Sumário

Wnt5a é um dos chamados ligantes Wnt não-canônicos que não atuam através β-catenina. No desenvolvimento normal, Wnt5a é secretado e dirige a migração de células alvo ao longo de gradientes de concentração. O efeito de Wnt5a em células alvo é regulada por diversos factores, incluindo o nível de inibidores e receptores de expressão. sinalização Wnt5a desregulado facilita a invasão de vários tipos de tumores em tecidos adjacentes. No entanto, a expressão e distribuição de Wnt5a cutânea no carcinoma de células escamosas (SCC), e carcinoma de células basais (BCC), bem como o efeito sobre a migração dos queratinócitos Wnt5a não foi estudada em detalhe até à data. Nós descrevemos que Wnt5a é regulada positivamente em SCC e BCC e localizada ao bordo de ataque de tumores, bem como f ibroblastos associados a tumores. O agrupamento desencadeou-Wnt5a do seu receptor Fzd3 fornece evidência de gradientes de concentração Wnt5a projetando para o tumor. Os ensaios in vitro de migração mostram que Wnt5a gradientes de concentração determinar o seu efeito sobre a migração keratinoctye: Embora a migração quimiotáctica é inibida por Wnt5a presentes em concentrações homogéneas, é melhorada na presença de um gradiente Wnt5a. Perfil de expressão da via Wnt mostra que a regulação positiva de Wnt5a na SCC é acoplado a repressão da sinalização Wnt canônico. Isto é confirmado por imuno-histoquimica que mostra a ausência de β-catenina nuclear, bem como a acumulação de Axin2 ausente. Uma vez que ambos os tipos de sinalização Wnt ato mutuamente antogonistically em vários níveis, a repressão simultânea de sinalização Wnt canônica sugere transdução de sinal Wnt5a hiper-ativo. Significativamente, esta combinação de desregulação do gene não é observada na doença hiperproliferativa da pele inflamatória psoríase benigna. Coletivamente, nossos dados sugerem fortemente que a sinalização Wnt5a contribui para a invasão de tecidos pelo cancro da pele não-melanoma

Citation:. Pourreyron C, Reilly L, Proby C, Panteleyev A, Fleming C, McLean K, et al. (2012) Wnt5a é fortemente expresso na ponta em não-melanoma Cancro da Pele, Formando gradientes activos, enquanto que a Canonical Wnt sinalização é reprimida. PLoS ONE 7 (2): e31827. doi: 10.1371 /journal.pone.0031827

editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 24 Outubro, 2011; Aceito: 12 de janeiro de 2012; Publicação: 22 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Pourreyron et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Cancer Research UK (C. Pourreyron, APS). C. Pourreyron foi financiado por Debra Internacional (Epidermólise bolhosa distrófica Research Association) e do Conselho Europeu de Investigação (CEI) (APS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Wingless-type (Wnt) ligantes são moléculas de sinalização importante no desenvolvimento. ligantes Wnt são classificados como “canonical” ou “não-canônica” [1]. Canónica Wnts, exemplificado por Wnt3a, ligam-se a receptores do tipo FZD, bem como co-receptores LRP5 /6, seguindo-se o recrutamento de um complexo heteromérico de proteína incluindo Dishevelled, Axin, e GSK3β para o complexo receptor. Isto leva à fosforilação de Lrp5 /6, e libertação de translocação nuclear β-catenina, culminando na indução de genes alvo. Por outro lado, não canônica Wnts, incluindo Wnt5a, ligam receptores FZD em conjunto com co-receptores alternativos, incluindo ROR1 /2 ou Ryk, causando mudanças β-catenina independente de como a ativação PKC e rearranjos do citoesqueleto [2]. Importante, por ligação a receptores comuns FZD, Wnts ato como antagonistas competitivos canônicos e não canônicos nos receptores comuns [3].

