Abstract

Berberina (BBR ), um alcalóide derivado de isoquinolina isolado a partir de ervas chinesas, tem uma longa história de utilizações para o tratamento de várias doenças, incluindo cancros. No entanto, os mecanismos precisos de acção de BBR em células de cancro do pulmão humano permanecem obscuros. Neste estudo, foram investigados os mecanismos moleculares pelos quais o BBR inibe o crescimento celular em células de cancro do pulmão de células não pequenas humano (NSCLC). O tratamento com BBR promovido alteração da morfologia celular, a migração celular inibida, a proliferação e a formação de colónias, e a apoptose celular induzida. Um estudo mais aprofundado mecanismo molecular mostrou que BBR alvo simultaneamente células múltiplas vias de sinalização para inibir o crescimento de células NSCLC. O tratamento com BBR inibida AP-2α e expressão AP-2β e revogou a sua ligação em promotores hTERT, inibindo assim a expressão hTERT. Knockdown de AP-2α e AP-2β por siARN aumentada consideravelmente a inibição BBR-mediada do crescimento celular. BBR também suprimiu a translocação nuclear de p50 /p65 proteínas NF-kB e a sua ligação ao promotor de COX-2, causando a inibição de COX-2. BBR também downregulated HIF-1α e VEGF inibiu a expressão e fosforilação de Akt e ERK. Knockdown de HIF-1α por siARN aumentada consideravelmente a inibição mediada por BBR do crescimento celular. Além disso, o tratamento BBR desencadeada a libertação de citocromo-c a partir do espaço inter-membrana mitocondrial em citosol, promovido de clivagem de caspase e PARP, e expressão afectada de BAX e Bcl-2, activando assim via apoptótica. Tomados em conjunto, estes resultados demonstraram que BBR inibiu o crescimento de células NSCLC por segmentação simultaneamente AP-2 /hTERT, NF-kB /COX-2, o HIF-1α /VEGF, PI3K /AKT, Raf /MEK /ERK e citocromo-c /caspase vias de sinalização. Nossos resultados fornecem novas perspectivas sobre a compreensão dos mecanismos anti-cancerígenos de BBR na terapia do câncer de pulmão humano

Citation:. Fu L, Chen W, Guo W, Wang J, Tian Y, Shi D, et al. (2013) Berberina Alvos AP-2 /hTERT, NF-kB /COX-2, o HIF-1α /VEGF e citocromo-c /Caspase de sinalização para suprimir Human Cancer Cell Growth. PLoS ONE 8 (7): e69240. doi: 10.1371 /journal.pone.0069240

editor: Gutian Xiao, da Universidade de Pittsburgh Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 26 Abril 2013; Aceito: 06 de junho de 2013; Publicação: 15 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Fu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por fundos da National Natural Science Foundation da China (81071687, 81272195), o Estado “Programa 863” da China (SS2012AA020403), a Fundação programas de doutoramento de Ministério da Educação da China (20110171110077), eo Laboratório de Estado-chave de Oncologia no sul da China. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores declararam a filiação (s) para “Guangzhou Duplo bioproduto Inc” na competindo seção de Interesses da forma de manuscrito online. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O cancro do pulmão ocupa o primeiro lugar entre as mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. A incidência de câncer de células não pequenas-pulmão (NSCLC), uma das principais formas de cancro do pulmão, tem vindo a aumentar com a mortalidade e morbidade significativa. Tratamento como quimioterapia e radioterapia são as principais estratégias de terapia de câncer de pulmão [2]. Nos últimos anos, as terapias de alvo selectivamente as vias de sinalização de células, tais como EGFR, VEGF, KRAS, BRAF, ALK, HER2, Met, TITF-1, p53, LKB1 e muitos outros, não só proporciona-se um melhor entendimento do NSCLC carcinogénese, mas também utilizados como factores de prognóstico ou metas para a individualização da terapia [3]. No entanto, a sobrevivência continua pobre. O progresso na biologia do cancro do pulmão e da genética levou ao desenvolvimento de fitoquímicos pequenas moléculas, especialmente fitoquímicos extraído de ervas chinesas que possuem efeitos sobre a proliferação de células cancerosas, angiogénese e apoptose [4]. Assim, a otimização do uso de fitoquímicos terapêuticas convencionais e inovadoras pode melhorar o resultado do tratamento para o câncer de pulmão.

