Abstract

A composição da microbiota intestinal humana está ligada ao estado de saúde. O objetivo foi analisar a microbiota de pacientes com câncer de cólon normais e para estabelecer disbiose relacionada ao câncer

Pacientes e Métodos

DNA bacteriano

Stool foi extraído antes da colonoscopia de 179 pacientes: 60. com câncer colorretal e 119 com a colonoscopia normal. genes bacterianos obtidos por pyrosequencing de 12 amostras de fezes (6 normais e de cancro) 6 foram submetidos a um teste validado Análise principal de componentes (APC). A população bacteriana dominante e subdominante (

C. Leptum

,

C. Coccoides

,

Bacteroides /Prevotella

,

/Leuconostoc /grupos Pediococcus Lactobacillus

,

Bifidobacterium género

, e

e. coli,

e

Faecalibacterium prausnitzii

espécies) foram quantificados em todos os indivíduos usando qPCR e células produtoras IL17 específicos na mucosa intestinal foram caracterizados por imuno-histoquímica.

achados

pirossequencia�o (Minimal sequência de 200 nucleótidos lê) revelou 80% de todas as sequências poderia ser atribuído a um total de 819 taxa com base em parâmetro padrão de software classificador. O núcleo filogenética em indivíduos câncer foi diferente do que em indivíduos normais de acordo com a análise PCA, com tendência a diferenças nas famílias dominante e subdominante de bactérias. Consequentemente, todo-bactérias [log

10 (bactérias /g de fezes)] em Normal, e os indivíduos câncer foram semelhantes [11,88 ± 0,35 e 11,80 ± 0,56, respectivamente (P = 0,16)], de acordo com os valores qPCR enquanto que entre todas as espécies dominante e subdominante apenas os de

Bacteroides /Prevotella

foram maiores (Todos os bactérias específicas bactéria; P = 0,009) em Câncer (-1,04 ± 0,55) do que em normal (-1.40 ± 0,83) indivíduos . células imunorreactivas IL17 foram significativamente mais expressa na mucosa normal de pacientes com câncer do que naqueles com colonoscopia normal.

Conclusão

Este é o primeiro estudo grande, para demonstrar uma mudança de composição na microbiota do cólon pacientes com câncer com possível impacto sobre a resposta imune da mucosa. Esses dados abrem novas arquivado para a triagem e fisiopatologia investigações massa

Citation:. Sobhani I, J Tap, Roudot-Thoraval F, Roperch JP, Letulle S, Langella P, et al. (2011) Microbial Dysbiosis no cancro colorectal (CRC) pacientes. PLoS ONE 6 (1): e16393. doi: 10.1371 /journal.pone.0016393

editor: Sylviane Pied, Lille 2 University, França |

Recebido: 12 de setembro de 2010; Aceito: 14 de dezembro de 2010; Publicação: 27 de janeiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Sobhani et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Cancéropôle Ile de France, Comica 2007-2010 projecto, (Charles Debray associação ACD); LNCC (francês Liga Nacional contra o Câncer), CCR Promoção INSERM (2004-2006). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cólon humano contém até 10

14 bactérias [1]. Eles desempenham um papel importante na fermentação de alimentos residual, a modulação da função imune do intestino, e a protecção contra agentes patogénicos e doenças [2] – [5]. Embora a microbiota intestinal é altamente benéfica, mudanças nas populações bacterianas ou nos produtos de metabolismo bacteriano pode contribuir para a doença.

Em 1971, um estudo destinado a identificar associações entre composição da microbiota humana e carcinogênese colorretal, mas tinha a ser abandonado por causa de dificuldades técnicas. Mais tarde, Moore e colegas de trabalho relataram que 13 espécies de bactérias foram significativamente associados com um risco elevado de câncer de cólon e dieta ocidental [1]. No entanto, os resultados foram um pouco convincente, porque eles investigaram um pequeno número de indivíduos e nenhuma investigação intestinal ou seja, radiologia ou colonoscopia foi realizada. No entanto, uma vez que este estudo foi realizado, a microbiota do cólon humano emergiu como um importante fator ambiental que parece modular o risco de câncer de cólon, e disbiose na microbiota intestinal é acreditado agora para ser um fator subjacente ao desenvolvimento da doença em geneticamente indivíduos -predisposed. No entanto, não há evidência de se dysbiosis realmente ocorra no cancro do cólon.

