Sumário

A maioria dos casos clínicos de câncer de fígado não pode ser diagnosticada até que evoluíram para um estágio avançado, resultando em alta mortalidade. É bem reconhecido que a implementação de métodos de detecção precoce e ao desenvolvimento de terapias específicas para câncer de fígado são essenciais para reduzir as altas taxas de mortalidade associadas a esta doença. Para atingir esses objetivos, são necessárias sondas moleculares capazes de reconhecer alvos específicos das células de câncer de fígado. Descrevemos aqui um painel de aptâmeros capazes de distinguir hepatocarcinoma a partir de células de fígado normais. Os aptâmeros, as quais foram selecionadas por SELEX baseia-célula (evolução sistemática de ligandos por enriquecimento exponencial), têm valores de Kd na gama de 64-349 nM em relação a células de hepatoma humano HepG2 alvo, e também reconhecem as células de cancro do ovário e adenocarcinoma do pulmão. O experimento tratamento proteinase indicou que todos os aptâmeros poderia reconhecer as células alvo HepG2 através de proteínas de superfície. Este resultado sugeriu que estes aptâmeros podem ser utilizados como sondas potenciais para futuras pesquisas em estudos de câncer, como o desenvolvimento ensaios de detecção precoce, a terapias específicas, e agentes de imagem, bem como para a investigação de proteínas da membrana comuns nestes tipos de câncer distinguíveis.

Citation: Xu J, Teng TI, Zhang L, Delgado S, Champanhac C, Cansiz S, et al. (2015) Reconhecimento molecular das células do cancro do fígado humano utilizando aptâmeros de DNA gerados via celular-SELEX. PLoS ONE 10 (5): e0125863. doi: 10.1371 /journal.pone.0125863

Editor do Academic: Vittorio De Franciscis, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), ITÁLIA

Recebido: 26 de fevereiro de 2015; Aceito: 25 de março de 2015; Publicado em: 04 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e sua Supporting Files Informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde GM079359 e National Institutes of Health CA133086; Scholarship Fund Estado, PI = Jiehua Xu; National Natural Science Foundation da China 81101866, PI = Jiehua Xu; National Natural Science Foundation da China 81430041, PI = Jiehua Xu; e Fundos de investigação fundamental para as universidades Central 11ykpy41, PI = Jiehua Xu. Os financiadores não tiveram nenhum papel na degign estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de fígado é o sexto tipo de câncer mais comum no mundo e a terceira principal causa de morte relacionada ao câncer [1], resultando em 0,7 milhões de mortes por ano. Como o maior órgão interno e a maior glândula do corpo humano, o fígado serve muitas funções vitais, incluindo quebrar e armazenamento de nutrientes necessários para a produção de energia ou de reparação de tecidos, filtrar e degradar resíduos tóxicos no sangue, sintetizar a maior parte dos factores de coagulação que manter o corpo de sangramento maciço, e produção de produtos químicos e hormônios necessários para regulação de muitas funções corporais. Apesar deste papel crítico, o desenvolvimento de câncer de fígado raramente é diagnosticada em seus estágios iniciais, porque, na maioria dos casos, os sinais e sintomas não aparecem até as fases posteriores, tornando-se um tumor maligno altamente letal com uma taxa de sobrevivência pequeno de 5 anos. Assim, o desenvolvimento de métodos de detecção precoce e avançado terapias específicas é essencial no combate do cancro do fígado.

Os aptâmeros são curtas de ADN ou ARN, oligonucleótidos de cadeia simples capazes de se ligarem a uma variedade de moléculas-alvo correspondente com elevada afinidade específica. O método de geração de aptâmeros denominado SELEX (evolução sistemática de ligandos por enriquecimento exponencial) [2, 3] segue uma série de etapas: 1) a síntese química de uma biblioteca de oligonucleótidos possuindo 10

13-10

16 de cadeia simples moléculas de ácidos nucleicos, 2) a exposição directa da biblioteca para os alvos para diferenciar fios de ligação a partir de espectadores, 3) de extracção e de amplificação de sobreviventes, 4) enriquecimento dos sobreviventes aptâmero por ciclos iterativos, e, finalmente, 5) sequenciação para identificar um indivíduo candidatos.

