Abstract

peptídeos bioativos, quer derivados de recursos naturais ou sintetizados por desenho racional, foram potencial demonstrado para agentes terapêuticos contra numerosos doenças humanas, incluindo câncer. No entanto, o mecanismo de péptidos terapêuticos contra o cancro não tem sido bem elucidadas. Aqui mostramos que PGPIPN, um derivado de hexapéptido β-caseína bovina, inibiu a proliferação de células cancerosas do ovário humano SKOV linha

3, assim como as células de cancro do ovário primárias

in vitro

. Consistentemente, PGPIPIN também diminuiu a taxa de crescimento do tumor em ratinhos modelo de xenoenxerto de cancro do ovário de um modo dependente da dose. Um estudo adicional demonstrou que o efeito anti-tumoral de PGPIPN é parcialmente através da promoção de apoptose de células por inibição da via de BCL2. Assim, nosso estudo sugere que PGPIPN é um agente terapêutico potencial para o tratamento de câncer de ovário ou de outros tipos de câncer

Citation:. Wang W, Gu F, Wei C, Tang Y, Zheng X, Ren M, et ai. (2013) PGPIPN, um Hexapeptide Terapêutico, suprimiu o crescimento do cancro do ovário humano, por Segmentação BCL2. PLoS ONE 8 (4): e60701. doi: 10.1371 /journal.pone.0060701

editor: Robert W. Sobol, da Universidade de Pittsburgh, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de novembro de 2012; Aceito: 01 de março de 2013; Publicação: 08 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (30872992) e da Província Natural Science Foundation de Anhui (03.043.802). O 300000 RMB foi concedida para esta pesquisa pelo National Natural Science Foundation da China, a URL do que é https://www.nsfc.gov.cn. A Província Natural Science Foundation de Anhui financiado 100000 RMB para o estudo. Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, as experiências, recolha de dados e análise, preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a neoplasia maligna ginecológica mais letal. A incidência de câncer de ovário é o terceiro de câncer ginecológico após câncer de mama e colo do útero entre as mulheres, mas é o mais número de mortes em câncer ginecológico. O curso da terapia convencional para o cancro do ovário inclui citorredução cirúrgica da massa tumoral, seguida pela quimioterapia adjuvante. Embora muito progresso tenha sido alcançado no desenvolvimento de terapias contra o câncer nos últimos anos, os problemas continuam a surgir principalmente com relação à quimioterapia devido a efeitos colaterais, resistência e baixa especificidade dos medicamentos actualmente disponíveis [1]. Por conseguinte, existe uma necessidade de desenvolver agentes anti-cancro eficazes e seguros [2].

Peptídeo terapêutica é um campo promissor para agentes anti-cancro emergentes, principalmente devido a que estes péptidos podem obter facilmente quer de natureza recursos ou desenho racional baseada na estrutura da proteína alvo. De facto, vários estudos têm demonstrado que um número de péptidos bioactivos crescimento de células tumorais inibidas em trilhas pré-clínicos [3] – [5]. Em particular, estes péptidos terapêuticos geralmente não têm toxicidade limitada ou [2]. Por exemplo, um péptido bioactivo anticancerígeno (ACBP) extraída a partir de baços de cabra inibiu dramaticamente o crescimento do tumor gástrico humano num modelo de xenoenxerto sem citotoxicidade evidentes para acolher [3]. Os estudos subsequentes sugeriram que os efeitos anticancerígenos de alguns péptidos bioactivos podia ser atribuída à sua capacidade de indução da apoptose das células e ciclo celular prisão [3], [6] – [7]. Estudos recentes revelaram alguns péptidos podem prejudicar uma via de sinalização específicas e, subsequentemente, inibiu o crescimento tumoral ou metástase. Tal como, um péptido de HAS-BCL9 (estabilizado hélice alfa de linfoma de células B 9), destinados a beta-catenina inibiu a actividade de Wnt oncogénica, suprimiu o crescimento e metástase do cancro colo-rectal e múltiplos xenoenxerto de mieloma, e promoveu a apoptose de células de tumor [8] . O peptídeo grampeado em hidrocarbonetos SAHM1 impediu a montagem do complexo de transcrição ativa de Notch, e proliferação celular, consequentemente inibido

in vitro Comprar e tumorigênese em um rato modelo de leucemia aguda de células T-driven NOTCH1 e linfoma [9].

