Abstract
Introdução
O câncer de pâncreas é um câncer agressivo e seu prognóstico permanece pobre. Portanto, a terapia eficaz adicional é necessário para aumentar e /ou complementar a terapia actual. CD147, alta expressão no câncer de pâncreas, está envolvido no processo metastático e é considerado um bom candidato para a terapia-alvo. imagiologia CD147-specfic poderia ser útil para a escolha de pacientes adequados. Portanto, avaliamos o potencial de um anticorpo monoclonal anti-CD147 plenamente humano 059-053 como uma tomografia nova emissão de positrões (PET) sonda para câncer de pâncreas.
Métodos
expressão CD147 foi avaliada em quatro linhas celulares de cancro do pâncreas (MIA Paca-2, PANC-1, BxPC-3, AsPC-1 e) e uma linha celular de rato A4 como um controlo negativo. Celular de ligação, ensaios de inibição e internalização competitivos foram realizados com
125I-,
67Ga-, ou
89Zr marcado 059-053.
In vivo
biodistribuição de
125I- ou
89Zr marcado 059-053 foi realizado em ratinhos portadores de MIA Paca-2 e A4 tumores. imagens de PET com [
89Zr] 059-053 foi realizado em modelos subcutâneos e camundongo ortotópico tumor.
Resultados
Entre quatro linhas celulares de cancro do pâncreas, MIA células Paca-2 apresentou a maior expressão de CD147, enquanto que as células A4 teve nenhuma expressão. coloração imuno-histoquímica mostrou que MIA Paca-2 xenotransplantes também altamente expresso CD147
in vivo
. 059-053 radiomarcado especificamente ligado em Mia Paca-2 células com elevada afinidade, mas não para A4. [
89Zr] 059-053 captação no MIA Paca-2 tumores aumentou com o tempo de dose injectada 11,0 ± 1,3% por grama (ID /g) no dia 1-16,9 ± 3,2% ID /g no dia 6, enquanto [ ,,,0],
125I] 059-053 captação foi relativamente baixa e diminuiu com o tempo, sugerindo que 059-053 foi internalizado em células tumorais
in vivo
e
125 I foi libertado das células. PET com [
89Zr] 059-053 tumores subcutâneos e ortotópicos claramente visualizadas.
Conclusão
[
89Zr] 059-053 é uma sonda de PET promissor para imagiologia expressão CD147 em câncer de pâncreas e tem o potencial para selecionar pacientes apropriados com tumores que expressam CD147 que poderiam ganhar benefício da terapia anti-CD147
Citation:. Sugyo a, Tsuji AB, Sudo H, Nagatsu K, Koizumi M, Ukai Y , et ai. (2013) Avaliação de
89Zr marcado Human Anti-CD147 anticorpo monoclonal como uma Tomografia Probe Positron Emission em um mouse modelo de cancro do pâncreas. PLoS ONE 8 (4): e61230. doi: 10.1371 /journal.pone.0061230
editor: C. Andrew Boswell, Genentech, Estados Unidos da América
Recebido: 24 de dezembro de 2012; Aceito: 07 de março de 2013; Publicação: 05 de abril de 2013
Direitos de autor: © 2013 Sugyo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi financiado pelo Instituto Nacional de Ciências radiológicas para TS. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de pâncreas é um câncer comumente diagnosticado ea oitava causa de morte por câncer em todo o mundo, sendo responsável por 278.684 novos casos estimados de câncer e 266.669 das mortes por câncer estimados [1] (GLOBOCAN 2008, http: //Globocan. iarc.fr/). pacientes com câncer pancreático apresentam sintomas menores na avaliação médica, ea natureza silenciosa da doença que não é aparente até o final do processo da doença contribui para um prognóstico muito pobre. Apenas 7% dos pacientes apresentam tumores localizados, potencialmente curáveis, no momento do diagnóstico e aproximadamente 50% dos pacientes com câncer de pâncreas são diagnosticados em estágios avançados da doença [2]. A taxa de sobrevida em 5 anos global entre os pacientes com câncer de pâncreas é de 6% nos Estados Unidos [2]. Portanto, a terapia anti-cancro eficaz adicional é necessário para aumentar e /ou complementar as estratégias de tratamento actuais, tais como cirurgia e quimioterapia /radioterapia, especialmente para pacientes com cancro metastático.