a tecnologia SELEX foi desenvolvido em nosso laboratório para utilizar células inteiras como alvos no processo de seleção aptâmero. O processo SELEX-célula assegura que os oligonucleótidos se ligam candidatos para o estado nativo dos alvos de proteína na superfície das células do cancro [4]. Usando células-SELEX, aptâmeros podem ser gerados para as células doentes, sem o conhecimento prévio da assinatura molecular de um determinado alvo, tornando-se assim possível descobrir sondas moleculares para as doenças com biomarcadores até agora desconhecidos, que podem, subsequentemente, ser identificados utilizando métodos de biologia molecular química e [5 , 6]. Um número de aptâmeros capazes de reconhecer os diferentes tipos de células, incluindo as células vermelhas do sangue (RBC) [7], e células de leucemia linfocítica [4], leucemia mielóide [8], o cancro colo-rectal [9], o cancro da mama [10], do ovário câncer [11], o cancro do pulmão de pequenas células [12], o câncer de pulmão de não pequenas células [13, 14], e cancro pancreático [15], foram todos gerados usando esse método. Além disso, os pares de biomarcadores-aptâmero vários superfície celular têm sido identificadas, incluindo a fosfatase alcalina da placenta-like 2 (ALPPL-2) [15], Prominin-1 (CD133) [16], receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR) [17] , receptor do factor de crescimento epidérmico humano 2 (HER2) [18, 19], de imunoglobulina de cadeia pesada mu (IGHM) [20], protea-tirosina-quinase 7 (PTK7) [4, 5], e os seus correspondentes aptâmeros. A descoberta de aptâmeros específicos de cancro proporciona um grande potencial na investigação biomédica e no desenvolvimento de diagnóstico específico para a célula e terapêuticas [21], especialmente quando biomarcadores da superfície celular estão muitas vezes relacionados com os regulamentos de células ou em vias de sinalização.

Como oligonucleótidos , aptâmeros são facilmente reproduzíveis por síntese química com variações mínimas de lote para lote. Além disso, com a modificação química, que é fácil de introduzir módulos funcionais para os aptâmeros para satisfazer as necessidades específicas, tais como fluoróforos [22-25], ligantes químicos [26, 27], terapêutica [28-30], ou mesmo nanopartículas [31- 33]. Com as notáveis ​​propriedades acima mencionadas, o desenvolvimento de aptâmeros tem sido explorada em diversas áreas, particularmente aqueles que envolvem aplicações biomédicas [34-41]. Mais pesquisas levou à valorização da especificidade e eficácia de entrega de imagem, ou agentes terapêuticos de diagnóstico com aptâmeros escolta [24, 33, 42].

O objetivo do estudo era descobrir aptâmeros que reconhecem hepatocelular o carcinoma (HCC), que é a principal forma de cancro do fígado, o que representa 90% de todos os cancros no fígado [43]. Aqui, o método SELEX-célula foi usada para gerar aptâmeros capazes de diferenciar linha hepatocelular humano HepG2 hepática de células de carcinoma da linha normal de células epiteliais de fígado THLE-2. Estes aptâmeros podem ser usados ​​como ferramentas em novos estudos biomédicos e aplicações clínicas.

Materiais e Métodos

Cultura Celular e Tampões

HepG2 (carcinoma hepatocelular) e THLE-2 ( As células normais do fígado) foram escolhidos como células de selecção positiva e negativa, respectivamente. Outras linhas de células, incluindo células HeLa (cancro do colo do útero), MCF-7 e MDA-MB-231 (adenocarcinoma da mama), PL45 (cancro pancreático), H226 (pulmão carcinoma escamoso), A549 (adenocarcinoma do pulmão), Ramos (linfoma de Burkitt), CCRF-CEM (leucemia de células T), e TOV-21G (cancro do ovário), foram usadas para examinar a selectividade dos candidatos de aptâmeros. Todas as linhas celulares foram adquiridas a partir da cultura de tecido na Colecção Americana (ATCC). HepG2, A549, células MCF-7, e PL45 foram mantidas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM); Ramos, CCRF-CEM, H226 e HeLa foram mantidas em meio RPMI-1640. A linha celular TOV-21G foi mantido em cultura com 105 MCBD: Meio 199 (1: 1). Todos os meios anteriores foram adquiridos na Sigma-Aldrich. A linha celular MDA-MB-231 foi cultivada em de Leibovitz meio L-15 (ATCC) a 37 ° C e impedidos de contactar com CO