As ervas chinesas têm sido usados ​​amplamente e com sucesso por séculos no tratamento de diferentes tipos de doenças [5]. Fitoquímicos de ervas chinesas têm mostrado promessa para a prevenção do câncer, com segurança e eficácia [6]. Berberina (BBR) é um alcalóide derivado de isoquinolina isolado do rizoma, raízes e casca do caule de uma série de ervas chinesas,

Berberis

espécies, tais como

Hydrastis

canadensis

(goldenseal),

Cortex phellodendri

(Huangbai) e

Rhizoma coptidis

(Huanglian) [7]. Berberina tem uma longa história de ser usado como um agente terapêutico para tratar uma variedade de doenças, incluindo o cancro. Tem sido relatado que BBR exibindo várias actividades farmacológicas, incluindo anti-inflamatório [8], anti-hipertensivos [9], para baixar o colesterol [10], anti-diarreico [11,12], anti-microbiana [13,14 ] atividades e o efeito anti-tumoral de BBR estava cada vez mais enfatizado nas últimas décadas [15,16]. BBR foi mostrado exibir efeitos anti-proliferação contra células cancerosas de diferentes origens, incluindo glioblastoma [17], o melanoma [18], o cancro do cólon [19], o cancro da mama [20,21], o cancro da próstata [22], etc. . No cancro do pulmão humano, tem sido mostrado que BBR aumentou a cito-toxicidade de radiações em

in vivo

e

in vitro

modelos através da indução de autofagia [23], e BBR exibiram um efeito protetor sobre a lesão pulmonar induzida por radiação através da adesão intercelular crescimento molecular-1 e fator transformador-beta-1 [24]. BBR também inibiu eficazmente a capacidade motilidade e invasão de cancro do pulmão de células A549 em linha uma dose e modo dependente do tempo sob a concentrações não citotóxicas através de uma diminuição produções de activador de plasminogénio de urocinase-e metaloproteinase de matriz-2 [25]. Além disso, foi relatado BBR para inibir o crescimento e induzem a apoptose em células de cancro do pulmão humano, e a administração de BBR por sonda oral inibiu o crescimento de xenoenxertos de tumores em ratinhos nus atímicos [26]. Embora evidência de efeitos anti-tumorais de BBR se expande, a incerteza dos mecanismos de BBR em NSCLC ainda permanece.

telomerase humana transcriptase reversa (hTERT) tem mostrado ser um componente importante da telomerase humana, o qual sintetiza DNA telomérico, alonga extremidades dos cromossomas e mantém a estabilidade cromossômica, finalmente, leva a imortalização celular [27]. hTERT não se expressa na maioria das células somáticas humanas, mas é geralmente sobre-expresso em uma ampla gama de cancros humanos, incluindo cancro do pulmão [28]. A elevada expressão de hTERT é necessário transformar as células humanas normais em células cancerosas. A regulação transcricional do gene hTERT é o principal mecanismo para a activação específica do cancro da telomerase, e um número de factores foram identificados para regular directa ou indirectamente o promotor hTERT [29]. A activação de ligação a proteína intensificador-2 (AP-2) mostrou transcricionalmente para controlar a expressão de hTERT. O fator de transcrição da família AP-2 contém um conjunto de developmentally regulamentadas, ácido retinóico genes induzíveis composto por quatro fatores-AP2α relacionados, AP2β, AP2γ e AP2δ [30]. Ao ligar-se ao promotor de hTERT, AP-2 factores exercem os seus efeitos biológicos através da activação de um certo número de genes relacionados com o tumor e vias de sinalização, incluindo hTERT, PI3K /Akt, e Raf /MEK /ERK [31].

factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) tem sido reconhecida como uma das principais iniciadores para o desenvolvimento e progressão da vascularização sistema [32]. factor de epitélio pigmentar-derivado (PEDF), um inibidor potente da angiogénese, assim como um factor de neuro-protecção, contrabalança os efeitos do VEGF [33]. VEGF e PEDF ambos possuem várias atividades biológicas e funções e eles têm uma relação inversa com o outro, especialmente em câncer [34]. A expressão de VEGF e PEDF é regulada por um conjunto de factores externos, dos quais a hipóxia é o mediador mais bem caracterizado. A hipoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) é um factor de transcrição que desempenha um papel crucial na carcinogénese. A actividade de HIF-1α é regulada por uma variedade de sinais não-hipóxia, incluindo a activação por várias vias oncogénicos, tais como Src, HER-2, Ha-Ras, e activada por mitogénio proteína quinase (MAPK) de sinalização [35]. Ao ligar-se aos elementos de hipoxia-responsivo no promotor VEGF, HIF-1 conduz à activação da transcrição do gene de VEGF [36].

