Abstract

Fundo

A apolipoproteína A-II (ApoA-II) é regulada negativamente no soro de pacientes com adenocarcinoma do pâncreas ductal (PDAC), que pode ser devido a aumentar a utilização de alta lipoproteína de baixa densidade (HDL) lipídico por tecido câncer pancreático. Este estudo examinou a influência do exógeno ApoA-II na absorção de lipídios e crescimento celular no câncer de pâncreas (PC), tanto

in vitro Comprar e

In vivo

.

Métodos

Cryo microscopia Eletrônica de transmissão (TEM) examinou a influência de ApoA-II na morfologia da emulsão SMOFlipid. A influência de ApoA-II na proliferação de linhas celulares de cancro foi determinada através da sua incubação com o lípido +/- ApoA-II e anticorpo anti-SR-B1. Lipid foi marcado com o fluoróforo, fez, para traçar a absorção de lipídios por células cancerosas

in vitro

por microscopia confocal e

in vivo

no PDAC paciente tumores de xenoenxerto derivados (PDXT) por imagem de fluorescência. Tipo-1 scavenger receptors classe B (SR-B1) expressão em linhas celulares e em PDAC PDAC PDXT foi medido por transferência de Western e imuno-histoquímica, respectivamente.

Resultados

ApoA-II espontaneamente convertido lípido emulsão em muito pequena rHDL unilamelar como vesículas (rHDL /a-II) e de absorção de lípidos aumentada em PANC-1, CFPAC-1 e células primárias de tumor como demonstrado por microscopia confocal. expressão SR-B1 foi de 13,2, 10,6, 3,1 e 2,3 vezes superior em PANC-1, MiaPaCa-2, CFPAC-1 e BxPC3 linhas celulares do que a linha normal pancreática de células (HPDE6) e 3,7 vezes maior no tecido PDAC que no pâncreas normal . ApoA-II mais lípidos aumentou significativamente a absorção de lípido marcado e o crescimento celular promovido em PANC-1, MiaPaCa-2, CFPAC-1 e células BxPC3 que foi inibida pelo anticorpo anti SR-B1. Além disso, ApoA-II aumentou a absorção de lipídios em xenoenxertos de 3,4 vezes.

Conclusão

Nossos dados sugerem que ApoA-II aprimorar alvo potencial dos lípidos no câncer de pâncreas que pode ter imagens e drogas potencialidades de entrega

Citation:. Julovi SM, Xue A, Thanh LE TN, Gill AJ, Bulanadi JC, Patel M, et al. (2016) A apolipoproteína A-II Plus Emulsão Lipídica realçar o crescimento celular através de SR-B1 e Target cancro do pâncreas

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 11 (3): e0151475. doi: 10.1371 /journal.pone.0151475

editor: Yingmei Feng, Pequim chave do Laboratório de Prevenção e Pesquisa do Diabetes, CHINA

Recebido: 03 de setembro de 2015; Aceito: 29 de fevereiro de 2016; Publicação: 22 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Julovi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e suas Informações de Apoio arquivo

Financiamento: Parte deste estudo foi apresentado e premiado como melhor poster na New Horizons 2014 e da Reunião de Pesquisa Científica, 17-19 novembro de 2014. este estudo não tem foi publicado em outro lugar ou não está em consideração para uma publicação. O estudo foi suportado pela fundação CanSur e em parte pelo Fundo de Ensino Pesquisa Ramsay, mas não têm nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. filiação comercial dos autores no CSIRO não desempenhou qualquer papel no estudo e não tem quaisquer interesses concorrentes relativos ao emprego, consultoria, patentes, produtos em desenvolvimento e produtos comercializados

Conflito de interesses:. Os autores não têm conflito de interesses. filiação comercial dos autores no CSIRO não desempenhou qualquer papel no estudo e não tem quaisquer interesses concorrentes relativos ao emprego, consultoria, patentes, produtos em desenvolvimento e produtos comercializados.

Introdução

foi encontrado apolipoproteína soro a-II (ApoA-II) para estar deprimido em pacientes com câncer pancreático e era um potencial biomarcador de diagnóstico [1]. Este trabalho tem sido confirmada pela Honda e colaboradores [2] e outros [3]. ApoA-II é um componente das lipoproteínas de alta densidade (HDL), onde ele tem um papel importante no direccionamento do destino do metabolismo do lípido no HDL. O papel mais importante para o HDL é a entrega do colesterol dos tecidos periféricos para o fígado, onde é metabolizada em sais biliares ou excretado para a bílis. O tipo-1 receptor de limpeza classe B (SR-B1) é prevalente em hepatócitos e atrai HDL onde o lipídica é endocitado [4, 5] ou difusa [6, 7] em hepatócitos.