2. BEGM Kit de bala (Lonza /Clonetics Corporation) foi usado para preparar o meio de crescimento para células THLE-2. Gentamicina /Anfotericina (GA) e epinefrina foram descartadas a partir do kit, mas um adicional de 5 ng /mL de factor de crescimento epidérmico (EGF), 70 ng /mL de fosfoetanolamina, e todos os outros aditivos do kit foram incluídos no meio basal. Todos os meios foram suplementados com soro inactivado pelo calor 10% fetal de bovino (FBS) (Gibco) e 1% de penicilina-estreptomicina (100 unidades /mL de penicilina e 100 mg /mL de estreptomicina) (Gibco). Todas as células, excepto para MDA-MB-231, foram incubadas a 37 ° C sob 5% de CO

2 atmosfera.

tampão de lavagem foi preparado a partir de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS) com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio (Sigma-Aldrich) com glicose adicional (4,5 g /l) e MgCl

2 (5 mM). tampão de ligação foi preparada por adição de ARNt de levedura (0,1 mg /mL) (Sigma-Aldrich) e BSA (1 mg /mL) (Fisher) para o tampão de lavagem.

Síntese e purificação de ADN da biblioteca e os iniciadores

O para a frente e os iniciadores inversos foram marcadas com FAM e biotina, respectivamente, nas suas extremidades 5′-. A sequência do iniciador de sentido directo era 5′-FAM-AGA GAC CCT GAC TGC GAA-3 ‘; a sequência do iniciador inverso foi 5’-biotina-AAG AAG CCA CCG TGT CCA-3 ‘. A biblioteca de DNA consistia de uma região de 25 nt randomizado flanqueado por sítios de ligação de iniciadores: 5’-AGA GAC CCT GAC TGC GAA- (N

25) -TGG ACA CGG TGG CTT CTT-3 ‘. Todas as sequências de biblioteca e iniciadores foram adquiridos a Integrated DNA Technologies (IDT) e purificado por HPLC de fase reversa.

Polymerase Chain Reaction

parâmetros de amplificação de PCR foram optimizados antes do processo de selecção. Todas as misturas de PCR continha KCl a 50 mM, Tris-HCl a 10 (pH 8,3), MgCl 1,5 mM

2, dNTP (0,2 mM cada), 0,5 ^ M de cada iniciador, e a polimerase de início de Taq ADN quente (0,015 unidades /mL) . A PCR foi realizada quer num ou C1000 T100 BioRad termociclador, e todos os reagentes de PCR foram comprados a partir de Takara. Cada ciclo de amplificação foi realizada a 90 ° C durante 30 seg, 57 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 30 seg, seguido por uma extensão final durante 3 min a 72 ° C.

a selecção in vitro

o processo de célula-SELEX foi realizado com base no protocolo [44] desenvolvido pelo nosso grupo com algumas modificações. A seleção foi realizada em monocamadas de células, já que ambos HepG2 positivo e THLE-2 negativa usados ​​aqui são linhas de células aderentes. Para a primeira fase de selecção, o conjunto de ADN consistiu de 20 nmol da biblioteca de oligonucleótido em 700 ml de tampão de ligação. Para as últimas rodadas, foram utilizados 250 nM de oligonucleotídeos amplificados a partir da piscina restante anterior. A biblioteca de DNA foi aquecida a 95 ° C durante cinco minutos, seguido por arrefecimento rápido em gelo durante 5 minutos antes da incubação, permitindo que as sequências de DNA para formar as estruturas secundárias mais favoráveis. A biblioteca de DNA foi então incubada com as células HepG2 em monocamada durante 1 hora a 4 ° C, após remoção do meio e a lavagem duas vezes com tampão de lavagem. O tempo de incubação diminuiu à medida que a selecção progrediu: 60 min para as rondas 1 e 2, de 45 min para a ronda 3, e 30 minutos para todos os ciclos subsequentes. Entre cada ciclo, as células foram lavadas três vezes com tampão de lavagem para remover as sequências de não ligados. O tempo de lavagem e do volume de tampão de lavagem foram aumentados como a selecção progrediu para remover candidatos fracos e obter aptâmeros com elevada especificidade e selectividade. As células foram, então, separado do prato com um raspador de células, e os detritos foi recolhido em 500 uL de tampão de ligação. O complexo foi aquecida a 95 ° C durante 10 minutos e depois centrifugada a 14000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante foi recolhido e foi preparado por amplificação por PCR durante as duas primeiras rondas de selecção negativa quando não estava incluído. Para os ciclos posteriores com selecção negativa, o sobrenadante foi incubado com a monocamada de células negativas THLE-2 durante 1 hora a 4 ° C, e os sobrenadantes foram recolhidos.