No desenvolvimento, a secreção de todos os ligantes Wnt incluindo Wnt5a está sujeita a controle temporal e espacial precisa em que os gradientes de concentração são conseguidas [4]. Estes gradientes de movimento morfogenética directa de células alvo, bem como a disposição de polarização assimétrica de células epiteliais [5]. Assim, Wnt5a essencialmente dirige a migração de células para o tecido circundante, por exemplo, no desenvolvimento dos membros. Um elemento chave na determinação do efeito de Wnt em células alvo é a presença de proteínas secretadas inibitórios. Estes incluem a família Dickkopf (DKK), que se ligam especificamente Lrp5 /6, servindo assim como inibidores específicos de Wnts canônico. Outros inibidores incluem Wif e os secretado Frizzled Proteínas Ligadas (SFRP) que ligam os dois tipos de ligantes Wnt, bem como receptores FZD, inibindo assim tanto canônica e canônico Wnts [6]. A distribuição espacial da SFRP, FZD, de DKK, e Wnt é minuciosamente orquestrada em desenvolvimento (por exemplo, [7], efetivamente criando corredores de difusão para a atividade de Wnt.

Não é de surpreender dado o seu papel como regulador da migração de células no tecido adjacente , a activação desregulada de Wnt5a tem sido associada com a invasividade e em vários tipos de tumores, incluindo melanoma [8], [9], o cancro da mama [10], o cancro gástrico [11], o cancro pancreático [12], e osteossarcoma [13] . invasão tumoral relacionada com Wnt5a pode também ser mediada por células associados a tumores. Assim, as células de cancro da mama Wnt5a induzir a expressão em macrófagos infiltrantes de tumor, causando a síntese de metaloproteinases de matriz (MMP) 7 [10].

Wnt5a pode ligar-se vários receptores frizzled, incluindo Fzd2, Fzd5, Fzd3, Fzd4. destes, mostrámos previamente que Fzd5 e Fzd3 são expressos no tecido parental, tanto para o carcinoma de células escamosas (SCC), a epiderme, e carcinoma de células basais (BCC ), o folículo de cabelo, respectivamente [14]. Estas isoformas de receptores FZD também foram exibidas para mediar a motilidade induzida por direccional Wnt5a no melanoma [15], bem como a migração invasiva no cancro da mama [16]. Importante, Fzd3 foi recentemente mostrado para acumular em agregados focais polarizado quando as células são expostas a um gradiente Wnt5a in vitro [15]. Enquanto gradientes Wnt5a não podem ser detectados diretamente no tecido primário, esta descoberta abre a possibilidade de utilizar a distribuição intracelular de Fzd3 como indicador de gradientes Wnt5a funcionais que actuam em células

in vitro

.

Não-melanoma cancro da pele compreendendo CBC e CEC é o mais comum de cancro humano e ainda o aumento da incidência com mais de 100.000 casos diagnosticados a cada ano no Reino Unido. Embora apenas SCC metástase em indivíduos imunocompetentes, SCCs são altamente invasivos localmente, tornando-os prontamente modelos naturais disponíveis para estudar a invasão de tecidos. A expressão de receptores cognatos Wnt5a e não foi estudado sobre o nível de proteína nestes tumores e alguns dados existem sobre o efeito de Wnt5a sobre a migração direccional de células SCC ou queratinócitos in vitro.

Aqui relatamos a distribuição de Wnt5a e os receptores Fzd5 e Fzd3 em SCC e BCC. Nós utilizamos Fzd3 localização para identificar gradientes Wnt5a operatórias em pele de adultos, bem como em SCC /BCC. Nós fornecemos mais uma prova funcional que gradientes Wnt5a melhoram dirigido motilidade dos queratinócitos. Expression profiling mostra que invasiva SCC, em contraste com a hiperproliferação de queratinócitos inflamatórios benigna, é marcada pela regulação positiva concomitante de não-canónica e repressão de sinalização Wnt canónica. Nossos dados permitem a formulação de um modelo de trabalho de como Wnt5a podem agir para melhorar a motilidade e invasão nestes tumores.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Antes de biópsia, pacientes deram consentimento por escrito para armazenamento e análise de amostras de biópsia. Armazenamento e utilização de todos os tecidos incluídos no trabalho aqui apresentado foi realizado em conformidade com a Declaração de Helsínquia e aprovado pela Comissão Tayside on Medical Research Ética B (ref REC. Nr. 07 /S1402 /90).

amostras tumorais

SCC aqui estudados foram excisadas de pacientes imunocompetentes a partir da cabeça (n = 7) ou as mãos /pés (n = 4), em cada caso, exibindo sinais em torno de danos causados ​​pelo sol e classificada como bem diferenciado (n = 8), ou moderadamente /pouco diferenciado (n = 3). BCC (n = 9) eram todos da cabeça, com exceção de um BCC excisada do lado