Apenas um conjunto restrito de populações bacterianas na natureza têm sido identificados no corpo humano e cerca de 80% das bactérias humanos identificados por ferramentas moleculares ou seja sequenciamento metagenomic, são considerados incultivável [6]. Embora algumas espécies bacterianas prevalentes em indivíduos normais são agora identificados usando toda sequenciação do genoma [7], mais de 60% das espécies permanecem desconhecidas e não há dados sobre como disbiose, se houver, pode ocorrer em pacientes com câncer de cólon. Assim, sequenciamento de DNA que tem como alvo regiões hipervariáveis ​​dentro de genes de RNA da subunidade ribossômica pequeno, especialmente genes 16S rRNA tornou possível caracterizar a biodiversidade da microbiota, o que pode levar a doenças (para uma revisão, ver ref [8]). O gene 16S rRNA ribossomal é um componente que é conservada em todas as bactérias, e que contém sequências variáveis ​​que conferem especificidade de espécie. De acordo com esta técnica taxa predominante nas microbiota intestinal humana são relatados para ser

Clostridium leptum,

C

coccoides lostridium, of the

grupos Bacteroides /Prevotella

e

Bifidobacterium

género [9]. A abordagem PCR em tempo real quantitativo (qPCR) foi adaptado para avaliar estas populações bacterianas em grandes números de amostras [10] – [11], e as mudanças nos componentes da microbiota pode agora ser estudado em relação ao estado de saúde /doença. Espécies envolvidas terão impacto estudos experimentais e metabólicas com novas abordagens fisiopatologia. Por exemplo,

Bacteroides

populações e, mais especificamente os de

Bacteroides fragilis

, foram recentemente mostrado para produzir uma metaloprotease em pacientes com câncer de cólon, mas não nos controles [12]. Esta bactéria espécie tem sido demonstrado induzir respostas de células T reguladoras da mucosa no intestino envolvendo o recrutamento TH17 celular em animais [13] – [14], o que sugere fortemente que podem alterar a homeostase de populações de células T efectoras auxiliares no intestino [14] – [15].

usando a técnica pyrosequencing, relatamos evidência de que a doença do cancro do cólon está relacionada com disbiose principalmente devido a uma mudança na espécie dominante e subdominante. Usando qPCR, comparamos comunidades bacterianas intestinais em indivíduos normais e naqueles com câncer de cólon na maior série até agora relatada e mostrar nível de disbiose sobre as espécies da microbiota dominantes. Colocamos esses resultados em perspectiva com mucosa homeostase imunológica e marcador de fezes para o rastreio em massa

Resultados

Características dos indivíduos

Eles foram classificados da seguinte forma:. Normal (n = 119 ), que tinha colonoscopia normal; aqueles com dois pontos (n = 44) ou rectal (n = 16) cancro (n total = 60). Os doentes com cancro foram pareados por sexo (obviamente dois normal para um câncer), mas foram 10 anos mais velho do que aqueles com colonoscopia normal (Tabela 1) como em nossa coorte (Tabela S1 na Suplementar S1 Arquivo) em porque os indivíduos consecutivos foram incluídos. indivíduos normais com menos frequência relataram uma história pessoal prévia de pólipos ou uma história de cancro do cólon em sua família e não apresentam diferença em relação IMC. Assim, para além de este item e idade, eles foram pareados por outros principais características, incluindo IMC e alimentos ou remédios captação com o grupo de paciente com câncer (Tabela 1, Tabela S1 e Figura S1 na Suplementar S1 Arquivo).