SR-B1 é um receptor multi-ligando e altamente expressos numa variedade de células tumorais incluindo próstata, da mama, colo-rectal e células de cancro do ovário [8]. A lipoproteína na superfície de HDL se liga a SR-B1 e proporciona a sua lípido para dentro da célula através de um poro formado por SR-B1 aumentando a absorção de éster de HDL-colesterilo (CE) [9], um nutriente essencial para a proliferação de células malignas e metástase [10, 11]. Trinta por cento de HDL está associado com a ApoA-II, que é pensado para fazer a HDL menor do que com a ApoA-I sozinho e faz com que o HDL /ApoA-II menos atraídas para o SR-B1 hepática [12]. Além disso, a ApoA-II mantém os níveis de HDL, em parte, por inibição da lipase hepática [13]. Estes resultados em um tempo relativamente longo para a circulação de HDL /ApoA-II. ApoA-II altera a ligação de HDL para o SR-B1 em diferentes tecidos e é particularmente atraídos para o tecido esteroidogênica [14] em que o colesterol é utilizado para a síntese da hormona de crescimento rápido, mas as células cancerosas também requerem colesterol para as membranas celulares [15]. As células cancerosas têm uma expressão aumentada de SR B1in-relação para a expressão em suas células não-malignas de origem [16, 17] e é possível que isto resulta em aumento da captação de HDL por o tecido canceroso, que é uma explicação para a redução no soro de ApoA-II em casos PDAC [1-3]. Curiosamente câncer pancreático não se acumula fluodesoxiglucose (FDG) com força suficiente para ser confiável como um agente de contraste para Positron Emission Tomography (PET) [18] o que provavelmente indica que o câncer de pâncreas tem uma preferência por lipídios como fonte de calorias principal [19]. Se lipídica é a principal fonte de energia para o tecido do câncer de pâncreas é possível que HDL é uma importante fonte deste lipídico. metabolismo energético das células está envolvido na carcinogênese complexo [20, 21]. O papel do metabolismo do colesterol no processo da carcinogénese também é relatado [22-24] .Cancer e outras células que proliferam rapidamente requerem colesterol e outros componentes de membrana para optimizar o crescimento [25]. HDL têm sido implicados na entrega do colesterol em algumas doenças malignas, incluindo cancro da mama [26], do cancro do ovário [8], tumores adrenocorticais [27] e o cancro da próstata [28]. É provável que o câncer de pâncreas é também avidamente utilsing HDL.

A hipótese testada neste trabalho é que ApoA-II irá acelerar a absorção de lipídios no tecido do cancro do pâncreas e, assim, aumentar o crescimento celular. Além disso, os autores sugerem que o nível de expressão de SR-B1 serão correlacionar-se com a absorção de lípido por células de cancro do pâncreas e será maior que a do tecido normal.

Materiais e Métodos

celular cultura

PANC-1, MiaPaCa-2, BxPC3 e CFPAC-1 linhas celulares de cancro do pâncreas foram presentes de Prof. Barry Allen (St George Hospital, NSW, Austrália) e epitelial ductal pancreático humano normal (HPDE6) células [29] eram do Dr. Chris Scarlett (School of Environmental Ciências da Vida da Universidade de Newcastle, NSW, Austrália). linha de células de cancro do pulmão A549, linhas celulares de cancro da mama T47D e MCF7 foram gentilmente cedido pelo Prof. Ross Davey (Instituto Kolling de Pesquisa Médica, Royal North Shore Hospital, NSW, Austrália). linha de células de câncer de próstata PC3 foi gentilmente cedido pelo Prof. Qihan Dong (Clínica Escola Central, Instituto Bosch, The University of Sydney, NSW, Austrália). Excepto linha celular HPDE6, todas as linhas de células foram adquiridas a partir da ATCC. As linhas celulares foram digitados pelo curta repetição em série de perfis e eles conformado com as normas de referência ATCC (CellBank, Westmead, NSW, Austrália). BxPC3, CFPAC-1, A549, linhas de células T47D e MCF7 foram cultivadas em meio RPMI 1640, PANC-1 e MiaPaCa-2 foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) e células PC3 de próstata foram cultivadas em F-12K (Gibco, BRL) com 10% de FBS, contendo soro bovino fetal a 10% (FBS; ICN, Aurora, OH) em 75 cm