Imunohistoquímica

Os anticorpos utilizados foram anti Wnt5a (R .. D, a fim nr AF645, Final diluição 1:400, o anticorpo alternativa (mostrado na figura S1:.. Abcam, clone 3D10, ordem nr Ab86720, usado em 1:10000 diluição), anti-frizzled 3 (insight Biotech, encomendado através Acris Antibodies, na Alemanha, a fim nr. SP4568P, 1:200), anti-frizzled 5 (Cambridge Bioscience, ARP41245_P050, 1:800), β-catenina (Millipore, 05-665). a imuno-histoquímica foi realizada exatamente como descrito [14] amostras usando parafina-encaixados obtidos a partir de os bancos de tecidos Tayside.

a expressão estável de Wnt5a e cultura de células

Estabelecimento de células HaCat Wnt5a-transfectadas estavelmente.

células HaCat foram obtidos como descrito anteriormente [17]. As células foram plaqueadas em placas de cultura celular de 6 poços a uma densidade de 5 x 10

4 células /cavidade antes da transfecção lipofectamina com qualquer construção pcDNA3 genes WNT5A-HA (comprimento total humano Wnt5a recombinante com marcador de HA C-terminais) ou um vector pcDNA3 vazio. As células foram transfectadas com 1 ug de ADN de plasmídeo complexado com 8 ul de Lipofectamina 2000 Transfection Reagent e incubadas com complexo de transfecção durante 4 horas. O sobrenadante foi removido e DMEM + 10% de FCS contendo 800 ug /ml de G418 foi adicionado a cada poço. As células foram observadas ao longo de duas semanas, com meios de comunicação muda a cada 2-3 dias. Uma vez que as colônias começaram a aparecer, as células foram tripsinizadas e transferidas para 25 cm frascos de cultura

2 celular. As culturas foram mantidas em DMEM contendo 10% de FCS (não inactivado pelo calor) com 800 ug /ml de G418. expressão Wnt5a continuou foi verificada por Western blot utilizando anti-Wnt5a (R D, AF645, a diluição 1:1000).

Transwell ensaio de migração

Um sistema Transwell que incorporou uma membrana de filtro de policarbonato com um diâmetro de mm e poros de tamanho de 8 um (Corning, Sigma-Aldrich, Poole, Reino Unido) 6,5 foi usada para avaliar a taxa de migração celular. células tratadas com mitomicina C (1 × 10

5) foram suspensos em 100 ul de BSA a 0,1% de DMEM com ou sem humano /ratinho Wnt5a recombinante (0,1? g /mL) (R D, Abingdon, Reino Unido, a fim nr. 645-WN) e semearam-se na câmara superior do inserto Transwell. A câmara inferior foi preenchida com 600 ul de DMEM suplementado com 5% de FBS. A migração de células HaCat-pcDNA na presença de um gradiente de concentração Wnt5a foi realizada como se segue. Wnt5a células que sobre-expressam ou pcDNA HaCat foram semeadas em placas de 24 W /placas de 48 h antes da adição do Transwell insere até atingirem confluência. Imediatamente antes de adicionar as inserções Transwell contendo células HaCat-pcDNA (em DMEM contendo BSA a 0,1%) dos meios nos poços foram substituídos por 5% FBS fresco de DMEM para remover qualquer Wnt5a pré-secretado. As placas foram deixadas durante 18 h a 37 ° C. Subsequentemente, as células nos filtros foram coradas com 1% de bórax e 1% de azul de metileno. As células nonmigrating sobre a superfície superior do filtro foram removidas com uma cotonete e as células que migraram para a superfície inferior do filtro foram lisadas com uma solução de SDS a 1% e quantificado medindo a absorvância a 630 nm utilizando um espectrofotómetro de microplacas.

migração ferida arranhões ensaio

As células foram cultivadas até à confluência numa placa de 6 poços em meio de HaCaT. Duas horas antes do ferimento, as células foram tratadas com mitomicina C (10 ug /ml) para prevenir a proliferação. Uma ferida foi feito pela aplicação de um 200 ul ponta de pipeta de plástico através do centro da camada de células. As células foram lavadas duas vezes com PBS e incubadas em DMEM suplementado com 10% ou 1% de FCS.