problema Filogenia com base na distribuição taxon

de todo conjunto de dados, 1,210,781 sequências aparadas foram obtidos e 978.710 destes poderia ser atribuído a um total de 819 táxons (Tabela S2 na S1 Documento suplementar). A rarefacção dos dados foi realizada e deu uma representação adequada da diversidade da comunidade microbiana do intestino (Tabelas S1, S2 Tabela e Figura S3 na S1 Documento Suplementar). Foram identificados 18 géneros bacterianos com uma abundância de mais do que 1%, e estes géneros incluiu 75% das sequências. Treze dos 18 gêneros (

Alistipes, Collinsella, Bacteroides, Lachnospira, Prevotella, Subdoligranulum, Dorea, Faecalibacterium, Roseburia, Coprococcus, Streptococcus, Bifidobacterium

e

Ruminococcus)

correspondeu intestinal humana microbiota núcleo filogenética [16]. análise PCAIV também mostraram que cerca de 5% da variabilidade podia ser atribuído ao estado de doença de cada uma das amostras (normal versus cancro; p 0,05), e a taxa indicativa da microbiota de indivíduos normais e cancerosas foram claramente distinguidos (Figura 1 e Figura S2 em S1 complementar Arquivo). Além disso, 55 para fora das 66 espécies bacterianas pertencentes ao núcleo filogenética anteriormente descritas foram detectadas nestas amostras. O teste de Monte Carlo mostraram que mais de 7% da variabilidade foi impactado pelo estado de saúde (Normal contra o cancro; p 0,05). A variação dentro pessoa era baixa e insignificante em comparação com entre pessoa-variação (Figura 1 e Tabela S4 em S1 complementar Arquivo).

Análise de componentes principais, com base no 16S rRNA abundância sequência do gene de 7 discrimina gêneros que representavam pelo menos 1% de abundância microbiota, foi levada a cabo com 6 indivíduos saudáveis ​​(N) e seis pacientes do cancro * (CA), com duas repetições (anotado como MiD1 e mid2). Dois primeiros componentes (PC1 e PC2) foram plotados e representou 70,83% da inércia todo. Indivíduos (representados por sua ID da amostra) foram agrupadas e centro de gravidade calculado para cada classe. * Todos eles foram selecionados a partir da fase I-II da classificação TNM (ver também Tabelas S2 e S3 e S2 Figuras S3 na S1 complementar Arquivo)

Comparação das populações bacterianas nas fezes

Todos os-bactérias níveis não diferiram nos grupos normais e cancerosas (Tabela 2), enquanto foi observada uma diferença significativa para

grupo Bacteroides /Prevotella

. Esta diferença foi relacionado com o nível elevado de bactéria em cancro, em comparação com os grupos normal (Tabela 2). Tomando todos os indivíduos juntos

Bacteroides /Prevotella

nível de densidade grupo não estava ligada à idade ou IMC (r = 0,05; p = 0,46; ver também Figura S1 S1 complementar Arquivo). Tomando todos os indivíduos com câncer os níveis de bactérias não foram relacionados com o tamanho do tumor ou o estadiamento do tumor referindo-se à classificação internacional TNM (Figura S1 S1 arquivo suplementar) e pequenos carcinomas invasivos poderia estar associada com altos níveis de densidade bacteriana. Os níveis de

Bacteroides /Prevotella

grupo não foram influenciados por outras características do paciente, como idade, IMC, a razão para a colonoscopia, a história prévia de pólipos ou de câncer em sua família (Tabela S1 no arquivo suplementar S1), com o tamanho ou local (esquerda para a direita contra a face, ou rectal contra cólon) do cancro (Tabela 2). Para as outras bactérias dominantes ou subdominante ou seja,

C. leptum

grupo,

C. coccoides

grupo, os

Lactobacillus /grupos Leuconostoc /Pediococcus

, o

Bifidobacterium

género,

E. coli,

e

Faecalibacterium espécies prausnitzii

, não encontramos qualquer diferença entre pacientes versus indivíduos colonoscopia normal.