CD147 (os chamados EMMPRIN) é um 55- kDa da proteína transmembranar da superfamília das imunoglobulinas e está envolvido em muitas funções fisiológicas, tais como a espermatogénese, a implantação do embrião, activação dos linfócitos, a formação da rede neural nas primeiras fases de indução e de transportadores de monocarboxilatos [3]. CD147 expressa em muitos tipos de tumores, incluindo o câncer de pâncreas [4]. CD147 induz a expressão das metaloproteinases da matriz (MMPs), tais como MMP-1, MMP-2, MMP-9, MMP-MT1 e factor de crescimento endotelial vascular. Superexpressão de CD147 em células de cancro da mama por transfecção vetor de expressão resultou no crescimento do tumor aumentou e metástase [5]. Estas descobertas sugerem que a CD147 está envolvida na proliferação de invasão, metástase, e a angiogénese tumoral, e portanto, é um bom candidato para a terapia de cancro alvo. Depleção de CD147 por interferência de ARN ou anticorpo específico reduzido a proliferação, invasão, metástase de tumores e a formação de vasos sanguíneos, e, por conseguinte, os ensaios clínicos de terapia direcionada-CD147 foram realizados [3], [6], [7]. Embora a incidência de expressão CD147 é elevada (87%) no cancro pancreático [4], alguns tumores não expressam CD147, e, portanto, não são candidatos adequados para terapia direcionada-CD147. Por isso, é importante usar um método de imagem não invasivo para avaliar o estado CD147 num tumor individual no momento do planejamento do tratamento para selecionar pacientes apropriados para terapia alvo-CD147.
Recentemente, nós isolamos um romance totalmente monoclonal humano IgG
um anticorpo designado como 059-053 contra CD147 a partir de uma biblioteca de anticorpos humanos em larga escala construída usando um sistema de disposição de fagos que incorporaram um método de rastreio é altamente eficiente denominado isolamento de complexos antigénio-anticorpo por meio de solvente orgânico, com vivo do cancro do pâncreas células [8]. Este anticorpo induz citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) e inibe a proliferação celular de células cancerígenas pancreáticas [8], [9]. No presente estudo, nós radiomarcados 059-053, e avaliou o
in vitro
e
in vivo
propriedades como uma sonda nova tomografia por emissão de positrões (PET) para geração de imagens tumores CD147 expressam em uma modelo de cancro pancreático.
Materiais e Métodos
células
linhas celulares de cancro pancreático humano (MIA Paca-2, PANC-1, BxPC-3, e AsPC-1) foram obtidas a partir de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). células A4, estabelecidos a partir de células 3T3 de ratinho transfectadas com um vector de expressão de HER2-humano [10], foram utilizados como um controlo negativo. As células foram mantidas em meio RPMI 1640 (Sigma, St. Louis, MO, EUA) suplementado com 5% de soro fetal bovino (Sigma) numa incubadora humidificada mantida a 37 ° C com 5% de CO
2.
subcutânea e modelos ortotópicos rato tumor
o animal protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal do Instituto Nacional de Ciências radiológicas, e todas as experiências com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais sobre animais cuidados e manuseio. BALB /c-nu ratinhos macho /nu (5 semanas de idade, CLEA Japan, Tóquio, Japão) foram mantidos sob condições específicas isentas de patogénios. Para induzir um modelo de tumor subcutâneo, os ratinhos foram inoculados subcutaneamente com MIA Paca-2 (4 × 10
6) e A4 (1 × 10
6) células das coxas direita e esquerda, respectivamente, sob anestesia com isoflurano. Uma vez que as células A4 crescer mais rapidamente do que as células MIA Paca-2 em ratinhos, no dia da inoculação de cada linha celular foi ajustada para assegurar que os xenoenxertos de tumor eram de igual tamanho no momento da experiência (aproximadamente intervalo de 30 dias entre as duas inoculações). Para induzir um modelo de tumor ortotópico, que implantado cirurgicamente um tumor xenoenxertado no pâncreas como previamente descrito [11]. Resumidamente, um tumor subcutâneo foi ressecado assepticamente, tecidos necróticos foram removidos, e os restantes tecidos de tumor viáveis foram picadas em pedaços de cerca de 5 mm de diâmetro em PBS (Sigma). Os ratinhos receptores foram anestesiados com inalação de isoflurano, e a pele da parede abdominal foram incisão acima do pâncreas, do pâncreas foi cuidadosamente exposto, e um pedaço do tumor foi transplantado para a cauda do pâncreas, usando uma sutura de seda 6-0 (Alfresa Pharma, Osaka, Japão). O pâncreas foi devolvido para a cavidade peritoneal, e a pele e parede abdominal foram fechadas com uma sutura de seda 6-0.