Expression profiling

O log 2 transformado conjunto de dados de matriz processada foi obtido a partir de [18]), dados do inverso do log2 calculados e dobre-as alterações entre SCC e controle pele exposta ao sol calculados para cada caso (n = 12). dobra-mudanças e testes t média foram calculadas como descrito [19]. análise psoríase perfil de expressão foi feito como descrito [19].

Resultados

Wnt5a é fortemente expressos em câncer de pele não-melanoma

Foram estudados expressão Wnt5a em um painel da SCC (n = 11) e CBC (n = 9), excisado de indivíduos imunocompetentes, por imuno-histoquímica. A fim de permitir a avaliação semi-quantitativa foi utilizada a expressão previamente caracterizados de Wnt5a na camada basal da epiderme ou [14] como a calibração interna. Como mostrado na Figura 1, Wnt5a foi fortemente expresso no CEC e BCC em relação ao seu nível de expressão na camada basal da epiderme (marcada com a seta preta) nas mesmas secções (Fig. 1-A, C). fibroblastos associados a tumores, bem como células endoteliais coradas também fortemente positivos para Wnt5a (Fig. 1b, d, setas vermelhas e azuis, respectivamente). Embora Wnt5a coloração era detectável ao longo de tumores (exemplo mostrado na Fig. 1a), que foi mais intenso no bordo de ataque da maioria dos tumores (Fig. 1e). Estes resultados foram consistentes entre todas as amostras de tumores estudados (Tabela 1 e abaixo) e foram reprodutíveis usando um anticorpo alternativa para IHC (figuras S4, S5).

imunohistoquímica do Wnt5a da SCC (a, b), ou BCC (c, d), mostrado em 40 × (a, C), ou 200 × (b, d) ampliação. (E) Três tumores SCC, mostrado em 10 x de ampliação, que ilustram forte Wnt5a – coloração na borda do tumor. Os números mostrados são representativos para SCC (n = 12) e BCC (n = 9), respectivamente. As setas indicam as seguintes estruturas: preto – camada basal da epiderme, tumores branco-, associados ao tumor células endoteliais vermelhos, fibroblastos azuladas, verde – folículo piloso

distribuição polarizada Focal de. Fzd3 na pele e câncer de pele não-melanoma indica gradientes Wnt5a

gradientes de concentração

Wnt5a não pode ser detectada diretamente in vivo. No entanto, recentemente, foi mostrado que, ao detectar um gradiente de concentração Wnt5a, as células alvo responder por agregação do receptor Fzd3 Wnt5a em agregados focais in vitro [15]. Portanto, os agregados Fzd3 pode ser usado como marcador indirecto para identificar as células expostas a um gradientes Wnt5a em tecido primário usando imuno-histoquímica. Com efeito, verificou-se que exibiram um Fzd3 distribuição focal notavelmente polarizada tanto em queratinócitos epidérmicos, bem como nos folículos pilosos (Fig. S1), o que sugere que os gradientes Wnt5a são operativos não só no desenvolvimento, mas também na pele de um adulto diferenciadas. Em seguida, foi investigada a distribuição Fzd3 nas secções tumorais. Tal como acontece com Wnt5a, utilizou-se a intensidade de coloração do Fzd3 na epiderme em cada secção para avaliar o nível de expressão semiquantitativamente relativa (fig. 2a, preto vs. setas brancas). Como mostrado na Figura 2, Fzd3 foi encontrado em uma distribuição zonal, de tal modo que Fzd3-negativa áreas tumorais alternam com zonas Fzd3-positiva (Fig. 2b, e) dentro dos tumores, enquanto que as bordas invasivos não coraram positivo (Fig. 2d ). fibroblastos infiltrantes tumorais e células endoteliais foram negativos para Fzd3. Nessas células tumorais que se pronunciou Fzd3, Fzd3 exibiu uma pronunciada agregados intracelulares focais polarizadas, sugerindo a existência de gradientes Wnt5a. No entanto, em contraste com a epiderme normal, Fzd3 agregados não foram alinhadas ao longo de planos recogniseable, indicativos de gradientes Wnt5a desorganizado. Este padrão de expressão global Fzd3 foi muito comparáveis ​​entre todos os tumores estudados (Tabela 1).