COX-2 é uma enzima induzível que converte o ácido araquidónico em prostaglandinas, e ele é geralmente sobre-expresso em uma ampla gama de cancros humanos [37]. O aumento da expressão de COX-2 de proteínas e a produção de PGE2 sequencial têm sido mostrados para melhorar significativamente a carcinogénese e reacções inflamatórias pela regulação positiva do EGFR, PI3K, e ERK1 /2 de sinalização [38]. A expressão da COX-2 é transcricionalmente controladas pela ligação de vários transactivadores e coativadores para os locais correspondentes situados no seu promotor. Entre os conhecidos vários elementos reguladores que distribuem na região promotora do núcleo da COX-2 local de início da transcrição, sítio de ligação de NF-kB é essencial para a actividade do promotor de COX-2 [39,40].

A PI3K /AKT e Raf /MEK /ERK são duas vias de sinalização celular clássica e desempenha um papel fundamental na regulação da expressão do gene celular, sobrevivência crescimento. Anormal de PI3K /AKT e /sinalização /ERK Raf MEK pode conduzir a proliferação celular descontrolada ou aumentado, resistência à apoptose e à quimioterapia, radioterapia e terapias de direccionamento em tumores. A activação do HIF-1 proteína poderá ser facilitada pela PI3K /AKT e /sinalização MEK /ERK Raf. Como as moléculas de sinalização a montante de HIF-1 proteína, ERK também pode desempenhar o seu papel na mediação do efeito de BBR-se na inibição do crescimento de células [41].

A indução de apoptose é considerada como um dos possíveis mecanismos de inibição do desenvolvimento do cancro. activação de caspase desempenham um papel central na execução da apoptose. As caspases activadas clivar uma grande variedade de proteínas alvo, a desactivação deste modo os processos celulares importantes e quebrar componentes estruturais da célula. A liberação de citocromo-c a partir do espaço inter-membrana mitocondrial para o citosol é a pré-condição da via apoptose dependente da caspase. Citocromo C liga-se a Apaf-1 na ausência de dATP, e o complexo liga-se pró-caspase-9 para formar apoptossomo, que cliva o pró-caspase para a caspase 9, e por sua vez activa o efector da caspase-3 [42].

neste estudo, nós investigamos os mecanismos subjacentes detalhadas de BBR na inibição do crescimento de células NSCLC em NSCLC

in vitro

. Nossos resultados fornecem novas informações sobre a explorar as potenciais estratégias terapêuticas e novos alvos para o cancro do pulmão humano.

Resultados

BBR alteraram a morfologia celular e migração celular inibida

Em primeiro lugar, analisou o efeito de BBR sobre a morfologia celular em células A549 e H1299. O tratamento com BBR a 100 uM BBR eficazmente reduzida de contacto célula-a-célula e levou a uma menor espalhamento com menos formação de fi lopodia por comparação com os grupos de controlo de DMSO (Figura 1A). Também testamos o efeito de BBR sobre a migração celular, empregando um ensaio de cicatrização. Como mostrado na Figura 1B, a parte do espaço de ferimento entre as camadas de células depois de fazer um arranhão foi ocupada completamente pelas células que migram depois de 48 h no grupo de controlo. No entanto, o espaço vazio das células não foi ocupada pelas células que migram tratados com 20 uM BBR. Estes resultados demonstraram as potencialidades da BBR na mudança de morfologia celular e inibir a migração celular em células de câncer de pulmão

(A) As alterações na morfologia celular e se espalhando em A549 e H1299 células tratadas com 100 M BBR para foram observados 48 h e as células foram fotografadas utilizando um microscópio equipado com câmera digital. migração (B) celular foi analisado através de um ensaio de cicatrização da ferida. As células foram cultivadas até à confluência completa. As monocamadas de células foram feridas com uma ponta de pipeta estéril, e lavou-se com meio para remover as células destacadas das placas. As células foram deixadas não tratadas ou tratadas com 20? M BBR. Após 48 h, a abertura da ferida foi observada e as células foram fotografadas.