Em adição aos seus valores nutricionais primários, as proteínas do leite são importantes fontes de péptidos biologicamente activos [10] – [11]. As proteínas do leite são os precursores de muitos péptidos biologicamente activos que sejam inactivos na proteínas precursoras, mas pode ser libertado e activada por proteólise enzimática [12]. Alguns péptidos derivados de proteínas do leite são bons candidatos para agentes anti-cancerígenos clínicos ou adjuvante, uma vez que são facilmente absorvidos com menos potencial de toxicidade. Adicionalmente, aqui estão a aumentar estudos que demonstram que os péptidos bioactivos de leite podem ser absorvidos intactos a partir do lúmen intestinal para a circulação sanguínea – estes podem, assim, servir como novos agentes farmacêuticos, que não causam efeitos colaterais significativos em humanos saudáveis ​​[13]. Na verdade, a exploração dos efeitos anti-cancro de peptídeos bioactivos a partir de proteínas do leite surge como uma das regiões mais quentes recentemente. Por exemplo, talactoferrin (TLF), um lactoferrina humana recombinante (LF), é um novo agente anticancro desenvolvidos, o que entrou fase III de ensaios clínicos [14] – [15].

PGPIPN (Pro-Gly-Pro -Ile-Pro-Asn, resíduos 63-68 de SS-caseína), um péptido imunomodulador, foi descoberto o péptido activo a partir de proteínas de leite bovino [16] – [18]. Estudos anteriores demonstraram que este péptido desempenha um papel importante na resposta de defesa imune. Por exemplo, o peptídeo reforçada atividade fagocitária de macrófagos

in vitro

contra células Carneiros vermelhos do sangue (SRBCs) e camundongos protegidas contra a infecção por Klebsiella pneumoniae

in vivo

. Nos últimos anos, o nosso laboratório dedicado para explorar as funções fisiológicas de PGPIPN. Em comparação com outros péptidos imunomoduladores, PGPIPN é mais resistente ao sistema degradante-enzima devido ao seu teor rico em prolina [19]. Além disso, um aminoácido de cadeia ramificada (BCAA) deste péptido ajuda em certa medida, para resistir microorganismos. Os nossos estudos anteriores sugeriram que PGPIPN promoveu significativamente a fagocitose de macrófagos e a imunidade de células vermelhas do sangue em ratos. Ela também pode estimular a proliferação de linfócitos em ratos e ratinhos [20] – [21]. Além disso, nosso estudo posterior demonstrou que este peptídeo tem bom efeito antioxidante

in vivo

[22].

Aqui nós mostramos que o PGPIPN hexapeptide pode efetivamente inibir a proliferação de células de câncer de ovário, induzir a apoptose de células cancerígenas e diminuir o crescimento do tumor no modelo de xenoenxerto de cancro do ovário. Os resultados do presente estudo fornece a prova de conceito para o uso PGPIPN como um potencial agente terapêutico para o tratamento de câncer de ovário.

Materiais e Métodos

Reagentes

O PGPIPN (a pureza foi confirmada por RP-HPLC como sendo 99,5%) foi fornecida por tecnologia de engenharia biológica Sangon Xangai. Tunel kit foi adquirido de Roche. Kit Eluir gene de mamífero de ADN genómico miniprep foi adquirido a Sigma. anticorpos monoclonais de rato de BCL2, Bax, e β-actina foram adquiridos de Santa Cruz Biotechnology, Inc.