O sobrenadante contendo sequências de ADN ligado foi amplificado por PCR lias e utilizando iniciadores marcados com biotina. O número de ciclos de amplificação de PCR optimizadas foi confirmado com electroforese em gel de agarose. pérolas de Sepharose revestida com estreptavidina (GE Healthcare Life Sciences) foram usadas para isolar os produtos de PCR a partir da mistura de reacção. O ADN de cadeia simples marcado com fluoróforo (ssDNA) foi em seguida separada a partir da ADNcs biotinilado anti-sentido por eluição com 200 mM de NaOH. Finalmente, o ADNcs foi dessalinizada com uma coluna NAP-5 (GE) e redissolvido em tampão de ligação

.

Todo o processo de selecção foi repetido até que um enriquecimento significativo sustentada foi obtido na ronda 19. O enriquecimento das piscinas foi analisada com citometria de fluxo (Accuri C6, BD).

O sequenciamento de próxima geração e análise

piscina Enriquecido 19 foi escolhido para a sequenciação. O ssDNA separado da piscina 19 foi amplificado por PCR novamente para adicionar as sequências de adaptador (GAA CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG TCT CCG ACT CAG AGA GAC CCT GAC TGC e CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG ATA AGA AGC CAC CGT GTC CA ) e purificado utilizando um kit de purificação de PCR (Qiagen). As amostras purificadas foram submetidos a Ion Torrent próxima geração de sequenciamento da Universidade da Florida, ICBR Sequencing Núcleo Facility. Os produtos foram alinhadas para identificar as sequências mais abundantes utilizando o software Galaxy. Qualquer com menos de 10 cópias foram removidos a partir da análise. Os restantes lê (501.084) foram então agrupadas e as 20 sequências mais abundante (Tabela S1 em Arquivo S1) foram sintetizados quimicamente para posterior caracterização.

Encadernação Análise

candidatos aptâmeros recuperados foram sintetizados por o método de fosforamidite padrão utilizando um sintetizador de ADN de 3400 (Applied Biosystems) e purificados por HPLC de fase reversa (Varian Prostar utilizando uma coluna C18 de etilo e acetonitrilo /trietilamónio como fase móvel). Reagentes para síntese foram adquiridos de Glen Research. citometria de fluxo BD Accuri C6 (BD Immunocytometry Systems) foi aplicado para monitorizar o enriquecimento de sequências de ssDNA nas piscinas durante o processo de selecção e para avaliar a afinidade de ligação e especificidade dos candidatos seleccionados aptâmeros. solução de dissociação de células não enzimática foi usada para separar células, e as células dispersas foram então lavadas com tampão de lavagem. Quando eram necessários células tratadas com protease, tripsina foi usado em vez de solução de dissociação de células não enzimática. Tripsina e solução de dissociação de células não enzimática foram ambos adquiridos a partir de Sigma-Aldrich. Os ensaios de ligação foram realizados por citometria de fluxo após a incubação de 4 x10

5 células dispersas em 200 ul de tampão com piscinas ou aptâmeros de ligação a 250 nm durante 30 min a 4 ° C (ou a 37 ° C, tal como indicado). Para cada candidato aptâmero, a afinidade de ligação (tal como K

d) em direcção a linha de células alvo HepG2 foi avaliada usando Sigma Plot ajustando a intensidade de fluorescência média relativa de ligação versus a concentração dos aptâmeros utilizando a equação de saturação Y = B

maxX /(K

d X +) (o símbolo Y representa a ligação específica, a uma concentração de aptâmero = X em nanomolar, e Bmax é a máxima ligação.) as células foram incubadas a 4 ° C durante 30 min, com uma série de concentrações (0,1, 0,5, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000 nM) de cada recuperado aptâmero com biotina marcado na extremidade 5 ‘. As células foram então lavadas duas vezes com 1 mL de tampão de lavagem, suspenso em 200 ul de tampão contendo estreptavidina-PE de ligação, e coradas durante 20 min. As células foram novamente lavadas duas vezes com 1 ml de tampão de lavagem e, em seguida, suspenso em 100 ul de tampão de ligação para análise de citometria de fluxo. A biblioteca não seleccionada marcado com biotina foi usado como um controlo negativo para determinar a ligação de fundo. A intensidade média de fluorescência da biblioteca não seleccionada foi subtraída a do aptâmero correspondente com as células-alvo para determinar a ligação do aptâmero marcado específico. Todos os ensaios de ligação foram repetidas três vezes.