BBR suprimiu a proliferação celular e formação de colónias

Berberina tem sido demonstrado que induzem a inibição do crescimento e apoptose de não-pequenas células de câncer de pulmão de células humanas através de via de sinalização p53 [43]. A seguir, analisados ​​quantitativamente o efeito de BBR sobre a proliferação celular no cancro do pulmão A549 e células H1299 por ensaio MTT. O tratamento com BBR na dose de 10 uM a 200 uM inibe a viabilidade celular de uma forma dependente da dose. A IC

50 valores de BBR para A549 e células H1299 são 67,1 e 59,2? M? M, respectivamente (Figura 2A). Também foram testados os efeitos de BBR no clonogenicidade de células de tumor em células A549 (Figura 2B). O tratamento com BBR formação de colónias acentuadamente inibido, o que resulta em uma diminuição significativa em relação tanto a formação de colónias (Figura 2C) e o tamanho das colónias (Figura 2D).

(A-C) humano A549 H1299 e as células foram tratadas com BBR nas doses indicadas. Às 48 horas após o tratamento, a viabilidade celular foi determinada por um ensaio MTT. Os valores de IC50 de BBR para A549 e células H1299 foram calculados (A). A formação de colónias induzida por A549 de células de tumor também foi analisada (B), e a taxa de formação de colónias (C) e o tamanho da colónia (D) foram calculados. As células tratadas com DMSO foram utilizados como grupo de referência com a viabilidade celular fixado em 100%. A viabilidade celular por cento em cada grupo de tratamento foi calculado em relação a células de controlo tratadas com veículo DMSO. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão de três ensaios. *, P 0,05, diferenças significativas entre os grupos de tratamento e grupos de controlo de DMSO.

BBR inibida AP-2 /hTERT sinalização

hTERT tem sido considerada como a marca da carcinogênese ea expressão de hTERT é rigidamente controlada pelo factor de transcrição AP-2. Para determinar se BBR tem como alvo a sinalização AP-2 /hTERT, que trataram células A549 com BBR (20 uM ou 100 uM), e examinaram a expressão de AP-2α, AP-2β e proteínas hTERT e mRNAs por Western blot e RT-PCR , respectivamente. O tratamento com BBR levou a uma inibição marcada da expressão de AP-2α, AP-2β hTERT e a proteína (Figura 3A) e os níveis de ARNm (Figura 3B).

células A549 NSCLC humano (A-C) foram tratados com BBR nas doses indicadas. Às 48 horas após o tratamento, as proteínas hTERT e AP-2 (A) e ARNm (B) foram analisadas por Western blot e RT-PCR, respectivamente. GAPDH foram utilizados como controlos para o carregamento da amostra. A ligação de AP-2 ao promotor hTERT sonda (C) foram analisadas por um ensaio de pulldown estreptavidina-agarose. (D) As células A549 foram transfectadas com um ARNsi de AP-2 ou um vector de AP-2-expressando durante 24 horas, e, em seguida, tratada com BBR (100 uM). Às 48 horas após o tratamento, a expressão da proteína e a viabilidade celular foi determinada por transferência de Western e o ensaio de MTT, respectivamente. A viabilidade celular por cento em cada grupo de tratamento foi calculada em relação às células tratadas com o controlo de veículo. Os dados são apresentados como a média ± DP de três experiências separadas. *, P 0,05, diferenças significativas entre os grupos de tratamento e grupos de controlo de DMSO.

Ensaio suspenso estreptavidina-agarose

Uma vez que a expressão da hTERT é rigidamente controlado pela atividade de ligação de AP-2 família na promotor hTERT, nós próxima realizados para examinar o efeito de BBR em actividades de ligação AP-2a e 2p-AP no promotor hTERT. Como mostrado na Figura 3C, o tratamento BBR eficazmente revogada AP-2α e AP-2β ligação com a sonda de ADN do promotor hTERT marcado com biotina (Figura 3C).