A imuno-histoquímica realizada como na figura 1 realizada em SCC (a-d), ou BCC (E-F) mostrado na 40 × ( a), 100 × (b, d, e), ou 400 × (C, F) de ampliação, respectivamente. Setas pretas indicam a intensidade da coloração de Fzd3 na epiderme usados ​​para avaliar a intensidade de coloração em tumores (indicado por setas brancas). As setas vermelhas indicam limite de tumores, apontando para estroma.

expressão heterogéneas de Fzd5 em câncer de pele não-melanoma

Fzd5 é outro receptor Wnt5a reconhecido. Uma vez que nós encontramos anteriormente de que a expressão Fzd5 na epiderme adultos está restrita à camada granular alta ([14] e a Figura 3a, seta preta), indicativo de um padrão de expressão regulada pela diferenciação, estudou-se a expressão Fzd5 em cancros reflectida estado de diferenciação do tumor. Em contraste com Fzd3, Fzd5 não exibem distribuição intracelular focal e foi variável entre tumores individuais. Embora a maioria dos tumores exibiram SCC moderada a forte expressão Fzd5 (Fig. 3a, c), 3 de 11 tumores mostrou fraca-se ausente coloração (fig. 3b, d). De nota, essas variações não foram relacionados ao estado de diferenciação do tumor. Apenas duas amostras BCC exibiram forte expressão Fzd5 (Fig 3 g.), Enquanto era baixos ou indetectáveis ​​na maioria (Fig 3F, H;. Quadro 1). Tal como acontece com Fzd3, tumores que se pronunciou Fzd5 exibiu Fzd5-positivos regiões alternadas com regiões Fzd5-negativos (Fig. 3a). Por outro lado, tumorais – células endoteliais associada exibiu consistentemente expressão Fzd5 forte (fig 3c, h.). fibroblastos associados a tumores eram fracos a moderadamente positivo para Fzd5 (fig. 3c, inserir). Assim, enquanto que a expressão Fzd5 é variável em células de cancro da pele não-melanoma, o seu nível de expressão no tumor vasos é consistente com um papel deste receptor na mediação de vias inflamatórias dependentes de Wnt5a, consistente com relatos anteriores [20], [21].

a imuno-histoquímica de CAA (a-d), ou BCC (e-h), em cada caso, que mostra um exemplo de tumores que exibem elevada (SCC:, a c; BCC: e, g) ou baixo (SCC : b, d; BCC: f, h) a expressão Fzd5. intensidades de coloração nos tumores pode ser directamente comparada com intensidades de coloração de Fzd5 na camada granular da epiderme (setas pretas). Os painéis a, b, E, F são mostradas em 40 × e c, d, g, h a 200 × ampliação. A inserção no canto inferior direito de (c) mostra um fibroblasto associado a um tumor. As setas vermelhas indicam vasos sanguíneos.

receptores Wnt5a e FZD são expressos por não-sobreposição subconjuntos de células tumorais

A seguir, estudaram a relação espacial de Wnt5a, Fzd3 e Fzd5 em tumor individual amostras. Para este fim, determinou-se as intensidades de coloração destas proteínas em secções em série dos tumores individuais, respectivamente, uma vez que os anticorpos adequados para a co-imunofluorescência em amostras embebidas em parafina foram indisponível. Como mostrado na Figura 4, Wnt5a foi predominantemente expresso no margens do tumor em SCC (bem como no estroma associado ao tumor). Em contraste, Fzd3 localizada em células no interior da massa do tumor, por vezes formando tumorais ninho-domínios semelhantes Fzd3-positivas (painel do meio, na cabeça de seta branca) e, como descrito acima, exibindo distribuição intracelular focalmente polarizada. Fzd5 exibiram distribuição intra-tumor heterogêneo, sendo localizada a clusters intra-tumorais (parte superior), fracos /difusamente na borda (parte inferior), ou de forma homogénea em todo (meio). dispositivos análogos foram observados em BCC, com Wnt5a sendo mais fortemente expressos no bordo de ataque, bem como no estroma associado a um tumor (Figura 5, painéis da esquerda), enquanto Fzd3 mostraram expressão polarizada no interior do tumor (Figura 5, parte superior do meio), ou em Fzd3 positivo ninhos (cabeças de seta branca). Fzd5 era fraco ou ausente na maioria dos CBCs (canto inferior direito, ver quadro 1). Quando expressa, Fzd5 exibiu localização intra-tumoral difusa (superior direito), ou na extremidade do tumor (média direita). Tomados em conjunto, os dados mostram que Wnt5a e seus receptores são expressos por sub-populações que não se sobrepõem. A forte expressão de Wnt5a no bordo de ataque, bem como em células do estroma circundante-tumor, em conjunção com a expressão de Fzd3 polarizada no interior da massa do tumor sugere que os gradientes Wnt5a projectar para dentro do tumor para aumentar a motilidade em subpopulações distintas.