IL17 células do sistema imunológico e

Bacteroides

em mucosa

Estas células foram encontrados infiltrando maioria das amostras de tumor (pontuação ++ a +++) e no

lâmina própria

da mucosa normal homóloga (pontuação + a ++) no câncer as amostras de tecido dos pacientes, enquanto foram raramente ou não detectado na mucosa normal (0 a +/-) em indivíduos normais (Figura 2). No teste estatístico paramétrico mostrou pontuação significativamente maior IL17 imunocoradas celular em mucosa normal de pacientes com câncer de cólon do que em indivíduos colonoscopia normal (média +/- contra ++; p 0,5). Após a coloração dupla (CD3 e IL17) de secções de tecidos em série, a maioria das células imunorreactivas IL17 foram encontrados como sendo de CD3 marcador em ambos (mucosa normal ou homólogas para o cancro mucosa normal) casos, embora todas as células CD3 não foram imunocoradas com anticorpo IL17. No entanto, as relações de IL17 /CD3 em mucosa de cólon normal, não apareceu significativamente diferente entre normal e cancro indivíduos colonoscopia (Figura 2C, D). Estas descobertas células imunitárias semi quantitativas foram relacionados com aderente tecido específico

Bacteroides

densidade (Figura 3).

Bacteroides

produto de amplificação do gene foi encontrado 1000 vezes mais expressos nas fezes do que em amostras de tecido do cólon como revelado por qPCR (Figura 3B). Além disso, o

Bacteroides

produto de amplificação foi significativamente mais elevada em doentes com cancro do cólon ‘tecidos (normal, bem como tumoral) do que em indivíduos normais »tecidos tal como avaliado por qPCR e revelada por análise em gel (Figura 3 e Figura S4 S1 arquivo suplementar). Em pacientes com câncer colorretal,

Bacteroides

produto de amplificação do gene foi significativamente maior no tecido tumoral do que no tecido homólogo normal (Figura S5 em S1 complementar Arquivo).

As amostras dos mesmos indivíduos e locais de cólon foram submetido à extracção de ADN e PCR. A interleucina 17 (IL17) células -immunoreactive nos tecidos do cólon foram localizadas principalmente no

lâmina própria

nos tecidos normais [A: mucosa normal do cólon de um indivíduo normal (x40 ampliação alta na parte inferior), B: cólon mucosa normal a partir de um paciente com cancro do cólon (x40 alta ampliação, na parte inferior)] e infiltrou-se no tecido de tumor num mesmo indivíduo do que em B [C: células imlmunoreactive IL17 que se infiltram no tumor com X40 alta ampliação, na parte inferior D: Neste IL17 coloração dupla e CD3, foi adicionado o anticorpo de IL-17 de cabra anti-humano antes de coloração com naftol /Fast (vermelho), seguido pelo anticorpo anti-CD3 humano de coelho que foi revelado com substrato DAB (castanho); Isso mostrou que CD3 não foi a única célula produtora de IL-17.

No tecido sistema mostra a migração gel (A) do indivíduo normal,

rácios Bacteroides

/albumina perto de 1, enquanto eles aparentemente mais elevada no tumor (Ca) homóloga mucosa normal (N) ou em tecidos do paciente cancro do cólon (B). Note-se que

Bacteroides

produto de amplificação do gene em fezes é dramaticamente maior do que a detectada a partir de DNA da mucosa; amplificação é referido gene de albumina humana.

Discussão

Nós relatamos diferenças na microbiota do cólon em indivíduos com cancro do cólon versus aqueles com uma colonoscopia normal. Mostrámos que a distribuição de géneros bacterianos na microbiota variada, dependendo do seu estado de doença, e qPCR revelou uma elevação significativa de o

Bacteroides /Prevotella

população em doentes com cancro que parece estar ligado com IL17 elevada em células produtoras a mucosa dos indivíduos com câncer.