Para confirmar o papel do AP-2 sinalização em BBR- mediada por inibição da proliferação de células, que transfectadas células A549 com AP ou AP-2α-2β ARNsi (100 nM) e em seguida tratou-os com BBR (100 uM) durante 48 h. Os resultados mostraram que a transfecção com AP ou AP-2α-2β siARN eficazmente regulados negativamente a expressão de AP-2α ou proteína AP-2β e viabilidade celular consideravelmente inibido (Figura 3D). Knockdown de AP ou AP-2α-2β por siARN também marcadamente aumentada a inibição BBR-mediada de viabilidade celular em comparação com a transfecção com o ARNsi de controlo (SI-NC) (Figura 3D). Estes resultados confirmam que o efeito de BBR na inibição da proliferação de células é mediado, pelo menos em parte, através de via de sinalização de AP-2 /hTERT em células de cancro de pulmão.

BBR inibida NF-kB /COX-2 de sinalização

alta expressão de COX-2 está implicado no crescimento de células de cancro, migração e angiogénese. Para determinar os efeitos de BBR sobre a COX-2 de sinalização em células de cancro do pulmão, o próximo analisada a expressão da proteína COX-2 em células A549 tratadas com BBR por Western blot. O tratamento com BBR na dose de 20 uM não inibiu significativamente a expressão da proteína COX-2, enquanto que a dose de 100 uM diminuiu marcadamente a expressão da proteína COX-2 em células A549 (Figura 4A).

(A) as células A549 humanas foram tratadas com BBR nas doses indicadas. Às 48 horas após o tratamento, a proteína da COX-2 foi analisada por transferência Western. GAPDH foram utilizados como controlos para o carregamento da amostra. (B) As células A549 foram pré-tratadas com o inibidor de COX-2, celecoxib inibidor selectivo (CB, 20 uM) durante 24 horas, e, em seguida, tratada com BBR (20 uM). Às 48 horas após o tratamento, a viabilidade celular foi determinada por análise de MTT. A viabilidade celular por cento em cada grupo de tratamento foi calculada em relação às células tratadas com o controlo de veículo. (C) As células A549 foram tratadas com BBR nas doses indicadas. Às 48 horas após o tratamento, a ligação da p50 e p65 para a COX-2 sonda de promotor foi analisado através de um ensaio de pulldown estreptavidina-agarose. (D) As células A549 foram tratadas com BBR (100 nM). Às 48 horas após o tratamento, o efeito de BBR no NF-kB p65 e p50 translocação foi analisada por ensaio de imunof luorescência. Os dados são apresentados como a média ± DP de três experiências separadas. *, P 0,05, diferenças significativas entre os grupos de tratamento e grupos de controlo de DMSO.

A expressão da COX-2 é fortemente regulada pela actividade de ligação do p50 /p65 NF-kB na estrutura do promotor de COX-2. A seguir, determinado se a inibição induzida por BBR de proliferação de células tumorais e a expressão de COX-2 é mediada pela inibição da ligação do NF-kB para a COX-2 do promotor em células A549. ensaio suspenso estreptavidina-agarose mostrou que BBR na dose de 100 uM inibiu marcadamente p50 de NF-kB e de p65 que se ligam a COX-2 como sonda de promotor comparativamente com o grupo de controlo (Figura 4B). Em contraste, BBR na dose de 20 e 100 uM não afectou os níveis de proteína p50 e p65 em lisados ​​de células inteiras (Figura 4A).

A translocação de NF-kB p65 e p50 nos núcleos celulares e execuções cytoplasma um papel fundamental na regulação da COX-2 a expressão do gene. A seguir, realizada ensaio de imunofluorescência para avaliar o efeito de BBR no NF-kB p65 e p50 translocação em células A549. translocação constitutiva do NF-kB p65 e p50 para os núcleos das células foi detectada (Figura 4C). O tratamento com BBR (100 uM) de forma eficaz promovido a translocação da p65 de NF-kB e de p50 a partir de núcleos de células de citoplasma. Os resultados sugerem que a inibição do crescimento de células tumorais por BBR pode também ser mediado pela modulação da /COX-2 via de sinalização de NF-kB em células de cancro de pulmão.