As secções em série de três amostras de tumor SCC embebidos em parafina (superior, médio, linha inferior, respectivamente) foram coradas para Wnt5a, Fzd5, Fzd3, respectivamente, conforme descrito em Métodos, e mostrado em 200 × ampliação. asterisco vermelho denota coloração nuclear artificial, possivelmente devido às condições de recuperação antigênica. As setas vermelhas indicam os limites de tumores, apontando para estroma

A imuno-histoquímica de amostras cortadas em série coradas para Wnt5a, Fzd5 ou Fzd3 como indicado, a ampliação:. 100 × (linha superior), 200 × (médio, linhas inferiores).

Wnt5a gradientes de concentração melhorar a motilidade direcional de queratinócitos

Os dados resumidos acima gradientes de concentração Wnt5a sugeridas podem ser importantes para o seu efeito sobre a motilidade celular. Para testar esta hipótese funcionalmente, utilizou-se queratinócitos humanos HaCat como um modelo. Nós estavelmente transfectadas células HaCat com um vector expressando Wnt5a, ou vector de controlo vazio (denominado HaCat pcDNA). Expressão de Wnt5a recombinante foi verificada por meio de western-blot (fig. 6A). Primeiro, avaliamos dirigido migração celular em um ensaio Transwell de duas câmaras. Como mostrado na Figura 6B, quando Wnt5a recombinante foi adicionada directamente a HaCat-pcDNA queratinócitos na câmara superior, assim, presente em uma concentração homogénea em torno de células migrantes, que inibiu a migração quimiotáctica para 5% de FCS presente no fundo do poço. Da mesma forma, a migração quimiotáctica foi significativamente reduzida em células que sobre-expressam Wnt5a relativamente a células não sobre-expressam (Fig. 6c). Um resultado semelhante foi obtido num curto prazo (6 horas) Ensaio de migração usando 5% de FCS ou EGF como quimioatractor (Fig. S2A). Além disso, em ensaios de raspar, a migração de células HaCat Wnt5a-sobre-expressam em FCS a 10% DMEM (Fig. 6D) para a borda do zero foi grandemente reduzida em comparação com as células HaCat-pcDNA (foram encontrados resultados semelhantes quando se usa 1% de FCS como quimioatractor, fig. S2A). Assim, a migração dos queratinócitos é inibida quando Wnt5a rodeia as células a uma concentração homogénea. Em contraste, quando Wnt5a-segregam células HaCat foram semeadas no fundo de uma câmara de Transwell, estabelecendo assim um gradiente ascendente concentração Wnt5a, migração de não-Wnt5a superexpressando células Hacat semeadas na câmara superior voltada para a fonte Wnt5a foi significativamente melhorada (fig. 6e). Estes dados mostram que os queratinócitos humanos são induzidas a migrar para um Wnt5a de gradiente, mas que não diminui gradiente Wnt5a motilidade em relação a outros quimioatractivos.