Cell Cultures

linha de células de cancro do ovário humano SKOV

célula hepática normal 3 e humano linha LO2 foram adquiridos da ATCC. células murina embrião de fibroblasto (MEFs) Originária da Harvard Medical School, nos Estados Unidos,

p

53 gene da qual tinha sido nocauteado, foi apresentado pelo Professor Hongbing Zhang na Academia Chinesa de Ciências Médicas Peking Union Medical College, na China. Estas linhas celulares foram cultivadas em DMEM com FBS a 10% em 5% de CO

2 a 37 ° C. Para primária cultura células do ovário, tecido tumoral ovariana primária fresco, que foi avaliado e classificado como adenocarcinoma de ovário (grau I-II) serosa de acordo com os critérios da OMS, foram obtidos a partir de 5 pacientes com câncer de ovário no momento da cirurgia redutora inicial no primeiro hospital afiliada da Médico da Universidade de Anhui. Todos os pacientes assinaram consentimentos escritos que documentam a doação dos seus tecidos para fins de pesquisa de acordo com a Declaração de Helsínquia antes de deposição de tecido. Este estudo foi aprovado pela Universidade Review Board Anhui Medical. Os tecidos tumorais foram cortados em pequenos pedaços de cerca de 1,0 mm

3, e lavadas com PBS duas vezes e digeridas com tripsina a 0,25% em tubo de centrífuga estéril a 37 ° C durante 30 minutos. Para obter as células em suspensão individuais, os tecidos acima digeridas foram filtradas com filtro de células de 100 um. Depois centrifugou-se a 1000 rpm durante cinco minutos, o pellet celular foi re-suspenso em meio DMEM complementar com 10% de soro humano. Quando as células cresceram até 70-80% confluentes, o meio de cultura em balão foi drenado; as células foram digeridos com 0,25% de colagenase II. Quando cerca de 1/3 células caindo pela observação ao microscópio, a digestão foi imediatamente interrompida e o meio de cultura em frasco foi drenado novamente. Devido ao seu derramamento em primeiro lugar, a maioria dos fibroblastos foram eliminados por digestão com colagenase. As células permaneceram foram cultivadas continuamente para ensaio de proliferação celular. A parte destas células foram feitas para o slide celular e identificado por imunofluorescência da citoqueratina 7 para ensaiar sua pureza.

Proliferação Celular Ensaio

SKOV

3 células foram semeadas em 96- bem placas em octuplicate a uma densidade de partida de 5 x 10

3 células /poço. Após cultura durante a noite, PGPIPN foi adicionado às concentrações finais de 0 (como controlo), 3 × 10

-8, 3 × 10

-7, 3 × 10

-6, 3 × 10

-5, 3 × 10

-4, 3 × 10

-3 e 3 × 10

-2 g /L, respectivamente. 5-fluorouracilo (5-FU) a 3 × 10

-3 g /L foi adicionado na mesma placa como controlo positivo. A proliferação das células foi medida em diferentes pontos do tempo pelo método de MTT, tal como descrito [23]. A fórmula que se segue foi utilizada para calcular a razão de inibição do crescimento celular (IV): IV (%) = (1 – o Grupo Experimental A /grupo de controlo

490 nm Um valor

490 nm, valor) × 100%. Cada experiência foi triplicada de forma independente.

Usando o mesmo procedimento, a inibição do crescimento de células cancerosas em PGPIPN ovarianos primários foram também ensaiados, excepto para as concentrações finais de PGPIPN a 0 (como controlo), 3 × 10

-6, 3 × 10

-5, 3 × 10

-4, 3 × 10

-3 e 3 × 10

-2 g /L, respectivamente. Os experimentos foram duplicado com células de cancro do ovário primárias a partir de cinco pacientes, respectivamente.

Para a detecção da toxicidade de PGPIPN, as inibições de crescimento do PGPIPN não transformada em linhas celulares LO2 e MEFs foram testadas com o mesmo procedimento que o do SKOV

3 células, com excepção para as concentrações finais de PGPIPN a 0 (controle), 3 × 10

-4, 3 × 10

-3, 3 × 10

-2, 3 × 10

-1 e 3 g /L, respectivamente. Cada experimento foi triplicada de forma independente.

foram observados Observação morfológica de células tratadas com PGPIPN

As alterações morfológicas dinâmicas do SKOV

3 células tratadas com PGPIPN com microscópio óptico. A tampa do vidro de rastreamento de células foi preparado. A tampa de vidro quase cheio de celular em sua superfície foi levado para a H E coloração, com o procedimento de acordo com a referência [24] – [25]. O método utilizado para observar a apoptose de SKOV

3 células com microscópio eletrônico de transmissão foi descrito anteriormente [26].