A análise da expressão da proteína CD147
Western blotting e coloração por imunofluorescência foram realizadas como anteriormente descrito [12], [13]. Resumidamente, para a transferência de Western, o lisado celular foi resolvido por electroforese em dodecil em gel de poliacrilamida de sulfato de sódio, transferida para um fluoreto de polivinilideno (PVDF) da membrana (Hybond-P, GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) e feito reagir com um anticorpo de coelho anti CD147-monoclonal anticorpo (EPR4053, Abcam, Cambridge, Reino Unido) durante 1 h à temperatura ambiente. Fez-se reagir o anticorpo primário com um anticorpo anti-coelho-peroxidase de rábano ligada (GE Healthcare) e a membrana foi visualizada utilizando um kit ECL Plus (GE Healthcare). Depois que as imagens foram capturadas utilizando um sistema de imagem LAS-3000 (Fujifilm, Tóquio, Japão), os anticorpos na membrana de PVDF foram removidos com tampão de extracção e corados a membrana com Azul Brilhante de Coomassie (ATTO, Tóquio, Japão) como um controlo de carga. A intensidade de cada banda foi quantificada utilizando o software ImageJ (Instituto Nacional de Saúde Mental, Bethesda, MD, EUA). Para a coloração de imunof luorescência, as células foram cultivadas em lamelas de vidro e fixadas em metanol frio durante 5 min. A ligação não especifica do anticorpo foi bloqueada através da aplicação de reagente de Block Ace (Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japão), com soro de cabra a 10% durante 30 min. As células foram incubadas com 059-053 como o anticorpo primário [8] a noite a 4 ° C. Um anticorpo anti-humano secundário conjugado com Cy3 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, EUA) foi aplicada durante 30 minutos à temperatura ambiente. Os núcleos foram corados com DAPI no meio de montagem. As imagens foram obtidas com um tempo de exposição de 500 ms para CD147 utilizando um microscópio de fluorescência (Olympus, Tóquio, Japão). A intensidade da coloração de CD147 em cada linha celular foi quantificada utilizando o software ImageJ. Para coloração imuno-histoquímica, os ratinhos portadores de tumores subcutâneos (MIA Paca-2 e A4) foram sacrificados e os tumores foram removidos rapidamente e congelados em composto de corte-temperatura óptima (Sakura Finetek Japão, Tokyo, Japão). secções secos (10 mm de espessura) foram fixadas com metanol frio e foram imunocoradas com anticorpo de cabra anti-CD147 (AF972, R D Systems, Minneapolis, MN, EUA). A ligação não específica foi bloqueada por Block Ace regente com soro de cabra a 10%. As amostras foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com o anticorpo primário. Um anticorpo secundário conjugado com peroxidase (mancha simples MAX-PO, Nichirei Biosciences, Tóquio, Japão) foi aplicada durante 30 minutos à temperatura ambiente e depois visualizada com um reagente de coloração de diaminobenzidina (DAB solução simples mancha, Nichirei Biosciences).