2 frascos a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera. HPDE6 células foram cultivadas em meio de queratinócito isento de soro (FSK), suplementado por factor de crescimento epidérmico e extracto de pituitária de bovino (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY).

cultura primária

Humana amostras de tumor pancreático foram obtidos no Royal North Shore Hospital (Sydney, Austrália), com o seu consentimento informado por escrito, seguindo protocolos aprovados pelo Comité de Northern Sydney Distrito local de Saúde Ética em Pesquisa (NSLHD HREC) (número de protocolo: 0909-227M, Sydney , Austrália). culturas de células de tumor primário foram estabelecidas pelo crescimento do explante de pequenos fragmentos (≈1 mm) dissecadas a partir dos tecidos tumorais PDAC, colocados em DMEM (pH 7,4) suplementado com FBS inactivado por calor a 10% com 50 unidades /ml de penicilina /estreptomicina. As culturas foram utilizadas após a passagem 3 para evitar a contaminação residual por macrófagos [30]. Todas as culturas foram recolhidas sob condições de crescimento e soro idênticos. Nós usamos células carência de soro 24 h para experimentos para evitar a expressão do gene precoce induzida por soro.

Rotulagem de SMOF lipídico com o fluoróforo DiD

A emulsão lipídica SMOF que contém óleo de soja, de cadeia média triglicéridos, óleo de oliva e óleo de peixe {www.tga.gov.au/pdf/auspar/auspar-smoflipid.pdf}, e é utilizado para a nutrição intravenosa, foi usada nas nossas experiências após marcação com um fluoróforo traçador lipofílico 0,05%, DiD , (DiD307, Invitrogen, Carlsbad, CA). A emulsão de lípidos foi seca sob SMOF um evaporador rotativo, liofiliza-se antes de se misturar bem com DiD lípido numa solução etanólica. O etanol foi evaporado e finalmente a película de lípido residual foi re-hidratada por adição de água estéril Baxter para tornar a concentração final a 20% SMOFlipid, seguido por agitação em vórtex e dura 30 minutos de ultra-sons de banho homogeneização.

Recolha e purificação de ApoA -II

ApoA-II foi purificado como descrito em estudos anteriores [31-33]. HDL foram ultracentrifugally isolado a partir de amostras reunidas de plasma humano normal (1,063 d 1,21 g /ml) e deslipidado. O apoHDL resultante foi submetido a cromatografia sobre uma coluna de Fluxo Rápido de Q-Speharose ligado a um sistema de Akta FPLC (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Buck, Reino Unido). As fracções que continham apo A-II, foram reunidas e a pureza foi verificada por SDS-PAGE e coloração de Coommassie, o qual revelou uma única banda. As amostras reunidas foram liof ilizadas, reconstituídas com 3 M de hidrocloreto de guanidina /Tris 10 mM /0,01% (p /v) de EDTA-Na

2, e dialisada em PBS livre de endotoxina antes da utilização.

celular ensaio de proliferação de

a proliferação celular foi realizada em diferentes linhas celulares e quantificados pelo ensaio de violeta cristal tal como descrito anteriormente em [34], em que o doseamento MTT não é adequado, em células de lípidos tratado [35]. 4 × 10

4 células /células ml foram semeadas em placas de noventa e seis microplacas, para todas as linhas celulares excepto para PANC-1 e MiaPaCa-2, onde 2×10

4 células /ml foram semeadas a um volume final de 200 ul. As células foram tratadas sem soro, com ou sem SMOFlipid (lípido) sozinho, ApoA-II e sozinho ou em combinação, em diferentes concentrações e incubado durante 24 h, 48 h e 72 h. Para testar o efeito do SR-B1, as células foram pré-tratados com anti SR-B1 (2,5 ug /ml) durante 2 h e lavou-se por meios 3 vezes durante 5 minutos cada. Em seguida, as células foram tratadas com ou sem lípido mais ApoA-II, durante 48 h. O meio de cultura foram removidas e coradas com violeta de 1 ug /ml de cristal (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) dissolvido em 25% de metanol (v /v) e 75% de água destilada (v /v). violeta de cristal ligado foi solubilizado com 0,1% de sódio-dodecil-sulfato (SDS) em solução salina tamponada com fosfato (PBS). A densidade óptica de cada poço foi determinada a 550 nm, o comprimento de onda. Os resultados foram expressos como em relação ao controlo. Descobrimos que a diluição 1:30 de lípido e 50 ug /ml de ApoA-II foram as concentrações óptimas às 48 h e esta condição foi utilizado no estudo subsequente.