Detecção de apoptose em células cultivadas por FCM

As células apoptóticas foram detectadas utilizando FITC-conjugado anexina-V e iodeto de propídio (PI) a partir de Sigma. As células foram lavadas duas vezes com PBS frio e ressuspensas em tampão de ligação a Anexina-V (10 mM de HEPES, 140 mM de NaCl e 5 mM de CaCl

2) a uma concentração de 1 × 10

6 células /ml. Em seguida, a suspensão única de 1 × 10

6 SKOV

3 células foi preparada num tubo de cultura de 5 ml de acordo com a referência [23], em que 5 � Anexina-V-FITC a 10 ug /mL e 10 de propídio uL iodeto a 10 ug /ml foi adicionado. Em seguida, o tubo foi suavemente agitada em vórtice e incubou-se durante 15 min à temperatura ambiente no escuro. tampão de ligação (400 uL) foi então adicionada a cada tubo e as células foram analisadas por citometria de fluxo.

Tratamento animal

Vinte e quatro ratinhos nus fêmeas saudáveis ​​foram utilizados nos estudos. Todos os experimentos com animais foram realizados sob o protocolo aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Medicina Anhui. Durante as experiências com animais, tanto quanto possível, o sofrimento dos animais foi melhorada. Todos os murganhos nude foram sacrificados no final das experiências. Os ratos nus em estirpe consanguínea (BALB /Cann-nu /nu), 8-10 semanas de idade, foram adquiridos a partir de Xangai SLAC Animais de Laboratório Co. Ltd. Todos os ratos foram mantidos em SPF-classe sala estéril no Centro de Anhui Provincial de Medicina Animais experimentais.

Cada ratinho nu foi inoculada por via subcutânea em sua axila direita com 0,2 ml SKOV

suspensão 3 células em (1 × 10

7) células /ml. No segundo dia após a inoculação, os ratinhos foram aleatoriamente divididos em quatro grupos: NS (solução salina normal), uma dose baixa de PGPIPN, dose elevada PGPIPN e 5-FU (como controlo positivo) groups. NS, dose baixa PGPIPN, dose elevada PGPIPN e 5-FU grupos foram injectados por via intraperitoneal com 0,2 ml de solução salina, 0,2 ml PGPIPN a 0,25 gL

-1, 0,2 mL PGPIPN a 0,50 gL

-1 e 0,2 ml 5- FU a 30 mg /kg de peso corporal, respectivamente. As drogas foram dadas uma vez a cada dois dias, durante 4 semanas

O tamanho do tumor foi medido por com semanal paquímetro, e calculadas de acordo com a fórmula a seguir:. V = (1/2) ab

2 , onde V = volume de tumor; A = o maior diâmetro do tumor; b = o maior número de trilhas de tumor. Na quarta semana após o plantio, todos os ratinhos nus foram sacrificados, e tumores de xenoenxerto foram ponderados. Os tumores de xenoenxerto foram congeladas em nitrogênio líquido para experiências posteriores.

TUNEL (TdT mediada dUTP Nick-End Labeling) Ensaio

As amostras tumorais foram fixadas e incluídas com parafina. O ensaio de TUNEL foi realizado como o manual do fabricante (Roche). Finalmente, as secções foram contrastadas com hematoxilina. As células apoptóticas foram quantificados por microscopia de luz em hematoxilina e eosina (HE) secções coradas pela média do número de células com cromatina homogeneamente densa ou fragmentos nucleares karyorrhectic nas fotos de cinco selecionados aleatoriamente × 40 campos. Os casos foram avaliados por dois examinadores independentes. índice de apoptose (AI) foi calculada como se segue fórmula: AI = (o número de células apoptóticas /número total de células) × 100%

A fragmentação de ensaio de DNA de agarose por electroforese em gel de

ADN. fragmentos nos tecidos de tumor foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose, de acordo com o método descrito por Sambrook Russell (2001) [27]. ADN nos tecidos de tumor foi extraído utilizando o kit Gene Eluir Mammalian Genomic DNA Miniprep (Sigma), e submetido a electroforese em gel de agarose a 1,5% (contendo 0,25 ug /ml de brometo de etídio). As bandas electroforéticas foram visualizados e fotografados sob luz ultravioleta transmitida.