BBR inibida HIF-1α /VEGF, PI3K /AKT , Raf /MEK /ERK sinalização

A /VEGF sinalização HIF-1α /PEDF está intimamente associado com o crescimento de células de câncer, migração e angiogênese. A seguir, determinou-se a efeito de BBR sobre a expressão de HIF-1α, VEGF e PEDF em níveis de ARNm e proteína em células de cancro do pulmão por RT-PCR e transferência de Western, respectivamente. O tratamento de células A549 com BBR inibiu significativamente a expressão de HIF-1α e VEGF, mas não PEDF, em proteína (Figura 5A) e os níveis de ARNm (Figura 5B).

células A549 foram tratadas com BBR no indicado doses. Às 48 horas após o tratamento, a expressão de HIF-1α, VEGF e PEDF em proteína (A) ou os níveis de ARNm (B), bem como o total e fosforilada Akt e ERK1 /2 proteínas (d), foram determinados. As células A549 foram tratadas com o siRNA HIF-específica-1α (Si-HIF) (C) ou o inibidor da Akt-selectiva LY294002 (LY, 30 uM) ou o U0126 inibidor de ERK-selectivo (L, 50? M) (E) para 24 horas, respectivamente, e depois tratou-se com BBR. Às 48 horas após o tratamento, a viabilidade celular foi determinada por análise de MTT. A viabilidade celular por cento em cada grupo de tratamento foi calculada em relação às células tratadas com o controlo de veículo. Os dados são apresentados como a média ± DP de três experiências separadas. *, P 0,05, diferenças significativas entre os grupos de tratamento e grupos de controlo de DMSO.

Para validar os efeitos da BBR na sinalização HIF-1α /VEGF /PEDF, nós transfectadas células A549 com siRNA HIF-1α (100 nM) e, em seguida, tratou-os com BBR (100 uM) durante 48 h. Como mostrado na Figura 5C, knockdown de HIF-1α por siARN aumentou consideravelmente a inibição BBR-mediada de proliferação celular em comparação com a transfecção com o ARNsi de controlo. Estes resultados confirmam que o efeito de BBR na inibição da proliferação celular é também mediada através parcialmente HIF-1α /VEGF /PEDF via em células do cancro do pulmão de sinalização.

A PI3K /AKT e /sinalização MEK /ERK desempenha um Raf papel importante na regulação da proliferação de células tumorais e sobrevivência. Para determinar se a inibição do crescimento celular mediada por BBR também é através da inactivação da via PI3K /AKT e via de sinalização de Raf /MEK /ERK, analisamos o efeito de BBR na fosforilação de Akt e ERK em células A549 através de Western blot. Tal como mostrado na Figura 5D, o tratamento com BBR diminuíram significativamente os níveis da Akt fosforilada e 2 /ERK1 proteínas, enquanto que os níveis de proteína total de Akt e ERK1 /2 não se alterou.

BBR activado apoptótica dependente de caspase via

também determinar-se se o aumento da inibição do crescimento celular induzida por BBR está associada com o aumento da apoptose em células de cancro de pulmão. O tratamento com BBR, nas doses de 20 | iM e 100 jiM induziu 26% e 50% de células apoptóticas em A549 e 28% e 60% de células apoptóticas em células H1299 (Figura 6A). Para confirmar o efeito de apoptose no BBR, que próxima detectada a expressão de algumas proteínas pró-apoptóticos e anti-apoptóticos, caspase-3/7/9, PARP, BAX e Bcl-2 em células A549 por análise de Western blot. BBR marcadamente aumentou os níveis de PARP de caspase-3/7/9 clivada, e clivado BAX expressão, mas diminuiu os níveis de proteína Bcl-2, em comparação com o grupo de controlo (Figura 6B).

e A549 células H1299 foram tratados com BBR (20 uM ou 100 uM). Às 48 horas após o tratamento, a apoptose foi determinada por uma análise por SCAF (A). Os níveis da PARP de caspase-3, 7, 9, clivado clivado, BAX e Bcl-2 em células A549 foram analisados ​​por Western blot (B). A libertação de cit-c em células A549 foram analisados ​​por análise de imagem de imunofluorescência para monitorar libertação Cyt-c desde o espaço inter-mitocondrial para o citosol (C). A apoptose são representados por percentagens relativas de células em apoptose versus aquela em células tratadas com DMSO. *, P . 0,05, diferenças significativas entre os grupos tratados com BBR e os grupos tratados com DMSO