Este estudo compara os indivíduos que apresentam uma colonoscopia normal ou doente. Embora aqueles com uma colonoscopia normal não eram voluntários saudáveis, elas podem ser consideradas como constituindo um grupo de controlo significativo. Isso é porque eles foram escolhidos aleatoriamente de entre indivíduos consecutivos que haviam sido encaminhados para colonoscopia, que foi encontrado para ser normal. A fim de reduzir o viés foram selecionados 2 indivíduos normais para o caso de um câncer. As suas características condiziam com os dos doentes no grupo de cancro, excepto para a sua idade e casos de cancro ou pólipos em parentes. As diferenças de idade refletem os dados epidemiológicos na literatura. disbiose bacteriana encontrada em nosso estudo foi claramente independente da idade. Nenhuma das diferenças microbianas observados neste estudo estava relacionado com a idade. Outra diferença entre casos e controles preocupações maior prevalência de neoplasias em familiares de pacientes com câncer de cólon. Isso pode refletir o papel dos fatores ambientais em vez de alterações genéticas germinais uma vez que nenhum dos pacientes apresentavam estigmas de Lynch ou polipose adenomatosa doenças síndrome PAF familiares.

técnicas de sequenciamento de rendimento alto para microbiota humana tem contribuído substancialmente para revelar uma diferença na o núcleo filogenética bacteriana em indivíduos normais e aqueles que sofrem de várias doenças [7]. No entanto, esta abordagem não incluem a doença de câncer. A fim de verificar se núcleo filogenética foi diferente em indivíduos e pacientes com câncer saudável, genes 16S rRNA têm sido alvo de pyrosequencing como uma alternativa para a todas as bactérias sequenciação do genoma. Com efeito, a região variável de V3 V4-16S de rRNA pode ser utilizado para proporcionar uma classificação de bactérias da microbiota humano [17], com base em pyrosequencing. Usando esta tecnologia, nós claramente identificados mais de 40.000 sequências informativos sobre a região do gene V3-V4 16S rRNA a partir de cada amostra de fezes, no presente estudo, o que levou à construção do núcleo filogenética da microbiota [16]. Este núcleo filogenética verificou-se ser diferente em pacientes com cancro em comparação com indivíduos normais. As diferenças em causa populações bacterianas dominantes particularmente dominantes e sub. É muito pouco provável que as diferenças que encontramos por pyrosequencing poderia ser epifenomenal, já que todos os pacientes foram incluídos por meio de um procedimento padronizado (sexo e pareados por idade, condições de colheita de amostras de fezes e de extração de DNA) e semelhanças de sequência entre duplicados (dentro de pessoa variação ) era muito alta. Consequentemente, os grupos principais, gênero e espécie fora de populações bacterianas dominantes dominantes e sub, foram quantificados por qPCR que agora é rotineiramente utilizada para quantificar a composição bacteriana da microbiota de pessoas saudáveis ​​ou doentes ou animais [9], [18]. A densidade de “todos-bactérias” em amostras de fezes não reflectir os resultados da colonoscopia, embora um (isto é .;

Bacteroides

) das sete espécies estudadas aqui foi encontrado para ser maior em indivíduos do grupo de câncer. Todos estes métodos são validados, e rotineiramente utilizado [6]. Embora pyrosequencing técnica, que deve ser considerada como uma ferramenta de semi quantitativa indicou muitas outras espécies bacterianas mudança, apenas espécies dominantes e subdominantes principais foram quantificados no presente estudo por qPCR. Além disso, análises moleculares incluem espécies relacionadas com diferenças na permeabilidade da sonda, e propriedades de amplificação, e por causa do relativamente pequeno número de sondas disponíveis para analisar as muitas espécies de intestino descaracterizados [19], não podemos excluir a possibilidade de que possa ter perdido outro significativo diferenças em densidade microbiana. Então, isso não deve excluir possibilidade de diferenças entre grupos de pacientes em termos de taxa de bactérias ou espécies que agora exigem uma investigação mais aprofundada com base nos resultados de alto rendimento de sequenciamento para microbiota canceroso e controle. A sequenciação à base de gene rRNA pode detectar os membros predominantes da comunidade, mas estas abordagens podem não detectar os membros raros de uma comunidade com sequências alvo divergentes. Para superar as limitações de single-base gene seqüenciamento amplicon por pyrosequencing, todo o genoma shotgun sequenciamento surgiu como uma estratégia atraente para avaliar a diversidade microbiana complexa em populações mistas [7]. No entanto, esta é a maior investigação microbiológica para ter sido relatado até agora, e ao grande número de indivíduos inscritos com colonoscopia e histopatologia características conhecidas torná-lo muito robusto e pode abrir caminho para novos campos fisiopatológicos e novos marcadores de triagem.