Western Blot Análise da BCL2 e Bax proteínas nos tecidos tumorais

As proteínas foram isoladas a partir de amostras tumorais xengrafted e foram separadas por SDS -Página usando o protocolo padrão. Depois bloqueou-se com 5% (w /v) de leite desnatado em pó, as membranas foram incubadas com anticorpos primários (monoclonal de ratinho Bax, BCL2 e anticorpos de p-actina, 1:1000 diluição) de acordo com as instruções do fabricante (Santa Cruz Biotechnology) e depois incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho, 1:8000 diluição). As proteínas foram detectadas com o sistema de quimioluminescência aumentada (ECL) (Pierce, Rockford, IL) seguido por exposição a filme de raios-X. p-actina foi utilizado como um controlo de carga. As imagens digitais foram capturados por Gel Doc ™ sistema de documentação de gel (Bio-Rad, EUA) e intensidades foram quantificados usando a versão Quantidade-One software 4,62 (Bio-Rad, EUA).

Análise Estatística

Todos os dados medidos foram apresentados ± como média

SD

. As diferenças entre os grupos foram analisadas usando o one-way ANOVA por SPSS12.0 software estatístico. A significância estatística foi definida como

P

. 0,05

Resultados

PGPIPN tratamento induziu a inibição de células de proliferação e apoptose de SKOV

3 células do cancro do ovário

em vitro

PGPIPN tem mostrado desempenhar um papel importante na terapia imunomoduladora e outros efeitos em muitas pesquisas [19] – [22], [28] – [29]. Este intriga-nos a investigar se PGPIPN pode ser usado como agente anti-cancro. Para este fim, primeiro investigou o efeito de PGPIPN sobre a proliferação de células SKOV

3 células. Para nossa surpresa, PGPIPN pode efetivamente suprimir o SKOV

3 de crescimento de células, mesmo em baixa dosagem de 3 × 10

8 g ​​/L (Figura 1A). Esta capacidade de inibição da PGPIPN foi comparado com o tratamento com 5-FU quando as células foram expostas a uma elevada concentração de 3 × 10

3 g /L. O efeito de inibição de PGPIPN também mostrou Manor tempo e dose-dependente. Além disso, em comparação com o controlo, tratamento PGPIPN conduziu a alterações morfológicas óbvias em SKOV

3 células, incluindo células encolhimento, cariopicnose, e aparência de vacúolos citoplasmáticos em algumas células (data não mostrado). Há também mostrou um profundamente corados na secção nuclear e uma grande quantidade de corpos citoplásmicos ou pequenos pedaços nas células tratadas com PGPIPN, que são as características típicas de células apoptic (dados não mostrados). Para validar esta observação, foi realizado o ensaio de apoptose com PI método de coloração dupla anexina V-TITC e. tratamento PFPIPN claramente induzida SKOV

3 células sofreram apoptose após exposição à droga de 48 horas a diferentes concentrações (Figura 1B).

(A) PGPIPN em diferentes concentrações inibe a proliferação de células SKOV

3 células, medida em diferentes pontos de tempo. Os dados apresentados são média ±

SD

de três experiências independentes, *

P

0,05, **

P

0,01 comparado com o controlo (o grupo de veículo). (B) A citometria de fluxo análise mostra que induzida tratamento PGPIPN SKOV

3 apoptose das células após a exposição à droga 48 h. Esta medida foi biologicamente triplicou.

PGPIPN pode efetivamente inibir o cancro do ovário primário Humano do Crescimento Celular