imunotransferência

A análise de imunotransferência foi realizada como descrito anteriormente [1]. Resumidamente, 4 x10

5 células de cada uma das linhas de células semeadas em placas de 6 poços e as células foram cultivadas até à confluência. Quantidades iguais de proteínas foram separadas por 10% SDS-PAGE sob condições redutoras e transferidos para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. O anticorpo primário utilizado foi de coelho anti-SR-B1 (Novus Biologicals, Littleton, EUA). A imunorreactividade foi detectada com o sistema de detecção de electroquimioluminescência (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido). anticorpo β-actina anti-humano foi incluído para normalizar contra a carga desigual.

A microscopia confocal

A absorção de SMOFlipid marcado com fez foi investigada por microscopia confocal. Resumidamente, 1×10

5 células /poço foram semeadas em 8 desliza bem cultura (BD Falcon, BD Bioscience) durante a noite e tratados com lípido marcado com corante DiD diluição a 1:30, com ou sem a ApoA-II durante 48 h. Em algumas experiências as células foram pré-incubadas com the1: 40, 1:30 e 1:10 diluições de moléculas SMOFlipid e anti SR-B1 em (2,5 ug /ml) durante 2 h, lavadas com meio isento de soro e incubadas com o lípido além de ApoA-II, durante 48 h. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% (Univar, Redmond, WA, EUA), permeabilizadas com 0,3% de Tween 20 (Sigma Aldrich, Castle Hills, NSW, Austrália) e incubadas com ou sem o anticorpo primário, anticorpo de cabra anti-humano de ApoA-II ( Abcam, Abcam Inc., MA, EUA) durante 2 h e, em seguida, incubadas com conjugado de isotipo Fluoróforo verde combinado anticorpo secundário (AlexaFlour

a488 burro anti-IgG de cabra (H + L) (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante mais 1 h à temperatura ambiente. as células foram montados com meios de glicerol com DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) e captação celular foi examinada sob a Leica microscopia confocal (Leica, Tóquio, Japão).

Para imagens de células vivas, 1×10

5 células /poço foram semeadas em μ- corrediça 4 bem ibi Tratar Microscopia Secção (Ibidi GmbH, Martinsried, Alemanha) durante a noite e tratados com lípido marcado com corante DiD às 1:20 e 1:10, com ou sem ApoA- II, durante 24 h. captação celular foi examinada sob o Leica microscopia confocal (Leica, Tóquio, Japão). intensidade de absorção lipídica foi quantificada pela Leica Microsystems LAS AF (GmbH, Mannheim, Alemanha) e os resultados foram expressos como intensidade relativa.

Cryo microscopia Eletrônica de transmissão (TEM)

Um sistema de vitrificação umidade controladas construído em laboratório foi utilizado para preparar as amostras para Cryo-TEM. Umidade foi mantida próximo de 80% para todos os experimentos e a temperatura ambiente era ± 22 ° C. Uma alíquota de 4 mL da amostra foram pipetados sobre uma grelha de cobre de malha 300 revestidas com filme laçado formvar-carbono (Pro-SciTech, Thuringowa, Queensland). Após 30 s de tempo de adsorção, a grade foi transferido manualmente utilizando papel de filtro Whatman 541, durante entre 2 e 10 s. A grelha foi então mergulhado em etano líquido arrefecido por azoto líquido. grades foram armazenadas congeladas em azoto líquido até serem examinadas. As amostras foram examinadas usando um Gatan 626 cryoholder (Gatan, Pleasanton, CA, EUA) e um Tecnai 12 Microscópio Eletrônico de Transmissão (FEI, Eindhoven, Holanda) a uma tensão de 120 kV, equipada com um CCD FEI Águia 4k x 4k (FEI, Eindhoven, Países Baixos). As amostras foram vistos em 100 000-150 000 vezes de ampliação.

A electroforese em gel

Uma 0,5% m /m em gel de agarose foi preparado e imersos em 1 × TBE (tampão aquoso Tris-Borato-EDTA , preparada por diluição de soluções de reserva 10x, pH 9) de tampão [36, 37], executado num sistema de electroforese horizontal (Mini-Sub celular GT, BioRad, espaçamento eléctrodo 15 cm) durante 45 minutos a 90 V. gel imagens foram tiradas com um MI Carestream no comprimento de onda de 650 nm de excitação e 700 nm de emissão.