. Expressão de Wnt5a endógeno e recombinante em lisados ​​de células inteiras de estavelmente transfectadas que sobre-expressam Wnt5a HaCat ou células de controlo (pcDNA-HaCat) verificada por transferência de western. sobreexpressam células HaCat-pcDNA B. Não Wnt5a foram semeadas na câmara superior de um Transwell em 0,1% de BSA DMEM na ausência ou na presença de Wnt5a recombinante em 1 ug /ml, como indicado na figura. A câmara inferior foi preenchida com 600 ul de DMEM contendo FCS a 5% como quimioatractor. Os resultados são expressos como percentagem de células que migram quando HaCat-pcDNA foram semeadas somente em BSA a 0,1% DMEM. Os resultados apresentados representam DP ± média de dois experiência independente, cada uma realizada em triplicado, * p ≤ 0,05. C. Comparação de migração celular Wnt5a-superexpressão e controle pcDNA. As células em suspensão em 0,1% de BSA DMEM foram semeadas na câmara superior. A câmara inferior foram preenchidos com 600 DMEM ul contendo 5% de FCS, como quimioatrativo. A migração foi avaliada em 18 h utilizando um ensaio colorimétrico. Os resultados são expressos como percentagem de células que migram HaCat-pcDNA. Os resultados apresentados representam DP ± média de n = 4 experiência independente, cada uma realizada em triplicado, *** p≤0.001. ensaio de ferida arranhões D. realizada em células tratadas com mitomicina-C. Durante a migração, HaCat-pcDNA (a, b, c), ou células que sobre-expressam Wnt5a (d, e, f) foram mantidas em DMEM contendo 10% de FCS. Fotos foram tiradas imediatamente após a zero foi feita (0 horas) (A e D), assim como 18 h (B e E) e 24 h mais tarde (C e F). E. A migração de células de controlo HaCat-pcDNA na presença de um gradiente de concentração Wnt5a. Wnt5a células que sobre-expressam ou pcDNA HaCat foram semeadas em poços de fundo de placas Transwell. Imediatamente antes de adicionar as inserções contendo células HaCat-pcDNA na câmara superior, a mídia nos poços de fundo foi substituído para remover Wnt5a pré-segregada. A migração foi avaliada em 18 h. Os resultados são expressos como percentagem de células que migram HaCat-pcDNA. Os resultados apresentados representam DP ± média de n = 3 experimentos independentes, cada uma realizada em triplicado, *** p≤0.001.

O aumento da expressão Wnt5a em SCC cutânea é acompanhada pela repressão da sinalização Wnt canônica e regulação negativa da sinalização inibidores

Desde vias canónicos e não canónicas cruzada inibir uns aos outros, o efeito de sinalização Wnt5a

in vitro

é dependente da abundância relativa de outros ligandos, moduladores, receptores e efectores a jusante na via de sinalização Wnt rede. Por isso, realizamos uma análise abrangente da expressão de Wnt-sinalizando componentes no carcinoma cutâneo invasivo primário de células escamosas. Como mostrado na Tabela 2, foi a mais Wnt5a significativamente regulada positivamente de todos os ligandos Wnt (quatro vezes, P = 8 × 10

-6), independenly confirmando os dados de imuno-histoquímica. Por outro lado, o membro de Wnt canónica mais altamente expresso, Wnt3a, é significativamente regulada para baixo, aliviando assim o antagonismo competitivo para Wnt5a ao nível do receptor. (Outra ligante Wnt canônica, Wnt8b, é formalmente regulada, mas parece ser expresso em níveis muito mais baixos no total, Tabela 2). Entre os receptores de ligação frizzled Wnt5a reconhecidos, Fzd2 e Fzd5 são regulados positivamente, embora a significância estatística marginal (Tabela 3). Entre Wnt extracelular antagonistas SFRP1 é regulada, de acordo com ainda mais a repressão da sinalização Wnt canônica (veja abaixo, Discussão). DKK2, específicos para membros Wnt canónicos, também é reprimido, mas a expressão da muito maior expresso DKK1 é inalterado. Em contraste, os antagonistas de segmentação tanto canônica e não canônica Wnts, Wif e SFRP2 /3, bem como a chave antagonista de sinalização intracelular Axin2, são significativamente reprimidos. Estas alterações são graficamente resumidos na Fig. 7-A. Coletivamente, eles sugerem que a regulação positiva de Wnt5a em SCC invasiva é parte de um conjunto de alterações que agem sinergicamente para aumentar a não-canônico, mas reprimir sinalização Wnt canônica (veja abaixo, Discussão).

(a) dos desenhos ilustrando relações funcionais entre os componentes de sinalização Wnt nas tabelas 2 e 3. vermelho: regulada, verde: reguladas-down. Grandes linhas pontilhadas representam proteína de ligação. (B) de desregulação específico SFRP1 e SFRP2 em SCC invasiva, mas não a psoríase. Dobre-a desregulação de transcritos em placas de psoríase foi calculada como descrito anteriormente [19] e alinhadas com o conjunto de dados SCC descrito nas tabelas 2 e 3. O código de cores e negrito definidos como na tabela 2. “ns”:. Não significativa

inversa regulação da transcrição simultânea de Wnt5a e Wnt3a distingue SCC de não-invasivo hiperprolifera�o benigna