in vitro

Em seguida, testamos ainda se PGPIPN pode também inibir a o crescimento de células de câncer primário humano. Nós insolated com sucesso e estabeleceu 5 células cancerosas primárias de 5 doentes com cancro do ovário no momento da cirurgia redutora inicial no primeiro Hospital Filiado de Anhui Medical University. Estas células primárias foram cultivadas em nosso laboratório. Estas células são morfologicamente apresentado como células do epitélio típicos (Figura 2A esquerdo e painel do meio). Estas células de cancro do ovário primários foram ainda identificados por ensaio de imunocitoquímica com anticorpos anti-citoqueratina 7 coloração (painel da direita Figura 2A). A pureza média de células de carcinoma do ovário foi de aproximadamente 85% com base na coloração da citoqueratina 7. Para investigar se PGPIPN pode diminuir o crescimento das células de cancro do ovário primárias, que estas células semeadas em placas de 96 poços. Após crescimento durante a noite estas células foram tratadas com PGPIPN em diferentes concentrações de 24, 48 e 72 h. Tal como mostrado na Figura 2B, o tratamento com diferentes concentrações de PGPIPN levou a uma inibição significativa da proliferação de células de carcinoma do ovário, e o efeito de inibição mostrou Manor tempo e dose-dependente. Todos estes indicam que as células de cancro do ovário primários também são sensíveis ao tratamento PGPIPN.

(A) A representam morfologia de células de carcinoma do ovário a partir de um paciente crescendo em meio de cultura Primária (× 100, painel esquerdo), H e manchado (painel do meio) e anti-citoqueratina 7-FITC com detalhes (painel direito). ensaio (B) A proliferação celular mostra que PGPIPN em diferentes concentrações suprimiu o crescimento de células de ovário primário. Os dados são calculados a partir de 5 células cancerosas medições primárias e apresentados como média, e as barras de erro referem-se a DP de decuplicate análises, *

P

0,05, **

P

0,01 comparado com controle (o grupo de veículo).

PGPIPN teve pouco ou nenhum efeito sobre o crescimento celular sem transformação,

in vitro

os citotoxicidades de PGPIPN para linhagens celulares não transformadas foram investigados . ensaio de MTT foi realizado para testar os efeitos de PGPIPN sobre as proliferações de LO2 humano normal linha celular hepática e células de fibroblastos de embrião de murino (MEFs). O péptido foi observado qualquer efeito sobre a proliferação de células LO2 (Figura 3A). A proliferação de MEFs foi ligeiramente afectada pela PGPIPN, que foi significativamente inibida apenas com uma dose elevada (0,3 g /L) do péptido, durante 72 horas, mas a influência era muito menor em comparação com o grupo de controlo positivo (grupo 5-FU) ( A Figura 3B). Consequentemente, PGPIPN exibiram pouca ou nenhuma citotoxicidade para com células não transformadas, em comparação com os tradicionais fármacos anticancerígenos (5-FU).

(A) PGPIPN não teve nenhum efeito sobre a proliferação de células LO2. (B) PGPIPN ligeiramente afectado a proliferação de MEFs, que foi significativamente inibida apenas com uma dose elevada (0,3 g /L) do péptido, durante 72 h. Os resultados são expressos como média ±

SD

a partir de três experiências independentes, *

P

0,05, **

P

0,01 comparado com o controlo (o grupo de veículo) .

PGPIPN diminuiu significativamente o crescimento do tumor xenoenxerto

in vivo

Para determinar se PGPIPN tem um efeito anti-tumoral

in vivo

, nós enxertada

células SKOV 3 subcutaneamente em ratinhos nus. Vinte e quatro ratos foram aleatoriamente divididos em quatro grupos: NS (solução salina normal), uma dose baixa de PGPIPN, dose elevada PGPIPN e 5-FU (como controlo positivo) grupos, como descrito em Materiais e Métodos. PGPIPN foi administrada por via intraperitoneal a cada dois dias começando a partir do segundo dia após a inoculação das células tumorais. Solução salina serviu como controlo negativo, e 5-fluorouracilo foi usada como um controlo positivo. Estes ratos foram tratados durante 4 semanas. Na quarta semana, os tumores foram retirados e medidos. Ambas as doses de PGPIPN podem inibir significativamente o crescimento do tumor em comparação com o grupo NS (Figura 4A). Tumores no grupo NS cresceu para um volume médio de (1370,25 ± 303,12) mm

3. Em contraste, os tumores no grupo de baixa dose PGPIPN, grupo de altas doses PGPIPN e grupo 5-FU cresceu para um volume médio de (845,43 ± 205,09) mm