a marcação radioactiva do anticorpo
Para
67Ga e
rotulagem 89Zr, o anticorpo monoclonal anti-CD147 humana 059-053 (IgG
1) [8] foi conjugado com
p
-isothiocyanatobenzyl desferrioxamina-B (DF; Macrocyclics, Dallas, TX, EUA) com DF ao anticorpo razão molar de 03:01, tal como previamente descrito [14]. A proporção da conjugação de DF para o anticorpo foi estimada como sendo de 1,0 a 1,3
anticorpo 67Ga-DF-conjugado a
relação de 67Ga-DF determinada por cromatografia de exclusão de tamanho utilizando uma coluna PD10 (GE Healthcare) antes da purificação. quelato não conjugado foi removido utilizando uma coluna de centrifugação de Sephadex G-50 (GE Healthcare). Para
67Ga rotulagem, o anticorpo DF-conjugado (45 ug em 10 uL de PBS) foi incubado com 600 kBq de
67Ga-cloreto de (70-80 MBq /mL, Nihon Medi-Physics, Tóquio, Japão) durante 1 h à temperatura ambiente, e anticorpos marcados radioactivamente foram purificados numa coluna de centrifugação de Sephadex G-50. O rendimento radioquímico de
67Ga-anticorpo marcado foi de 45% a 63%, a pureza radioquímica foi superior a 96%, e a actividade específica foi de 6 a 8 kBq /mg determinada por cromatografia em coluna PD10. Para
rotulagem 89Zr,
89Zr foi produzido por uma (p, n) reacção em
89Y (novos metais e produtos químicos, Waltham Abbey, Reino Unido) num vaso de cerâmica de alumina (Kyocera, Kyoto, Japão), mediante irradiação vertical, utilizando a NIRS FAV-930 ciclotrão e purificada com uma coluna de hidroxamato por um aparelho de recuperação /purificação automatizado tal como previamente descrito [15]. O anticorpo DF-conjugado (100 ug em 20 uL de PBS) foi incubado com 2,8 a 5,2 MBq de
89Zr-oxalato (3,7-5,6 GBq /ml em 1 M de oxalato, pH 7-8) durante 1 h à temperatura ambiente , e anticorpos marcados radioactivamente foram purificados numa coluna de centrifugação de Sephadex G-50. O rendimento radioquímico de
anticorpo 89Zr-marcado foi de 54% para 86%, a pureza radioquímica foi superior a 96%, e a actividade específica foi de 16 a 43 kBq /ug determinado por cromatografia em camada fina usando 50 mM de ácido dietilenotriaminopentacético ( Sigma, pH 7) como fase móvel. rotulagem
125I foi realizada com Na
125I (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA) e cloramina-T (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japão) tal como descrito anteriormente [12], resultando em actividades específicas que variam de 119 a 669 kBq /ug.
In vitro
ensaio
ensaios de ligação celular, inibição competitiva, e interiorização, foram conduzidos como descrito anteriormente [16]. Resumidamente, num ensaio de ligação celular, diluído seriadamente células MIA Paca-2 ou A4 em PBS com 1% de BSA (Sigma) foram incubados com o anticorpo radiomarcado em gelo durante 60 min. Após lavagem, a radioactividade ligada às células foi medida. A imunorreactividade de anticorpos radiomarcados foi estimada de acordo com o método de Lindmo
et al
. [17]. Num ensaio de inibição competitiva, o anticorpo marcado radioactivamente foi incubado com células MIA Paca-2 na presença de concentrações variáveis do anticorpo não marcado em gelo durante 60 min. Após lavagem, a radioactividade ligada às células foi contada. A constante de dissociação foi estimada mediante a aplicação de dados a um modelo de ligação de um local competitiva utilizando o software GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA). Em um ensaio de internalização, as células MIA Paca-2 foram pré-incubadas em meio de cultura com
125I- ou
anticorpo no gelo 67Ga marcado para 60 min. Após lavagem, as células foram recolhidas a cultura prosseguiu a 37 ° C ou sobre gelo em meio fresco sem anticorpos radiomarcados. Em vários pontos de tempo, o sobrenadante e as células foram separadas por centrifugação. ácido tricloroacético foi adicionado ao sobrenadante em gelo e, em seguida, separado por centrifugação para determinar a fracção não ligada a proteína (sobrenadante) e fracção ligada à proteína (sedimento). As células foram lavadas com tampão acidico e, em seguida, separado por centrifugação para determinar tanto a fracção ligada à membrana (sobrenadante) e fracção internalizado (sedimento). Nós realizou estes
in vitro
ensaios em duplicado.
Biodistribuição
Quando os tumores subcutâneos atingiu um diâmetro de aproximadamente 10 mm, os ratos foram injectados por via intravenosa com a mistura de
89Zr- e
anticorpo marcado com 125I (37 kBq cada). A dose total injectada de proteína foi ajustada a 20 ug por ratinho por meio da adição de anticorpo não marcado. A 1, 2, 4, e 6 dias após a injecção de anticorpo marcado radioactivamente, cinco ratinhos em cada ponto de tempo foram sacrificados e o sangue foi obtido a partir do coração. Tumores e principais órgãos foram removidos e pesados, e as contagens de radioactividade foi medida usando um contador gama (PerkinElmer). Os dados foram expressos como a percentagem de dose injectada por grama de tecido (% ID /g). Os dados são expressos como média ± DP. dados de absorção de tumor foram analisados por ANOVA com o método Student-Newman-Keuls teste de comparação múltipla.