Resultados e Discussão

O processo de seleção começou com uma biblioteca aleatória contendo aproximadamente 1,2 x sequências de 10

16 (20 nmol) de ADNcs de 61 nucleotídeos ( NT), seguido por ligação sequencial com o alvo células HepG2, eluição e subsequente amplificação por PCR, num total de 19 ciclos. Counter-seleção com células THLE-2 foi introduzido na terceira rodada e realizado em todas as rodadas seguintes para eliminar a possibilidade de qualquer oligonucleotídeos que reconhecem marcadores de superfície comuns em ambos alvo e linhas de células negativas. Enriquecimento progresso foi monitorizado por ensaios de ligação de ADNcs recuperado de cada rodada em células alvo utilizando citometria de fluxo. mudanças graduais na intensidade de fluorescência foram observadas em rodadas posteriores. O sinal fluorescente parado de aumentar entre as rodadas 17 e 19, o que implica que saturado ligação dos conjuntos enriquecidos tinha sido alcançado (Fig 1A). Nenhuma óbvio aumento da intensidade de fluorescência foi encontrada com as células normais do fígado THLE-2 em piscina 19 (Figura 1B), o que indica que, em comparação com a biblioteca inicial, enriquecido ADNcs piscina 19 mostrou uma ligação preferencial às células HepG2, não THLE-2 células.

os ensaios de ligação (a) mostrou uma mudança notável no volume de ligação da piscina para as células de câncer de fígado (HepG2) e parou de aumentar após o 17

th rodada de seleção. Observou-se (B) a uma redução subtil na intensidade de fluorescência para as células hepáticas normais (THLE-2), alcançando uma mudança mínima na 19

th rodada. A curva vermelha representa células incubadas com a biblioteca inicial desmarcada.

O ssDNA recuperado da rodada 19 foi apresentado para a próxima geração de sequenciamento de profundidade. As 20 sequências mais abundantes (Tabela S1 no ficheiro S1) foram sintetizados quimicamente, marcado com biotina na extremidade 5 ‘, e, em seguida, purificado por meio de HPLC. As sequências foram quantificados (UV 260/280) e diluída para concentrações padrão.

análise de ligação foi realizado por incubação de células positivas ou negativas com 250 nM de aptâmero de cada candidato. De acordo com a fluir resultados da análise de citometria de, nenhum dos oligonucleótidos exibida ligação com as células do fígado epiteliais normais THLE-2, enquanto os sete candidatos aptâmeros mostrou aparentes mudanças na intensidade de fluorescência em células HepG2 com respeito a uma sequência aleatória (Figura 2, Tabela S2 em S1 arquivo), o que implica que todos os aptâmeros selecionados podem se diferenciar células de câncer de fígado a partir de células normais do fígado.

os aptâmeros selecionados mostrou aparente ligação a células de hepatoma HepG2 (a), enquanto nenhum aumento de fluorescência foi encontrado em células do fígado epiteliais normais (B), utilizando citometria de fluxo. As experiências foram realizadas a 4 ° C.

As afinidades de ligação dos aptâmeros seleccionados foram, em seguida, determinado pela avaliação das constantes de dissociação (K

D). Um menor K

valor d indica forte ligação do aptâmero seleccionado para as células alvo. Como listado na Tabela 1, os aptâmeros reportados neste estudo mostram afinidades em relação a células HepG2 ligação na gama nanomolar (64-349 nM), o que sugere que estes aptâmeros ligado firmemente às suas células HepG2 alvo.

para evitar que as sequências de ligação de ser internalizado, foi realizado o

in vitro

selecção a 4 ° C, assim como os ensaios de ligação acima mencionados. Os aptâmeros selecionados não perdeu o seu reconhecimento para alvejar as células HepG2 à temperatura fisiológica (Fig 3A). A mudança de fluorescência de células incubadas com aptâmeros, em comparação com células incubadas com a biblioteca foi conservada quando os ensaios de ligação foram realizados a 37 ° C.

(A) a mudança de intensidade de fluorescência em HepG2 incubadas com cada um dos aptâmeros seleccionados mantida a 37 ° C. (B) As intensidades de fluorescência não mudar quando as células HepG2 foram tratadas com tripsina durante 30 minutos antes da incubação, o que indica que as proteínas da membrana são alvos prováveis.