3, (346,78 ± 97,16) mm

3 e (705,82 ± 124,47) mm

3, respectivamente (Figura 4A). Em comparação com o grupo SN, as taxas de inibição do grupo de dose baixa PGPIPN, o grupo de dose elevada e PGPIPN grupo 5-FU foram 36,92%, 68,46% e 41,54% respectivamente. Consistentemente, os tamanhos dos tumores (Figura 4B) ou pesos (Figura 4C) foram notavelmente diminuiu em todos os grupos de tratamento com fármacos, em comparação com o grupo de controlo. Em conjunto, estes dados indicam que PGPIPN pode inibir eficazmente o crescimento do tumor xenoenxertado

In vivo

, o que está em comparação com a droga anti-ovariano, 5-fluorouracilo tradicional.

PGPIPN crescimento do tumor significativamente inibida após quatro -weeks tratamento (a) e diminuiu o tamanho do tumor (B) e o peso do tumor (C) no final do tratamento. Os dados são apresentados como média ±

SD

de 6 ratos, *

P Art 0,05, **

P

. 0,01 comparado com o grupo NS

Inibição Tumor crescimento induzido por PGPIPN está associada com celular apoptose

in vivo

a citometria de fluxo análise mostrou que PGPIPN induzida SKOV

3 células sofreram apoptose

em

vitro (Figura 1B). Para testar se PGPIPN também pode induzir apoptose em células de tumor tratamento

In vivo

, foi realizado ensaio TUNEL nas amostras tumorais extraídos de ratinhos nus enxertados. O número de células positivas TUNEL em amostras de tumores extraídos dos grupos de tratamento PGPIPN foi significativamente aumentada (Figura 5 A e B). Em consistente com esta observação, ensaio fragmento de DNA também demonstrou a degradação de ADN em amostras de tumores notável-tratados PGPIPN, indicando que as células apoptóticas percentagem elevada nestas amostras (Figura 5 C). Em contraste, as amostras de tumor tratado NS não mostram este padrão em escada de ADN em electroforese típica (Figura 5 C). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que PGPIPN inibe o crescimento tumoral através da indução de células tumorais a sofrer apoptose. Ensaio

(A) mostra TUNEL as células tumorais apoptose nas amostras tratadas com PGPIPN extraídos a partir de murganhos de xenoenxerto (× 400). índice de (B) foi calculado como apoptótica seguinte fórmula: IA = (o número de células apoptóticas /número total de células) x 100% (média ±

SD

, n = 6), **

P Art 0,01. ensaio (C) fragmento de ADN que mostra induzida PGPIPN degradação do ADN do tumor no grupo de dose elevada PGPIPN (alto) e baixa dose grupo PGPIPN (baixo), mas não no grupo de solução salina normal (NS). os níveis de (D) de proteína BCL2 e Bax foram examinadas por western blot em amostras de tumores extraídos a partir de ratinhos xenoenxertados (painel de cima). As intensidades das bandas foram medidos por um software de imagem J e resumidos (painel inferior). Os dados são da 6 tumores de cada grupo, *

P Art 0,05, **

P

. 0,01 comparado com o grupo NS

Para mais confirmar que a indução de apoptose está envolvida na regressão do crescimento do tumor após o tratamento PGPIPN, dois genes relacionados com apoptose,

BCL2

e

Bax

, foram avaliados através de análise por transferência de western. ensaio de imunotransferência com anticorpos BCL2 e Bax demonstraram que os níveis de proteína BCL2 foram significativamente reduzida nos grupos tratados com PGPIPN (

P

0,05 ou

P

0,01) comparado com o do grupo de controlo (Figura 5D). Em contraste, as expressões de Bax foram dramaticamente regulado para cima em grupos tratados com PGPIPN, em comparação com o controlo (Figura 5D). Estes dados sugerem claramente que PGPIPN inibiu o crescimento tumoral pelo menos em parte, pela indução de apoptose de células.