a regulação positiva da transcrição da própria Wnt5a não deve causar invasão, uma vez que é também fortemente supra-regulada na psoríase, uma desordem hiperproliferativa, mas não invasiva [14]. Por isso, procurou-se identificar os fatores adicionais que giram ação fisiológica Wnt5a em um potenciador para a migração invasivo. Para tanto, comparamos a expressão gênica de componentes de sinalização Wnt em SCC com psoríase. Em ambas as condições, o respectivo estado patológico é comparada com a pele de controlo saudável. O nível relativo de expressão de genes, expressa como nível de hierarquia, correlacionou-se bem entre as amostras de pele de controlo em ambos os conjuntos de dados, respectivamente, indicando que a desregulação dos genes detectados em qualquer condição ocorre em relação a um controlo semelhante (Fig. S3). Figura 7b mostra um mapa de calor desregulação com código de cores dos componentes Wnt-sinalização nas tabelas 2 e 3 para SCC vs. psoríase. Na confirmação de nossas descobertas anteriores [14], Wnt5a e Fzd5 também são regulados positivamente na psoríase. Do mesmo modo, a regulação negativa do DKK2 inibidor de wnt canónica, CTNNBIP1 (ICAT), Axin2, bem como FRZB (SFRP3) é comum a SCC e psoríase. No entanto, a repressão de Wnt3, bem como a desregulação do SFRP1 e SFRP2 são encontrados apenas em SCC cutânea invasiva, mas não a psoríase.

A falta de coloração β-catenina nuclear e fraca expressão de proteína confirmam Axin2 regulada negativamente canónica Wnt-sinalização em SCC e BCC

a fim de obter provas mais independente para o status de ativação de canônica Wnt-sinalização foi realizada imuno-histoquímica de β-actina, utilizando um anticorpo específico para ativado (Ser38 /Thr41 desfosforilado) β – actina. Como se mostra na figura 8, β-catenina nuclear era abundante na camada granular da epiderme ausente, mas a partir de qualquer SCC ou tumores BCC. Isto foi verdade para todas as SCC (n = 12) e CBC (n = 7) amostras estudadas. Nós ainda aproveitou o repositório de arranjo de tecido disponíveis publicamente disponível no site da ProteinAtlas. Esta base de dados contém dados de imuno-histoquímica que varia em qualidade dependendo dos reagentes utilizados. No caso de β-catenina, o site contém séries coradas com quatro anticorpos diferentes, três dos quais têm sido extensivamente validado (ver Dados S1). IHC imagens geradas utilizando o mesmo anticorpo específico para β-catenina ou anticorpos de detecção β-catenina total de activado revelou a presença de membrana localizada-β-catenina, mas a ausência consistente de β-catenina nuclear em 12/12 SCC e em 11 /BCC utilizando-se quatro anticorpos diferentes (Fig. 9, de dados S1). Finalmente, também extraído os dados em ProteinAtlas disponíveis para Axin2. Mesmo que o nível de validação deste anticorpo não é tão robusto como para os anticorpos β-catenina, os dados disponíveis sugerem fortemente que Axin2 não acumular em qualquer SCC ou BCC (figura S6). Assim, os dados de nível de proteína são consistentes com o perfil de expressão de dados, o que sugere a repressão da sinalização de Wnt canónica.

A imuno-histoquímica de três BCC (a-c) e SCC (d-f), as amostras coradas com um anticorpo específico para activada p-catenina. Nota forte β-catenina nuclear confinado à camada granular de epiderme em cada amostra, bem como em um folículo de cabelo ampliada imediatamente abaixo células SCC (inserção em d). Todas as amostras mostradas na ampliação de × 100, inserir a 400 ×.

As amostras foram coradas quer com um anticorpo específico para activado β-catenina não fosforilado (em cima) ou pan-β-catenina (fundo) . Imagens em (a) e (d) mostram a distribuição β-catenina observada com o anticorpo respectivo. Note-se que forte β-catenina nuclear se limita à camada granular da epiderme.

Discussão

Vários estudos têm sugerido um papel de Wnt5a na invasão do cancro (por exemplo, [16], [22] -. [25]. no entanto, o papel de Wnt5a no cancro é controverso, alguns relatórios que sugerem que Wnt5a pode actuar como supressor do tumor por antagonizar a sinalização de Wnt canónica (revisto em [26]) por outro lado, tanto canónica e