ApoA-II Plus lipídicas foi reconstituído através da incubação de 2 ul de ApoA-II (2 mg /ml) e 2 ul de SMOFlipid marcado (10 mg /ml) a 37 ° C durante 24 h. Antes de carregar o gel com a amostra, cada amostra foi diluída a 1: 5 em PBS (pH 7,4) e adicionaram-se 2 ul de solução de carga de corante 6x (# R0611, Fermentas, Vida Science) contém 10 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 0,03% de azul de bromofenol, 0,03% FF xileno cianol, 60% EDTA glicerol 60 mM. 12 ul de amostra foi carregada em cada poço do gel. Todos os experimentos foram realizados à temperatura ambiente.

geração de PDAC xenotransplante paciente tumor derivado (PDTX) em não-obesos diabéticos imunodeficiente combinado /grave (NOD /SCID)

Todos os experimentos com animais conformado com as orientações do Comitê de Northern Sydney Distrito de Saúde local (NSLHD) animal Ética neste estudo e alojados nas instalações Kearns, Kolling Institute of Medical Research, da Universidade de Sydney. O protocolo foi aprovado pelo comitê de ética NSLHD Animal (Protocolo número 1011-015A). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia utilizando isoflurano com NO

2 e oxigênio (2: 1) e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Nós estabelecemos modelo PDTX como descrito por Wong e MH Xue A et al. [38, 39] ao abrigo do protocolo NSLHD HREC- 0909-227M. Resumidamente, NOD sexo masculino /SCID, com idades entre 6 a 8 semanas, foram anestesiados com isoflurano com NO

2 e oxigênio (2: 1). Pequenos pedaços de tecidos tumorais frescas do paciente foram xenoenxerto sob a cápsula subrenal (SRC) em um mouse. No pós-xenotransplante de oito semanas, os ratos foram utilizados para investigar o

in vivo

absorção de lipídios.

Os animais portadores os primeiros enxertos geração (F1) foram randomizados e distribuídos em três grupos (a) veículo (solução salina); (B) lípido (c) lípido mais ApoA-II e injectado através da veia da cauda. Para homogeneizar os volumes tumorais alguns dos tumores foram F1 passagem para outro grupo de ratinhos (F2) e, subsequentemente, a passagem para F3. A geração F3 rolamento animais de tumores de xenoenxerto foram utilizados para o estudo de validação. absorção de lipídios foi medida em diferentes momentos por Carestream Molecular (MI) (Carestream Molecular Imaging, EUA). No final de cada experiência órgãos e os tumores foram colhidos e analisados ​​adicionalmente.

Na análise de imagem in vivo

in vivo Para imagiologia óptica, os ratinhos portadores de tumor foram injectados com lípido DiD307 marcado com ou sem Apo-aii por injecção na veia da cauda. A visualização foi realizada imediatamente após a injecção, a 4 h, 24 h, 48 h e 96 h por in vivo Carestream MI Imaging System. Os ratinhos foram sacrificados a 48 h após a injecção, o rim de tumor com, fígado, baço, pâncreas, pulmões, cérebro e músculo foram colhidas e analisadas por Carestream MI no comprimento de onda de 650 nm de excitação e 700 nm de emissão.

e Histologia imunohistoquímica

As amostras de tecido foram fixados em formalina a 10% tamponada com fosfato e embebidos em parafina. , seções de parafina fixadas em formalina foram cortadas de 4 mm de espessura e corados com hematoxilina de Mayer e eosina (H E). Para imuno-histoquímica, as secções foram incubadas com anti-ApoA-II (# AB 54796, Abcam, Abcam Inc., MA, EUA) (1 em 4000), anti-SR-B1 (#NB 400-104, Novus Biologicals, Littleton, EUA) (1 em 4.000) e anticorpos IgG do mesmo isotipo. Imunodetecção foi feito usando o Dako Envision + System-HRP marcado kit de detecção de polímero (Dako, Carpinteria, CA, EUA), de acordo com o protocolo dos fabricantes e contrastadas com hematoxilina de Mayer e solução de bluing de Scott. Após a montagem, os cortes foram observados em microscópio de luz (ECLIPSE 80i; Nikon, Tokyo, Japan).