PET /tomografia computadorizada (TC)
Realizamos imagens em dois ratinhos portadores de tumores subcutâneos (MIA Paca-2 e A4), com aproximadamente 10 mm de diâmetro e um rato tendo um tumor ortotópica (MIA PACA-2 sozinho) 3 semanas após a implantação. Os ratinhos foram injectados com cerca de 3,7 MBq de
89Zr-anticorpo marcado na veia da cauda. A dose de proteína injectada foi ajustada a 100 ug por rato através da adição de anticorpo não marcado. aquisição de dados PET foi realizado em 30 min e 1, 2, 4 e 6 dias após a administração de 10 a 20 min, utilizando um sistema PET pequenos animais (Inveon, a Siemens Medical Solutions, Malvern, PA, EUA), sob anestesia isoflurano. A temperatura corporal foi mantida a 36 ° C a 37 ° C por uma lâmpada e uma almofada de aquecimento durante a verificação. As imagens foram reconstruídas usando um máximo 3D
a posteriori
(18 iterações com 16 subconjuntos, P = 0,2), sem correção de atenuação. captação do traçador foi expressa como% ID /g. A região de interesse foi elaborado manualmente sobre tumores e captação do traçador foi quantificada utilizando software Pro ASI (Siemens Medical Solutions). Após a digitalização PET de um modelo de camundongo ortotópico de tumor, CT imagens foram adquiridas com uma fonte de raios-X fixado em 90 kVp e 200 mA utilizando um sistema de CT de pequenos animais (R_mCT2, Rigaku, Tóquio, Japão). Depois de imagem, realizamos experimentos de biodistribuição para confirmar os resultados PET.
Resultados
expressão da proteína CD147 em células de cancro do pâncreas e xenotransplantes
Nós determinamos a expressão da proteína CD147 em quatro câncer pancreático humano linhas de células MIA (Paca-2, PANC-1, BxPC-3, AsPC-1 e) e a linha celular de rato A4 como um controlo negativo, utilizando transferência de western e técnica de imunofluorescência. CD147 expresso nas quatro linhas celulares de cancro pancreático humano, mas não em A4 (Figura 1A e B). MIA Paca-2 apresentou a expressão mais elevado, seguida de AsPC-1, PANC-1 e BxPC-3 tal como determinado por análise de transferência de Western (Figura 1A). MIA Paca-2 também mostraram a mais alta expressão como determinado por coloração por imunofluorescência, mas a expressão em AsPC-1, que foi o segundo mais alto em Western blotting, foi menor do que a de PANC-1 (Figura 1B). proteína CD147 foi localizada principalmente na membrana plasmática das células que expressam CD147 (Figura 1B). CD147 expressão não foi detectada em células A4 por transferência de Western ou imunofluorescência. Em seguida, realizamos CD147 coloração imuno-histoquímica de MIA Paca-2 e A4 tumores subcutâneos. Em MIA Paca-2 tumores, células cancerosas viáveis foram intensamente com detalhes, mas não células necróticas ou estroma (painel superior Figura 1C). Nenhuma expressão de proteína foi detectada em tumores A4 (Figura 1C painel inferior).
(A) análise de transferência de Western do ligado celular total utilizando o anticorpo anti-CD147 (painel superior) e Coomassie Brilliant coloração com azul da mesma membrana de PVDF como um controlo de carga (painel inferior). O rácio de intensidade da banda é mostrado sob os painéis. (B) Localização subcelular da proteína CD147 determinado por coloração por imunofluorescência com anticorpo anti-CD147 (vermelho) e de coloração ácido nucleico DAPI (azul). A proporção da intensidade de CD147 é mostrado no lado direito dos painéis. (C) CD147 expressão em MIA Paca-2 (superior) e A4 tumores xenoenxerto (inferior) determinado por coloração imuno-histoquímica de secções congeladas (10 mm de espessura).