O citocromo-c (cito-c) libertação é um acontecimento importante na via de apoptose dependente de caspases . A seguir, realizada uma análise de imagem de imunofluorescência (IF) para monitorar mudanças na localização subcelular de cito-C em células A549 para determinar se BBR poderia induzir a libertação de cito-C. O tratamento com BBR (20 uM ou 100 uM) marcadamente provocou a libertação de cito-C a partir do espaço inter-mitocondrial para o citosol (Figura 6C). Estes resultados demonstram que BBR pode facilitar a jusante Cyto-c dependente assembly apoptossomo e ativação caspase no citoplasma em células de câncer de pulmão.

Discussão

Neste estudo, avaliou-se a resposta do ser humano células de câncer de pulmão A549 e H1299 a BBR, um alcalóide derivado de isoquinolina isolado a partir de ervas chinesas. Descobrimos que BBR melhorada de inibição de crescimento celular e a indução de apoptose de um modo dependente da dose, enquanto que estes efeitos não foram observados em células epiteliais brônquicas humanas normais (dados não mostrados). Os nossos resultados mostraram que o efeito antitumoral de BBR é mediada através da modulação da AP-2 /hTERT, HIF-1α /VEGF /PEDF, NF-kB /COX-2, da via PI3K /Akt, Raf /MEK /ERK, caspase /citocromo C e BAX /Bcl-2 dependente de sinalização.

hTERT tem sido considerada como o marco da carcinogênese. A sinalização /hTERT AP2 foi mostrado ser importante no cancro do pulmão de células não pequenas [44]. A inibição da expressão de hTERT foi encontrada para contribuir para prevenir a proliferação e a angiogénese e para induzir a apoptose de células cancerosas [45]. No nosso estudo, demonstrou-se que o efeito de inibição sobre BBR proliferação de células tumorais é mediada parcialmente através da sinalização de AP-2 /hTERT. O tratamento com BBR suprimiu a expressão de AP-2a-2b e AP e a sua abundância reduzida da proteína em núcleos de células, diminuindo desse modo a ligação de AP-2a e 2b para AP-promotor hTERT e para baixo-regulando a expressão de hTERT na BBR- células tratadas.

O aumento da proporção de VEGF /PEDF é necessário para a angiogênese e tumor de crescimento [46]. A /via de HIF-1α /VEGF PEDF existe como um passo crítico na angiogénese cancro do pulmão e metástase tumoral [47]. O nosso estudo mostrou que a BBR inibiu a expressão de HIF-1α, desse modo, inibiram a proporção de VEGF /PEDF em células de cancro de pulmão. É possível que BBR inibiu a acumulação de proteína HIF-1α em células de cancro de pulmão, e, em seguida, suprimida a expressão de genes relacionados com os que estão envolvidos na proliferação de células tumorais. Assim, os nossos resultados mostram que o HIF-1α sinalização contribui, pelo menos em parte, à inibição do crescimento celular induzida por BBR.

COX2 desempenha um papel essencial nas fases iniciais da carcinogénese pulmonar [48]. Aqui, demonstramos que a BBR desempenhou o seu papel anti-proliferativa em parte através da inibição da COX-2 de expressão. Descobrimos que BBR inibida COX-2 expressão não só a nível de proteína, mas também a nível mRNA, sugerindo que BBR poderia exercer efeito antitumoral parcialmente através da supressão da COX-2 de sinalização. Descobrimos também que a inibição de COX-2 por tratamento de BBR é parcialmente mediada pela estimulação de NF-kB de translocação nuclear de citosol e por inibição da ligação do NF-kB para a COX-2 do promotor.

A PI3K /AKT e /sinalização MEK /ERK Raf desempenhar um papel-chave na regulação da expressão do gene celular, sobrevivência crescimento. A relação de Raf /MEK /ERK e PI3K /AKT ao câncer de pulmão ainda é uma área de pesquisa intensa hoje em dia [49,50]. A nossa investigação demonstraram o papel importante da via PI3K /AKT e via de sinalização de Raf /MEK /ERK na inibição da proliferação celular mediada BBR. BBR pode funcionar através de inactivação da via PI3K /AKT e via Raf /MEK /ERK sinalização, inibição da fosforilação de proteínas de Akt e ERK, e regulação negativa de HIF-1α sinalização para inibir o crescimento de células tumorais.