A análise estatística

Os dados foram expressos como média e desvio padrão ± (DP). A significância estatística de diferenças entre os grupos foram analisadas por emparelhado

t

-test e análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste Bonferroni post hoc (se for caso disso). A significância estatística foi aceite no

p Art 0,05.

Resultados

efeito de ApoA-II em SMOF emulsão lipídica

Quando ApoA-II foi adicionada à emulsão lipídica opaco, uma transição de fase ocorreu eo emulsionado opaque solução transformado para um líquido claro transparente em menos de uma hora (Fig S1). Cryo imagens TEM de SMOF lipídica mais ApoA-II demonstrou que as partículas emulsionadas transformado para vesículas unilaminar (Fig 1B). Mais interessante é o pequeno tamanho dessas estruturas, muitas das quais eram de 10-50 nm de diâmetro, muito menor do que as partículas originais na emulsão. Esta alteração morfológica em estrutura e tamanho são mais provável devido à interacção e integração da ApoA-AII dentro dos auto-agrupamentos de lípidos e a transformação a uma solução transparente contendo principalmente pequenas vesículas unilamelares, como demonstrado por Cryo-TEM (Figura 1A e 1B).

foto micrografia Cryo-TEM da emulsão SMOFlipid sem ApoA-II (a) e após a adição de ApoA-II (B). Note-se a estrutura de bi-camada de superfície do lípido das nanopartículas como estruturas em presença de ApoA-II (setas pretas). (C) fotografia espectral de cor de fluorescência de uma corrida em gel de agarose a 0,5% durante 45 min a 90 V em 1 × tampão TBE. SMOFlipid marcado com DiD não migram através do bem, mas reconstituído marcado SMOFlipid com ApoA-II migrou como uma banda.

A electroforese em gel demonstrou que reconstituído ApoA-II mais complexos lipídicos migraram através do gel como uma banda enquanto lípido sozinha ainda permaneceu no poço (Figura 1C), o que sugere que a ApoA-II alterou a emulsão lipídica e reduziu o tamanho de partículas permitindo a migração no gel. Isto é consistente com os resultados crio TEM (Fig 1A e 1B).

A microscopia confocal de células cancerosas cultivadas em soluções de lípidos com e sem ApoA-II

A absorção de lipídios por CFPAC-1 células (Fig 2A3), PANC-1 (Fig S2A) e linhas de células do tumor primário (S2B FIG) foi aumentado quando reconstituída lipídica mais ApoA-II foi adicionado ao meio de cultura. Efeitos similares também foram observadas em células de câncer de pulmão A549 (S2C FIG). Nestas experiências de ApoA-II foi visualizado por meio de anticorpos de ApoA-II, que demonstraram que era localizada em membranas de células de cancro (Fig 2A e Fig S2). Enquanto reduzida intensidade de fluorescência foi observado em células CFPAC-1, quando as células foram pré incubados com o anticorpo de bloqueio anti SR-B1 (Fig 2A4). Quando as células CFPAC-1 foram pré incubados com o não marcado grande excesso SMOFlipid sozinho (Fig 2B1) e, em seguida, incubadas com o reconstituído SMOFlipid /ApoA-II /DiD (Fig 2B2) a captação de DID ocorreu e o anticorpo de ApoA-II coradas componentes periféricos de células. Assim, embora a pré-incubação reduziu a captação de captação SMOFlipid /ApoA-II ainda ocorreu através do mecanismo de atração de superfície para ApoA-II [4, 5]. Na presença de absorção de lípidos de ApoA-II é significativamente maior em várias concentrações, em comparação com o lípido sozinha (Figura 2C e 2D). Estes resultados sugerem que a ApoA-II é atraído para a membrana celular, enquanto lípido era de transporte para as células PC. Esse achado está de acordo com a Fan Y

et al

. [4] e prata

et al

. [5]. Em conjunto, estes resultados suportam a proposição de que nanopartículas de lípidos pode ser endocitado.