In vitro
caracterização de radiomarcado 059-053
Nós marcado anticorpo monoclonal anti-CD147 humana 059-053 com
125I,
67Ga, ou
89Zr e realizou um ensaio de ligação celular. A ligação de [
125I] 059-053, [
67Ga] 059-053, e [
89Zr] 059-053 a 5 × 10
6 MIA células Paca-2 foi de 63%, 73 %, e 94%, respectivamente (Figura 2A). No entanto, a ligação de [
125I] 059-053 de 5 × 10
6 A4 células foi de apenas 1,3% (dados não mostrados). A fracção imunorreactiva de [
125I] 059-053, [
67Ga] 059-053, e [
89Zr] 059-053 em células MIA Paca-2 foi estimada como sendo 0,80, 0,96, e 1,00 , respectivamente. O sítio de dissociação em equilíbrio constante e ligação de 059-053 foi estimada como sendo de 15,3 nM e 5,4 × 10
4 locais por célula MIA Paca-2, respectivamente, por ensaio de inibição competitiva (Figura 2B). Foi examinada a mudança temporal na localização radioactividade de [
67Ga] células 059-053 e [
125I] 059-053 no MIA Paca-2. A fracção de membrana de células-bound diminuiu rapidamente, ao passo que a fracção ligada à proteína no meio de cultura aumentou rapidamente para ambos os anticorpos marcados radioactivamente (Figura 2C e D). Aproximadamente 10% de [
67Ga] 059-053 no máximo foi internalizado após incubação (Figura 2C). Quando as células foram incubadas em gelo, a fracção ligada à membrana não se alterou durante pelo menos 3 h (dados não mostrados).
(A) ensaio de ligação celular para [
89Zr] 059-053 (branco triângulos), [
67Ga] 059-053 (círculos brancos) e [
125I] 059-053 (círculos pretos). (B) ensaio de inibição competitiva para [
125I] 059-053 (círculos pretos). ensaio de internalização de [
67Ga] 059-053 (C) e [
125I] 059-053 (D). Alterações em% da radioactividade total para cada fracção são registadas em função do tempo de incubação a 37 ° C (círculos pretos, fracção internalizados; círculos brancos, fracção ligada à membrana; triângulos pretos, fracção ligada à proteína no meio de cultura; marcas de cruz, não- fracção no meio de cultura ligada a proteína). Estes ensaios foram realizados em duplicado. Os dados representam cada replicar em A e B e significa em C.
Em biodistribuição vivo
de radiomarcados 059-053
experimentos de biodistribuição usando
89Zr- e
marcado com 125I 059-053 foram realizados em ratinhos nus portadores de ambos MIA Paca-2 e tumores de xenoenxerto A4 (n = 5 em cada ponto de tempo). [
89Zr] 059-053 absorção em MIA Paca-2 tumores foi de 11,0 ± 1,3% ID /g no dia 1, que aumentou com o tempo atingindo 16,9 ± 3,2% ID /g no dia 6 (Figura 3A). Em contraste, a absorção em tumores A4 (não-CD147-expressar) foi baixa e diminui com o tempo (Figura 3A). MIA razão de captação Paca-2-a-A4 de [
89Zr] 059-053 foi de 1,7 ± 0,2 no dia 1 e aumentou com o tempo (7,1 ± 0,5 no dia 6). A captação de [
89Zr] em 059-053 principais órgãos normais, incluindo o pâncreas era baixa e diminuiu gradualmente com o tempo, excepto para o osso (Figura 3A). O rácio de captação tumoral-a-pâncreas de [
89Zr] 059-053 foi de 9,1 ± 1,5 no dia 1 de MIA Paca-2 tumores, e aumentou para 30,0 ± 6,7 no dia 6. MIA Paca-2 captação tumoral de [
125I] 059-053 foi de 4,6 ± 0,5% ID /g no dia 1 e persistiu até o dia 2, (4,6 ± 1,6% ID /g), mas diminuiu em seguida (Figura 3B). A absorção nos principais órgãos normais de [
125I] 059-053 diminuiu gradualmente com o tempo, incluindo osso (Figura 3B). [
89Zr] 059-053 captação no MIA Paca-2 tumores em todos os momentos foi significativamente maior em comparação com a de tumores A4 e [
125I] 059-053 captação no MIA Paca-2 e A4 tumores (
P Art 0,01)
As amostras foram coletadas e pesadas, e a radioactividade foi medida no dia 1 (barras brancas), 2 (barras de ponto), 4 (barras cinza) e 6 (preto. bares) após injecção intravenosa de 37 kBq cada um de [
89Zr] 059-053 (A) e [
125I] 059-053 (B). Os dados são expressos como média ± SD (n = 5). *
P
. 0,01 vs. [
89Zr] 059-053 absorção de tumor em cada ponto de tempo à análise de variância com o método Student-Newman-Keuls teste de comparação múltipla
PET imagem de camundongos portadores de tumor com [
89Zr] 059-053