Tem sido relatado que interagem especificamente aptâmeros com as superfícies das células alvo durante a selecção do [5, 20]; portanto, um outro conjunto de ensaios de ligação (37 ° C) usando células HepG2 tratadas com tripsina durante 30 minutos antes da incubação com as sondas foi realizada para examinar se os aptâmeros seleccionados foram alvo proteínas de membrana em células HepG2. Como mostrado na Fig 3B, todos os aptâmeros seleccionados perderam a sua ligação preferencial para a biblioteca com células HepG2 tratadas com proteases, indicando os alvos destes aptâmeros são susceptíveis de ser proteínas da membrana.

tem sido relatado que são determinadas proteínas associado ao câncer [45, 46]. Portanto, identificando as proteínas comuns apresentados por células cancerosas e investigar sua relevância para os cancros podem fornecer pistas sobre o desenvolvimento do câncer. Depois de provar os aptâmeros seleccionados foram capazes de diferenciar carcinoma hepatocelular a partir de células epiteliais de fígado normais, examinámos ainda mais a selectividade de ligação dos aptâmeros contra linhas de células de outros tipos de cancro, incluindo o pulmão Carcinoma epidermóide (H226), adenocarcinoma do pulmão (A549), do colo do útero adenocarcinoma (HeLa), adenocarcinoma da mama (MCF-7, MDA-MB-231), adenocarcinoma do ovário (TOV-21G), adenocarcinoma pancreático (PL45), e leucemia (Ramos, CCRF-CEM) (Tabela 2). Verificou-se que os sete aptâmeros também exibida uma ligação significativa no sentido de adenocarcinoma do pulmão, cancro do ovário e células embrionárias de rim, que indica a forte possibilidade de algumas proteínas comuns expressos por estas células, enquanto, ao mesmo tempo, não se demonstrou qualquer afinidade para leucemia ou do colo do útero células cancerosas. Uma vez que o cancro do pulmão é um destino comum de metástases do cancro do fígado [47], este resultado pode apoiar a utilização destes aptâmeros como sondas moleculares para estudar a metástase do cancro. Além disso, todos os aptâmeros exibiu reconhecimento para a linha celular de cancro da mama um, MCF-7, mas não a outra linha de células do cancro da mama, MDA-MB-231. Esta diferença pode ser atribuído ao facto de que eles são de dois subtipos distintos de cancro da mama. Por exemplo, as células MCF-7 cai em luminal um subtipo de receptor altamente expresso de estrogénio (ER) e o receptor de progesterona (PR), e MDA-MB-231 pertence ao subtipo basal como o que é negativo para ER e PR [48] . Assim, este resultado sugere que estes aptâmeros podem ser aplicados a estudos de cancro hormono-dependentes

Conclusão

Todos os sete aptâmeros aqui relatados são capazes de distinguir hepatoma a partir de células normais do fígado.; eles demonstraram elevadas afinidades para com a linha de células HepG2, a 4 ° C (K

D’s de 64-349 nM), bem como a 37 ° C, enquanto que nenhuma ligação detectável para as células hepáticas normais foi observada. Os experimentos de tratamento proteinase indicou que todos os sete aptâmeros reconhecer célula alvo HepG2 através de proteínas de superfície. Além disso, estes aptâmeros mostrou reconhecimento para com câncer de pulmão, câncer de ovário e Luminal um cancro da mama do subtipo. Estes resultados sugerem que estes aptâmeros podem ser potenciais sondas para futuras pesquisas em estudos de câncer, como o desenvolvimento ensaios de detecção precoce, a terapias específicas, e agentes de imagem, bem como para a investigação de proteínas da membrana comuns nestes tipos de câncer distinguíveis.

Informações de Apoio

Arquivo S1. . Arquivo de apoiar tabelas combinadas

Tabela S1: número de leituras e porcentagem para as 20 sequências mais abundantes. Sequência # é designado no fim da abundância. O # total de lê em todo o pool de DNA é 501.084. Entre as mais abundantes vinte sequências, sete deles são relatados como aptâmeros segmentação células HepG2. Tabela S2: A intensidade de fluorescência detectada a partir de células incubadas com 250 nM de cada um dos aptâmeros ou uma biblioteca de ADN de 61-mer aleatório. (G-média: média geométrica)

doi: 10.1371 /journal.pone.0125863.s001

(DOCX)

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Dr. Kwame Sefah para a concepção primers e fornecer conselhos úteis que contribuíram para este trabalho, Dr. Kathryn R. Williams por sua revisão crítica do manuscrito, eo núcleo de sequenciamento de DNA, ICBR, da Universidade da Flórida para a ajuda durante o seqüenciamento profunda da próxima geração.