SMOFlipid foi marcado com DID (vermelho), ApoA-II foi rotulado verde com um anticorpo secundário e DAPI manchado os núcleos azul. células (A1) tratados com células sozinho ApoA-II, (A2) tratados com lipídios sozinho, células (A3) tratados com lipoproteínas reconstituídos após a adição de ApoA-II fez marcado SMOFlipid (SMOF /A-II), demonstrando aumento da captação e (A4 ), as células tratadas com (SMOF /a-II), após pré-tratamento com anti-SR-B1antibodies que reduziu a absorção de lípidos (barra de escala, 20 fim). (B) As células foram pré-tratadas com lípido não marcado 1:10 e (B2), depois adicionou-se 2 h SMOF /A-II, que apareceu a ser sujeita a endocitose em vesículas citoplasmáticas, como mostrado em (B3) e (B4). ApoA-II (verde) está ligado com a membrana celular (cabeça de seta amarela) e também no citoplasma em parte associado ao lipídico (cabeça de seta vermelha) imagem de sobreposição Interference Contrast (DIC) Diferencial (barra de escala 25 mm) no. (C) experimento imagens de células vivas demonstraram maior absorção de lipídios nas células quando reconstituído lipoproteínas após a adição de ApoA-II fez marcado SMOFlipid foi adicionado ao meio para as concentrações de lipídios de 1:20 e 1:10 (barra de escala de 100 m). (D) A intensidade da coloração fez foi maior quando 4 amostras foram examinadas com oito a doze áreas de interesse para cada estudo em que ApoA2 aumentou a absorção de lipídios 25,6 ± 2,2,

P

= 0,02 e 54,8 ± 2,2 ,

P

= 0,004 para diluições de 1:20 e 1:10, respectivamente.

SMOFlipid ApoA-II tem como alvo PDAC PDTX in vivo

para avaliar o tumor capacidade de lipídios além de ApoA-II segmentação empregamos um modelo PDAC PDTX no mouse. Lipid /fez ou lipídico /DID /ApoA-II foi injetado na veia da cauda de ratos portadores de tumor primeira geração. imagiologia animal completo após 48 h revelou que a absorção de lípidos nos xenoenxertos de tumores PDAC está confinado no lípido mais ApoA-II em comparação com ratinhos injectados com lípido sozinha (Figura 3A e Fig S3A), mas também no fígado, estômago e baço. Isto foi confirmado sobre os órgãos explantados por

ex vivo

imaging mas pouco lipídico foi observada em pulmões e cérebro, mas não visto no pâncreas normal (Fig 3B e S3B Fig). A intensidade de fluorescência relativa foi aumentada em 3,4 vezes em tecidos direcionados cancro, quando fez-lipídico /ApoA-II foi injetado (Fig 3C) em comparação com DID lipídico, de acordo com Fig 2. Considerados em conjunto nossos resultados sugerem que ApoA-II alvos humanos PDAC.

(A) imagens de fluorescência reflectância espectral de 8 semana xenotransplantes velhas tomadas 48h após a injeção na veia da cauda de PBS, fez marcado SMOFlipid sem ou com ApoA-II usando imagiologia molecular Carestream. Observe a ampla distribuição de fez é melhor localizada para os tumores quando ApoA-II está incluído no lipídica. As setas indicam a localização dos tumores. (B) imagens de fluorescência espectrais de tumores e órgãos explantados tomadas 48 horas após a injecção de ratinhos depois de uma injecção na veia da cauda de PBS, lípido /DiD (n = 2) ou lípido /DiD mais ApoA-II (n = 2) (painel da direita ) juntamente com a de H e foto micrografia do tumor a partir de dois ratinhos (painel esquerdo), manteve as características morfológicas com tumores PC do paciente original em lípido e lípido mais ApoA-II ratinhos tratados. Note-se a absorção da fluorescência pelos tumores, fígado e baço. (C) O gráfico representa a captação pelo tumor em relação à absorção do fígado como uma fracção da área. Estes resultados foram então normalizados para o valor de ratinhos que receberam lipídica apenas (definida como 1) quando a absorção do tumor para os ratinhos que receberam lípido e a ApoA-II tinha 3,4 vezes maior absorção. Os valores são média ± SD;

n

= 3.

receptor Scavenger tipo de classe B 1 (SR-B1) expressão é maior PDAC humana

por western blot, pela primeira vez, foi demonstrado que a expressão de SR-B1 foi de 13,2, 10,6, 3,1 e 2,3 vezes superior em PANC-1, MiaPaCa-2, CFPAC-1 e linhas de células BxPC3, respectivamente em relação à linha de células de pâncreas normal (HPDE6) (Fig 4A). A imuno-histoquímica (IHC) demonstraram que a expressão SR-B1 foi de 3,7 vezes maior em comparação com o tecido PDAC pâncreas normal (Fig 4B). Consistente com a Figura 2, verificou-se que a expressão de ApoA-II foi maior em tumores quando os ratinhos foram injectados com a combinação de lipidos e da emulsão de ApoA-II (Figura 4C), enquanto que não houve diferença na expressão de SR-B1 em tumores em nenhum dos grupos ( Figura 4C).