Para confirmar o resultado do estudo de biodistribuição, realizamos imagem PET com [
89Zr] 059-053. Serial imagens PET em dois modelos de tumores subcutâneos de rolamento MIA Paca-2 e A4 tumores foram obtidos aos 30 min, e nos dias 1, 2, 4 e 6 após a injecção. Aos 30 min, a radioactividade numa acumulação de sangue estava muito alta, enquanto que em MIA Paca-2 e A4 tumores foi baixa com nenhuma diferença entre os dois (Figura 4A). No dia 1, a absorção em MIA Paca-2 tumores (10,8% ID /g) foi acentuadamente aumentada e maior do que nos tumores A4 (6,6% ID /g), e a actividade de fundo foi reduzido. O tumor MIA Paca-2 captação aumentada a partir de 12,2% ID /g no dia 2 para 17,5% ID /g no dia 6, enquanto que a actividade de fundo continuou a diminuir, o que resulta em um aumento no contraste de MIA Paca-2 tumores ao longo tempo (Figura 4A). A4 absorção do tumor diminuiu gradualmente a partir de 6,6% ID /g no dia 1 para 4,1% ID /g no dia 6. Estes dados foram basicamente consistentes com os resultados do estudo de biodistribuição. imagens PET /CT no modelo de tumor ortotópico obtidas no dia 6 mostrou que o PET com [
89Zr] 059-053 podia visualizar o tumor implantado ortotópico localizado na cauda do pâncreas (Figura 4B). A partir de dados de PET no modelo ortotópico, captação tumoral de [
89Zr] 059-053 foi de 8,6% ID /g no dia 6. A partir de dados de biodistribuição após PET, [
89Zr] 059-053 captação na mesma ortotópico do tumor era de 15,5% ID /g. Uma vez que o tamanho do tumor ortotópico foi de aproximadamente 5 mm de diâmetro, o efeito do volume parcial poderia afetar os dados quantitativos de PET.
(A) imagens de PET série (intensidade de projeção máxima) de um rato nu tendo MIA PaCa- 2 (seta amarela) e A4 (seta branca) tumores xenoenxerto em 30 min, e nos dias 1, 2, 4 e 6 após a injeção intravenosa de 3,7 MBq [
89Zr] 059-053. imagens de PET do mesmo rato são mostrados em configurações de escala diferentes. (B) Coronal (superior) e transaxial (inferior) imagens de PET /CT no modelo de cancro pancreático ortotópico do mouse (seta amarela, MIA Paca-2) no dia 6 após a injecção.
Discussão
o câncer de pâncreas é um dos males humanos mais letais, ocupando o quinto e quarto entre morte relacionada ao câncer em homens e mulheres, respectivamente, nos países economicamente desenvolvidos [1]. Seu prognóstico é muito pobre ea taxa de sobrevida em 5 anos para pacientes nos Estados Unidos com câncer metastático localizado e distante é de 22% e 2%, respectivamente [2]. Portanto, a terapia anti-cancro eficaz adicional é necessário, especialmente para pacientes com cancro metastático. CD147 altamente expressa no cancro pancreático [4] e está envolvida no processo de metástase [3], e, por conseguinte, é considerado um bom candidato para a terapia do cancro orientada [3]. imagem não invasivos específicos do CD147 poderia ser útil para selecionar pacientes apropriados com maior probabilidade de se beneficiar da terapia anti-CD147. No presente estudo, avaliou-se a
in vitro
e
In vivo
propriedades de um novo anticorpo monoclonal totalmente humano 059-053 que reconhece CD147, e marcado com um emissor de positrões
89Zr, para desenvolver uma nova sonda PET para detectar a expressão CD147 no câncer de pâncreas.
primeiro, avaliamos a expressão da proteína CD147 de quatro linhas celulares de cancro do pâncreas (MIA Paca-2, PANC-1, BxPC-3, e AsPC-1) através de western blotting e coloração por imunofluorescência para seleccionar uma linha celular de cancro pancreático adequado para avaliar radiomarcado 059-053. A linha de células MIA Paca-2 apresentou a expressão mais elevada conforme determinado por transferência de Western e análise de imunofluorescência. Além disso, constatou-se que as células MIA Paca-2 formado tumores subcutâneos e ortotópico em murganhos nus e expressão elevada CD147 nestes tumores foi determinado por coloração imuno-histoquímica. células A4 mostrou nenhuma expressão da proteína CD147, quer
in vitro
ou
in vivo
. Por isso, escolhemos células MIA Paca-2 como um controle positivo e células A4 como um controlo negativo para a sequência da avaliação.
