relatado que Gli1 regula directamente a transcrição CCND e os nossos dados sugerem que pode regular CCNG2 do mesmo modo [7]. O gene codifica a múltiplas drogas ABCC3 proteína associada a resistência 3 (MRP3), que está envolvida na resistência à quimioterapia das células cancerosas [12]. Além disso, a regulação positiva e MTS CTPS downregulation também foi relatado de conduzir a resistência à quimioterapia [13]. Além disso, KLF4 é um marcador de células estaminais que promove a haste do cancro manutenção população de células CD59 e supra-regulação pode estar associado com a fuga imune de células de tumor [14], [15]. Curiosamente, HUS1 downregulation provável enfraquece os mecanismos de reparação de danos no ADN [16].

A angiogénese é necessária para a metástase do cancro, bem como para manutenção microambiente CSCs. A evidência substancial sugere que a sinalização de SHH activado pode ser uma via de sinalização durante a carcinogénese pâncreas iniciando-angiogénese, embora o seu mecanismo exacto não é conhecido [17]. Neste estudo, descobrimos que Gli1 upregulated significativamente factores pró-angiogénicos, incluindo ANG, VEGFA, PDGFA, TNFRSF12A, e IL-8, sugerindo que tem um importante papel regulador no PC angiogênese. Além disso, no presente estudo, o VEGF e PDGF foram supra-regulada, ao mesmo tempo, o que sugere que os mecanismos proangiogenesis da via de SHH não está apenas envolvida em células endoteliais (ECs) tuberformation, mas também da parede do vaso de maturação

.

foi relatado que a activação da via de sinalização SHH acompanhada EMT, EMT e é necessária para a migração de células que respondem a SHH durante a morfogénese do tecido. No entanto, não havia nenhuma evidência de que Gli1 regulados diretamente caracol ou Slug transcrição. No presente estudo, os dados de perfil de destino mostrou que SHH de sinalização na EMT envolvia uma complexa rede de crosstalk (Figura 5A). Os genes alvo relacionados com a EMT são resumidas como segue: (1) TGF-β via de sinalização:

TGFP2

e

TGFβR3

. Estudos anteriores mostraram que a sinalização de TGF-p é significativamente elevada em PC com mutação Smad4, resultando na perda de inibição do crescimento de células Smad4-dependente e independente aumento Smad4 EMT [18]. (2) Ras via de sinalização: RAB27B, RAB8B, RASA4, RHEBL1, RHOU, RRAS e RIN2. Os dados indicam a Ras /ERK1 /2 vias estão envolvidas na transformação de células mesenquimais PC [19]. (3) via de sinalização Wnt: Wnt5a. estudo anterior indicam que Wnt5a promove EMT através de uma via não clássica [20]. (4) via de sinalização PI3K /AKT: ITPKb. PI3K foi encontrado para reforçar a colonização nuclear caracol através da activação PAK1 da via de sinalização de AKT em EMT [21]. AKT funções como um ponto central para transduzir (factores de crescimento, incluindo a insulina, IGF-1 e EGF) extracelulares e intracelulares sinais (tais como tirosina-quinases receptoras activadas ou mutadas, PTEN, Ras e Src) [22]. (5) fator de crescimento e vias de sinalização do receptor:

IGF1R, IGFBP6, IGFL2, EGFR, PDGFA,

e

VEGFA

Estudos anteriores demonstraram que a ativação anormal destas vias promove tumor derivado do epitélio. expansão e progressão através da promoção de transições EMT-like. Em relação aos mecanismos, sinalização IGFR induz a expressão de factores de transcrição Snail e Zeb [23]. PDGF pode induzir EMT através da activação da via de sinalização Wnt [24]. VEGF e EGF pode aumentar de Caracol e expressão da proteína torção [25]. (6) As integrinas: I

TGA3, ITGB4,

e

ITGB6

. Tem sido relatado que as a3 e p4 subunidades pode fazer-se integrinas de ligação a laminina com outras subunidades, tais como α3β1 ou α6β4, e estas subunidades podem ser palmitoilada que pode contribuir para as interacções integrina-tetraspanina [26]. Os potenciais funções prometastatic destas subunidades de integrina, particularmente P4, foram relatados anteriormente e fosforilação da tirosina do site p4 resultados Shc vinculativas na desmontagem de hemidesmossomos e mobilização de integrina α6β4 sinalização ativado. Mobilizada interruptores α6β4 de queratina a associação de filamentos de actina e podem mediar a migração e invasão de isoformas de laminina [26]. (7) TM4SF:

TSPAN1 gene TSPAN1

sobre-expressão foi detectada em cancro do fígado, cancro da próstata, cancro gástrico, cancro do colo do útero e cancro colorectal [27].. Tem sido proposto que a expressão do gene TSPAN1 correlaciona-se com a proliferação celular e prognóstico do cancro. Nossos dados sugerem que TSPAN1, como membro do TM4SF, podem participar no processo de EMT de células PC. No entanto, continua a ser determinado como ele interage com integrinas, factores de crescimento, ou outras proteínas TM4S. (8) MicroRNAs:

miR-21

. Estudos têm mostrado que o miR-21 está associado com a metástase do PC e prognóstico e pode desempenhar um papel na expressão de TGF-β induzida por EMT [28], [29]. (9) S100A família de genes:

S100A4

. Tem sido relatado que S100A4 e E-caderina está inversamente regulada em diversos sistemas celulares e que S100A4 promove a expressão dos factores de transcrição essenciais, torção e caracol, no processo de EMT, bem como marcadores mesenquimais, incluindo vimentina e MMPs [30 ], [31].

interessante, os nossos dados sugerem que a rede molecular EMT mediadas por sinalização do SHH pode conter pelo menos dois ciclos importante feedback positivo em células PC. O primeiro é o feedback positivo entre SHH e sinalização TGF.

In vitro

e

in vivo

evidências sugerem a interferência entre TGFp e SHH resulta na indução recíproca. TGF regulada SHH e ativado Gli1 durante a indução EMT; no entanto, a sinalização SHH regulada TGFp2 e TGFBR3 como demonstrado neste e em um estudo anterior [32], [33]. O segundo ciclo de feedback positivo é entre sinalização de SHH e Ras. Anteriormente, estudos mostraram que a mutação K-ras era um mecanismo essencial de SHH e Gli1 regulação positiva em células PC e, neste estudo, descobrimos que Gli1 regulada vários genes Ras-relacionados para ativar Ras sinalização [34].

com base em estudos anteriores e os nossos dados, especula-se que esta rede molecular pode começar com

K-ras

mutações, seguido por SHH ativação de sinalização e, finalmente, o sinal de TGF une e forma-se uma retroalimentação positiva entre os três vias. O sinal de SHH foi continuamente reforçada através deste feedback positivo e promove diretamente EMT através da regulação de genes relacionados com a EMT-alvo GLI1, como

IGFR1, VEGF, EGF,

e

S100A4

. (Figura 5B). No entanto, este modelo de rede molecular pode ser mais complexa com a participação de proteínas de sinalização adicionais, tais como integrinas, PI3K /AKT e WNT.

Reconhecimentos

Agradecemos a todos os membros do Laboratório Central do Hospital Décima da Universidade de Tongji.