(A) HPDE6, PANC-1, MiaPaCa-2, CFPAC-1 e as células foram cultivadas BxPC3 e SR-B1 expressão foi medido por transferência de western. A intensidade das bandas das proteínas foi normalizada com β-actina e HPDE6 foi definido como 1. Os valores são a média de duas experiências separadas. (B) A expressão de SR-B1 por IHC no pâncreas normal (NP) e tecidos PDAC humanos. Inset, IgG representa o anticorpo primário combinado isotipados para anti SR-B1. O gráfico mostra a quantificação da expressão de SR-B1 pela percentagem de células coradas X intensidade de 3 pacientes separados e NP foi definido como 1. (C) Expressão de SR-B1 e a ApoA-II por IHQ em correspondentes tumores xenoenxertados PDAC às 48 h após injecção na veia da cauda de lípidos, com ou sem a ApoA-II. Inset, IgG representa o isotipados combinado anticorpo primário para anti-ApoA-II. (D) Efeito de anti SR-B1 sozinho em HPDE6, PANC-1, MiaPaCa-2, CFPAC-1 e de crescimento de células BxPC3. (E) As células foram pré-tratadas com ou sem o anticorpo SR-B1 (2,5 ug /mL) durante 2 horas e, em seguida, tratada com a ApoA-II, lípido e lípido mais ApoA-II, durante 48 horas. A proliferação foi medida por ensaio de violeta de cristal. Os valores são média ± SD;

n

= 4. *

, ‡, # e ± p 0,05 controle vs., ApoA-II, lipídios e lípidos + ApoA-II, respectivamente, com o uso de análise de variância.

ApoA-II melhorado proliferação celular em células cancerosas humanas

Quatro linhas celulares PC PANC-1, MiaPaCa-2, CFPAC-1 e BxPC3 cresceram mais rapidamente (Fig 4E) quando tiveram lipídico e ApoA-II adicionado ao seu meio de cultura em comparação com os controles, ApoA-II sozinho ou com lípidos sozinho (excepto células CFPAC-1). Alternativamente ApoA-II downregulated HPDE6 células normais (Figura 4E). Isto foi mais evidente em 48 h e implica que a combinação de lípido e de ApoA-II aumentou a absorção de lípidos e, portanto, energia permitindo que as células PC de crescer mais rapidamente. Houve um efeito semelhante em linhas de células de cancro humano do pulmão, da mama e da próstata em 48 h (Fig S4). No entanto, a ApoA-II não promoveu o crescimento da linha celular de cancro da mama MCF7, que reteve as características de diferenciação e de crescimento lento [40]. Além disso, a pré-incubação com o anticorpo anti SR-B1 reverter completamente lípido mais ApoA-II estimulou a proliferação celular em PANC-1, CFPAC-1 e células BxPC3 e parcialmente, mas de forma significativa em MiaPaCa-2 células (FIG 4E). Curiosamente, a inibição de SR-B1 reforçada ApoA-II mais lipídica induzida regulação negativa do crescimento celular em HPDE6 (Figura 4E). Anti SR-B1 sozinho em 2,5 ug /ml não teve nenhum efeito significativo sobre HPDE6, PANC-1, MiaPaCa-2 e células BxPC3 linhas, enquanto o crescimento de células CFPAC-1 significativamente regulada negativamente (Fig 4D). Isto pode ser devido ao nível de densidade diferença de SR-B1 em PANC-1, MiaPaCa-2, BxPC3 e CFPAC-1 linhas de células (Fig 4A).

Discussão

ApoA-II mudou a estrutura física de SMOF lípido através da redução do tamanho das partículas lipídicas e induzindo a formação de uma membrana de bicamada nanoparticle- como a estrutura. Isto é consistente com a estrutura e a função conhecida de ApoA-II em HDL [41]. A combinação de ApoA-II e lípido promoveu significativamente o crescimento de linhas celulares de PC e linhas celulares de cancros do pulmão, da mama e da próstata. Além disso, a ApoA-II em aumentar a absorção de lípidos PANC-1, CFPAC-1, as células de tumor primárias e em PDXT. A absorção da emulsão lipídica exógena com a ApoA-II em tumores PC podem utilizar o receptor de SR-B1 (Fig 2A4), porque forma um HDL como a estrutura que tem uma alta afinidade para o SR-B1 [26].