A razão para uma associação entre

Bacteroides /Prevotella

elevação densidade grupo como avaliado por qPCR e tumores do cólon malignas não é clara. Todos os iniciadores utilizados para qPCR neste estudo foram concebidos para quantificar as espécies dominantes dominantes e sub como sugerido pela abordagem pirossequenciao. Se tais diferenças microbiológicos encontrados no presente estudo são causa ou consequência da constatação do tumor no preocupações colonoscopia abordagem mecanicista que não foi projetado para ser analisado aqui e requer estudos prospectivos. No entanto, pode-se especular que o

Bacteroides /Prevotella

densidade grupo não é provavelmente a consequência da ocorrência do tumor porque seus níveis não se correlacionaram com o tamanho do tumor ou estadiamento da doença e

Bacteroides

espécies do gênero pode ser detectado a partir lavada mucosa sugerindo que pertence a mucosa grupos de bactérias aderentes. Primers Nós projetamos alvo

Bacteroides Comprar e

Prevotella

populações género. Mudanças no

Prevotella

só foram relatados nas cavidades orais e gástricos [20], sem qualquer ligação com o crescimento do tumor. Em contraste,

Bacteroides

populações género e, mais especificamente os de

Bacteroides fragilis

, foram recentemente mostrado para produzir uma metaloprotease em pacientes com câncer de cólon, mas não nos controles [12] sugerindo que este sub espécies população pode favorecer carcinogênese. É digno de nota que, entre os muitos mecanismos que podem mediar a associação entre a microbiota e saúde humana [21] – [22], a activação pró-inflamatória e imunitária celular na mucosa do cólon são de grande importância em relação à malignidade. Alguns membros da microbiota intestinal podem dirigir respostas das células T do hospedeiro [13], [15] outras podem manter a homeostase de populações de células T efectoras auxiliares no intestino [14].

B. fragilis

foi mostrado para induzir respostas de células T reguladoras da mucosa no intestino envolvendo o recrutamento de células TH17 em modelos experimentais [13] – [14]. De interesse mucosa aderente

Bacteroides

espécies em nosso estudo parece mais elevado em doentes com cancro do cólon do que em indivíduos normais colonoscopia em uma proporção ligada à mucosa IL17 densidade de células imunorreactivas. Isto é consistente com o nosso estudo anterior em que humana relatado células TH17 sobre-expressão em mais de 80% do cancro do cólon micro ambiente esporádica [23]. células imunorreactivas IL17 infiltrar mais a mucosa de cólon normal de homólogos de doentes com cancro do cólon do que os tecidos normais em indivíduos normais como colonoscopia avaliada por imuno-histoquímica ou ARNm qPCR quantificação da mucosa (dados não mostrados). Estes podem sugerir a activação das células T pode estar associada com a mudança das mucosas devido a IL17

Bacteroides

como relatado em modelos animais [13] – [14], [21] – [22]. Resumidamente, estes dados argumentou a favor de uma resposta imunológica perturbada em tecidos de cancro do cólon com IL-17 superprodução exacerbando [24] – [25] a doença provavelmente devido ao

Bacteroides

interessante adicionais. aspecto da microbiota é o seu valor potencial como um marcador de cancro do cólon desde maioria dos pacientes podem ser identificados a partir de uma elevação da

Bacteroides /Prevotella

população, com a possibilidade de um teste quantitativo, de corte com base na especificidade taxa. Em comparação com a colonoscopia até agora as elevações de

Bacteroides

nas fezes e /ou IL17 células imunorreactivas na mucosa normais parecem ser promissores marcadores sensíveis.