Discussão

Muitos péptidos bioactivos derivados de proteínas do leite são inactivos nas suas proteínas do leite pai, e sobre libertado durante a digestão ou processamento de alimentos, eles podem agir como compostos de regulamentação com atividades biológicas. No presente estudo, nós somos os primeiros a mostrar que PGPIPN pode profundamente inibir as células cancerosas do ovário humano, tanto no modelo de murganho de xenoenxerto, bem como nas células de cancro primário sem efeitos tóxicos não específicos, sugerindo PGPIPN pode ser um novo agente anticancro e deve ser considerados para posterior julgamento pré-clínico em outros tipos de câncer.

os peptídeos terapêuticos podem através de diferentes mecanismos sofrer os efeitos anticancerígenos dependentes de suas características. Alguns péptidos interagem especificamente com muito ciclinas e /ou quinases dependentes de ciclina ou com membros de cascatas apoptóticas [30] – [31]. Estudos recentes demonstraram que os péptidos podem prejudicar as vias específicas de sinalização e, subsequentemente, inibiu o crescimento tumoral ou metástase [8] – [9], [32]. No nosso estudo, o cancro antiovarian de PGPIPN foi principalmente através da indução da apoptose mediada por regulação negativa de BCL2 (Figura 5). Em consonância com esta observação, também encontramos muitas mudanças morfológicas relacionadas à célula apoptose, tais como, picos de celulares, bolhas de superfície, bolhas e arredondamento celular e fragmentação nuclear (data não mostrados).

Exatamente como PGPIPN down- expressão BCL2 regulada é ainda a ser determinado. pesquisas anteriores demonstraram que os dois péptidos derivados de β-caseína humana (GLF e VEPIPY), pode ligar-se à membrana celular [33] – [34]. Recentes estudos indicaram que alguns péptidos bioactivos derivados de proteínas do leite de bovino eram capazes de se ligar e afectar as células [13], [35] – [38]. Por exemplo, Kreider RB et ai. [13] relataram que uma mistura de péptidos de leite romance inibiram a actividade de tirosina-quinase de receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR), factor de crescimento endotelial vascular receptor 2 (VEGFR2), e receptor de insulina (IR), respectivamente. Este inibidor multi-quinase causou apoptose em HT-29 células cancerígenas do cólon

in vitro

, ao passo que a mistura de peptídeos do leite foi seguros para o consumo por via oral a voluntários saudáveis ​​e clinicamente significativos efeitos colaterais foram relatados [13]. Fiedorowicz E, et al. relataram a bioactivo péptidos-casomorfina-7 (YPFPGPI), casoxin-D (YVPFPPF) e casoxin-6 (SRYPSY) a partir de caseína bovina foi possível ligar o receptor μ-opióide em cytomembrane para influenciar a proliferação e secreção de citocinas de células mononucleares de sangue periférico humano ( PBMC) [35]. Almansour NM et al. [2], [39] relatou que análogo peptídico vírus mixoma pode direcionar a via de sinalização Akt como uma possível via de morte celular em células de câncer de pele humanos.

Em nossa experiência em curso, observamos que PGPIPN marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) surgiu em SKOV membrana

3 célula sob microscópio confocal de varrimento de laser (CLSM) (data não mostrado), indicando que este péptido pode ligar-se a membrana celular, como alguns outros péptidos de proteína do leite. Nós fundamentado que PGPIPN pode ligar-se ao receptor de célula específica (s) e vias de transdução de sinal celular desregular, e reduziu a expressão de BCL, a apoptose celular induzida em seguida. Todos estes necessitam de ser investigadas no trabalho futuro. Claro, pode PGPIPN através através de outros mecanismos de afectar o crescimento celular.

Em resumo, o hexa-peptideo pode PGPIPN proliferação de células de cancro do ovário eficazmente inibida tanto in vitro como in vivo. Este efeito de inibição ocorre principalmente através PGPIPN apoptose de células de cancro induzido. Estes dados sugerem que PGPIPN é um peptídeo terapêutica potente para o tratamento de câncer de ovário, e proporcionar uma base racional para uma avaliação mais aprofundada na clínica.

Reconhecimentos

Gostaríamos de agradecer Lianfang Zhang e Liyu Cao a partir do primeiro hospital afiliada da Universidade de Medicina de Anhui, por sua assistência em pegar, avaliar e classificar tecido tumoral ovariana primária frescos, de 5 pacientes com câncer de ovário no momento da cirurgia redutora inicial no primeiro hospital afiliada da Universidade de Medicina de Anhui.