A apoptose desempenha um papel crucial na a resposta de cancro a quimioterapia e terapia de radiação. Neste estudo, foi demonstrado que a indução de apoptose em células de cancro do pulmão humano por BBR foi mediada por citocromo-c e vias de apoptose dependente de caspases. Descobrimos que BBR induzido a activação de proteínas de caspase e de PARP, e promoveu a libertação de citocromo-c das mitocôndrias para o citosol. Nossos resultados sugerem, portanto, o efeito antitumoral de BBR em células de câncer de pulmão está associado com o aumento da ativação do citocromo-c e via apoptótica dependente de caspase.

Em resumo, demonstramos que BBR exibiu anti-proliferativa e pro actividades -apoptotic em células NSCLC através de modulação simultânea do AP-2 /hTERT, HIF-1α /VEGF, NF-kB /COX-2, Raf /MEK /ERK, PI3K /AKT e vias de sinalização da caspase /citocromo-c. Estes resultados fornecem novas perspectivas em explorar as novas estratégias terapêuticas potenciais e novos alvos para o tratamento do câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

cultura celular

O humano câncer de pulmão linhas celulares A549 e H1299 foram obtidos de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). As células foram cultivadas como monocamadas em meio RPMI 1640 meio de cultura suplementado com 10% de soro inactivado por calor fetal de bovino, 100 ug /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina, e mantidas numa incubadora com uma atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2 a 37 ° C.

Reagentes e anticorpos

Berberina (BBR), U0126, LY294002 e celecoxib foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO) e dissolvido numa pequena quantidade de DMSO antes da adição ao meio de cultura celular completo. A estreptavidina-agarose foi adquirido a Sigma (St. Louis, MO). Os anticorpos para GAPDH, VEGF, PEDF, HIF-1α, p50, p65, COX-2 foram obtidos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Os anticorpos contra o AP-2α, AP-2β, hTERT, citocromo-c, a PARP, da caspase-3/7/9, Bax, Bcl-2, Akt, ERK1 /2, phosphrylated Akt ou ERK1 /2 foram adquiridos a partir de Cell Signaling ( Beverly, MA).

-cicatrização de feridas ensaio

O ensaio de cicatrização foi realizado para detectar a migração celular. As células foram cultivadas até à confluência completa em placas de seis poços e incubadas durante a noite em meio de inanição. As monocamadas de células foram feridas com um estéril pipettetip 100 mL, lavou-se com meio de privação para remover as células destacadas das placas. As células foram tratadas com as doses indicadas de BBR em meio completo e mantido num CO

2 incubadora. Após 48 h, o meio foi substituído com PBS, a abertura da ferida foi observada e as células foram fotografadas usando um microscópio Olympus equipado com câmara digital.

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular foi determinada utilizando o ensaio de MTT (Roche Diagnóstico, Indianapolis, IN). Resumidamente, as linhas celulares de cancro de pulmão foram semeadas a 4 × 103 células /poço em placas de 96 poços. As células foram cultivadas durante a noite, e, em seguida, as células foram mudadas para um meio fresco contendo várias concentrações de BBR dissolvidos em DMSO (concentração final, 0,1%). Depois as células foram incubadas durante 48 h, o crescimento de células foi medida. O efeito sobre a viabilidade celular foi avaliada como a viabilidade celular por cento em comparação com células de controlo tratadas com o veículo, que foram arbitrariamente designados% de viabilidade 100. A concentração BBR necessária para provocar a inibição do crescimento celular de 50% (IC50) foi determinada por interpolação a partir de curvas de dose-resposta.

Anchorage independente ensaio de formação de colónia

A549 células plaqueadas em placas de 6 poços foram tratada com BBR. Depois de 24h, as células foram lavadas com PBS e tripsinizadas. Em seguida, as células (8 × 10

3 /ml) foram misturados em agar 5a de 1,0 ml de 0,3% McCoy contendo 10% de FBS. As culturas foram mantidas num banho a 37 ° C, 5% de CO

2 incubadora durante 14 dias. O meio foi descartado e as células foram cuidadosamente lavadas duas vezes com PBS.