Métodos

de setembro de 2004 a setembro de 2006, 648 indivíduos com uma média ou superior a média de risco de CRC (por exemplo, com história de câncer em parentes ou um passado histórico pessoal de pólipos ou qualquer abdominal ou sintomas relacionados intestinais ou anemia que exigia colonoscopia), foram incluídos em um estudo cobrança bancária amostra. Para ser elegível para inclusão, os pacientes tinham que ter sem história prévia de cólon ou cirurgia rectal, de doenças como câncer, ou de lesões inflamatórias ou infecciosas do intestino, e não precisar de uma colonoscopia de emergência. Duas semanas antes da colonoscopia, os pacientes foram incluídos depois de dar consentimento informado e foram convidados para dar uma amostra de fezes frescas dentro de 2 semanas até três dias antes da colonoscopia. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da área Val de Marne Paris-EST que autorizou inscrição pacientes em todos os centros associados. Todos os pacientes receberam informações sobre o estudo, os seus objectivos, e as amostras devem dar. Toda a informação foi dada por uma letra digitada escrito em consentimento francês e formal foi obtido de uma forma triplicado; uma delas foi conservada pelo paciente, mantemos uma cópia do departamento de investigação clínica (CIC) e a última cópia é conservada pelo promotor (Instituto Nacional de pesquisa científica em medicina-INSERM). Assim, um consentimento formal é disponível para cada paciente. Em todos os casos as amostras de fezes foram coletadas antes da limpeza intestinal para colonoscopia. Quaisquer dietas específicas (diabéticos, vegetarianos) e medicamentos (medicamentos anti-diabéticos, hypocholesterolemics e laxantes) durante este período foram registrados. Um anestesista visitou os participantes pelo menos três dias antes da colonoscopia programada. O período de estudo continuou até que os dados colonoscopia e patologia tinha sido marcada, eo status final poderia ser designado como “colonoscopia normal”, “tumor na colonoscopia” ou “outras anormalidades na colonoscopia”. Eles foram detidos em uma coleção bio-banco de fisiopatologia ou de triagem teste de estudos, incluindo o relatado. Depois de correspondência sexo entre indivíduos com tumoral e colonoscopias normais, amostras de 180 pacientes (um paciente de câncer por 2 indivíduo com colonoscopia normal) que foram verificados não tomar antibióticos com um ou resultados “normais” “câncer” foram submetidos a bactéria análise de DNA na série atual.

amostras fecais e DNA bacteriano extração

fezes frescas inteiras foram coletadas em caixas estéreis, e dentro de 4 horas 10 gr foram congelados a -20 ° C, para análise. ADN bacteriano foi extraído a partir de alíquotas de fezes, e depois da precipitação final, o DNA foi ressuspenso em 150 ul de tampão TE e guardados a -20 ° C para posterior análise, tal como previamente descrito [26].

pirossequenciao análise de fezes

amostras de DNA bacteriano a partir de 6 pessoas (3 machos e 3 fêmeas sendo selecionados aleatoriamente), com uma colonoscopia normal, e 6 pacientes pareados por idade e gênero com CCR invasivo da fase I ou II da classificação TNM , foram utilizados para construir bibliotecas de ADN 12. Os seguintes iniciadores 16S rRNA universais foram usadas para a reacção de PCR: V3F (TACGGRAGGCAGCAG) [27] e V4R (GGACTACCAGGGTATCTAAT) [28] para segmentar região V3-V4, que dá a mais baixas taxas de erro [29]

sequências de código de barras (tecla GsFLX) TCAG e MIDGsFLX (12 nucleotídeos) foram anexados entre o 454 GsFLX sequência adaptator eo V3F iniciador directo. A chave GsFLX eo GsFLX adaptator 454 foram anexados ao iniciador inverso. A concentração e a qualidade dos produtos de PCR foram analisados ​​com Picogreen, a fim de obter quantidades iguais de cada uma das amostras (10

8 moléculas /ul), e, em seguida, amplicões do gene 16S rRNA foram sequenciados num Roche GS FLX 454 sequenciador ( Genoscreen, Lille, França) e processados ​​com protocolo padrão do fabricante (https://genoscreen.fr/). Para validar a presença dos taxa bacteriana específica nos 2 grupos de pacientes, apesar da variabilidade devido ao processo técnico, cada amostra de ADN foi sequenciado em duplicado. Assim 12 fezes extractos bacterianos de DNA foram submetidos a análise pirossequenciao, com duas repetições de cada. Esses 24 conjuntos de seqüências foram submetidos ao indivíduo intra e analisa, entre individuais e índices de diversidade clássicos foram computados. sequências comuns em dois duplicados foram considerados para cada indivíduo; em seguida, entre indivíduo e inter grupo análises foram realizadas de acordo com a “Normal” versus status “Cancer”.