Em seguida, radiomarcados 059-053 com
125I,
67Ga, ou
89Zr e avaliados os seus
in vitro
propriedades. ligação celular e ensaios de inibição competitiva revelou que 059-053 especificamente ligada a MIA Paca-2 células com afinidade elevada, mas não às células A4. A fracção imunorreactiva de anticorpos marcados radioactivamente foi superior a 0,8, indicando que a perda de imunorreactividade por procedimentos de radiomarcação foi mínima. O ensaio mostrou que a internalização fracções se ligam às proteínas do meio de cultura aumentou rapidamente após a incubação a 37 ° C, e a fracção foi internalizado baixo. Isto sugere que o complexo anticorpo-CD147 é facilmente separada da membrana de plasma nas condições /procedimentos desta experiência internalização. No presente estudo, embora empregue
67Ga em nome de
89Zr para o ensaio de internalização, este resultado é considerado consistente com que o uso de anticorpo
89Zr marcado porque o quelato (DF) é comum entre dois radiometais, estes radiometais com complexo DF é conhecido por ser estável
in vitro
e
in vivo
[18], [19], [20], [21], [22], e biodistribuição foi relatado para ser semelhante entre
68Ga- e
anticorpo 89Zr marcado com [20]. Em contraste com o resultado do ensaio de internalização, o
in vivo
estudo de distribuição demonstrado que a absorção de [
89Zr] 059-053 no MIA Paca-2 tumores foi muito alto e aumentou com o tempo, sugerindo que o complexo CD147-anticorpo não se soltou da membrana
in vivo
. Além disso, a diferença no padrão de absorção de tumor entre [
89Zr] e 059-053 [
125I] 059-053 sugere fortemente que foi marcado radioactivamente 059-053 internalizado nas células após a ligação com CD147 na superfície da célula
in vivo
. Após o metabolismo no interior das células,
atividade 125I iria ser apuradas a partir de células, enquanto
atividade 89Zr seriam retidos nas células. Tomados em conjunto, tripsinização das células causada provavelmente os resultados foi observado no ensaio de internalização, embora a duração da tripsinização foi feito o mais curto possível para minimizar os danos a CD147 na superfície da célula pela tripsina. No presente caso, o
in vivo
distribuição não foi totalmente recapitulou pelas
in vitro
experimentos. É digno de nota que o
in vivo estudo
com xenoenxertos subcutâneos demonstrou que [
89Zr] 059-053 altamente acumulado no MIA Paca-2 tumores, mas não em tumores A4. Isto foi confirmado por imagens de PET de série, o que indica que [
89Zr] 059-053 é uma sonda de PET promissora para a detecção de tumores que expressam CD147-e na selecção de pacientes apropriados para a terapia de anti-CD147. Os estudos de biodistribuição mostraram que a absorção de [
89Zr] 059-053 nos principais órgãos normais diminuiu com o tempo, exceto para o osso, o que não é provável que seja a absorção real de anticorpos, mas osso-seeking
Catabólitos 89Zr da mesma quanto a outros antigénios de [21], [22], [23], [24]. Dado que o nosso anticorpo anti-CD147 059-053 não se ligar a CD147 de rato, os nossos resultados no modelo de murídeo não podem prever totalmente a distribuição em pacientes humanos. expressão CD147 é relatado para ser elevado na maioria dos tecidos de câncer, mas é limitado em tecidos normais [4]. A cintigrafia com
131I-anticorpo anti-CD147 F (ab ‘)
2 em pacientes com carcinoma hepatocelular (HCC) mostrou absorção menor em órgãos normais do que em tecidos de carcinoma hepatocelular [25]. Portanto, o nosso anti-CD147 é esperado anticorpo 059-053 para mostrar baixa acumulação em órgãos normais de pacientes, embora mais estudos clínicos serão necessários para avaliar com precisão a captação de órgãos normal.
modelos de tumores subcutâneos são ferramentas poderosas para oncológico investigações, mas nem sempre estes modelos podem imitar achados clínicos.