Quantitative PCR análise

Foi utilizado um tempo real técnica de qPCR para investigar a diferença de densidades bacterianas dentro do microbiota entre fezes dos pacientes normais e de cancro (N = 179) e o DNA da mucosa (N = 44). Os iniciadores e as sondas utilizadas neste estudo foram descritas noutro local [26], e são apresentados na Tabela S1 S1 complementar do ficheiro. -QPCR em tempo real foi realizado utilizando um 7000 Sequence Detection System ABI com o software de versão 1.2.3 (Applied Biosystems-, Foster City, CA, EUA), e o número total de bactérias foram inferidos a partir de curvas padrão calculados e expressos como valor log 10, enquanto previamente descrito [26]. Os valores de qPCR foram obtidos por paciente e para cada componente da microbiota intestinal (total n = 180 pacientes, 60 com câncer e 119 com a colonoscopia normais, uma amostra faltando). Para ultrapassar o facto de amostras fecais pode conter mais ou menos água, os dados para cada amostra fecal foi normalizada, tal como anteriormente descrito [26]. O nível encontrado para cada população bacteriana dominante e sub-dominante particular foi subtraída de todos os-teor de bactérias, e os resultados são expressos como o logaritmo do número de bactérias por grama de fezes. Estes ensaios foram usados ​​para comparar a composição da microbiota intestinal dos 179 indivíduos e os resultados são expressos como médias ± DP na posição normal, e os grupos de doentes de cancro. Além disso, cólon representativa (n = 32) ou rectal (N = 12) amostras de tecido normal de 22 indivíduos com cólon normais e 22 doentes com dois pontos (n = 16) ou rectal (N = 6) ao cancro foram submetidos a extracção de ADN e quantificação qPCR de acordo com o mesmo procedimento para analisar mucosa componente bactérias aderente. tecidos do cólon ou do reto foram obtidos após a cirurgia; peças foram lavadas e amostras representativas foram conservadas, quer em formalina para histoquímica ou congelados até a extração de DNA para a albumina humana e

Bacteroides

processo de PCR

Imunohistoquímica

As amostras de tecido foram selecionados. para cada caso (indivíduos normais e cancerosas), e secções de 4 | iM embebidas em parafina foram usadas e imunocoloração foi realizada de acordo com métodos descritos noutro local [23], [30]. Resumidamente, foi adicionado o anticorpo de cabra anti-humano IL-17 de anticorpo (diluído 1:40) durante 2 h, e, em seguida, a coloração foi realizada usando (kit Vectastain de Vector Laboratories AP, Burlingame, CA, EUA), e revelada por naftol /Fast vermelho (Sigma-Aldrich). Para quantificar as células imunocoradas, cinco amostras de deslizamento bem orientadas /indivíduo a partir de tecidos normais, quer em pacientes de controlo ou de cancro do cólon foram examinadas com uma ampliação de 400 x (para uma amostra de epitélio de 3 mm de comprimento em cada caso). As células marcadas por milímetro foram determinados utilizando uma grelha ocular. células imunomarcadas foram contadas em 10 campos consecutivos e semi-quantitativamente marcados (como +/-, +, ++ ou +++) e classificados. Para IL17 CD3 dupla marcação /, o anticorpo de cabra anti-IL-17 humana (diluído 1:40) foi adicionada durante 2 horas, e, em seguida, a coloração foi realizada utilizando o kit Vectastain de Vector Laboratories AP (Burlingame, CA, EUA), e revelou por naftol /fast Red (Sigma-Aldrich).