Sumário
As expressões de diferentes isoformas do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) está associada com o grau de capacidade de invasão do tumor e o prognóstico do paciente em cancros humanos. Nossa hipótese é que diferentes isoformas de VEGF podem exercer efeitos diferentes sobre as características funcionais e estruturais da angiogênese tumoral. Usamos dinâmica com contraste MRI (DCE-MRI) e steady-state com realce de contraste MRI (SSCE-MRI) para avaliar
In vivo
funções vasculares (por exemplo, de perfusão e permeabilidade) e estruturais características (por exemplo, tamanho e densidade de vasos vasculares) da angiogénese tumoral induzida por diferentes isoformas de VEGF (VEGF121, VEGF165, VEGF189 e) num modelo de xenoenxerto de cancro do pulmão de murino de humano. Os tumores que sobre-expressam VEGF189 foram maiores do que aqueles que sobre-expressam as outras duas isoformas de VEGF. O
K
mapa trans obtido a partir de DCE-MRI revelou que as funções de perfusão e permeabilidade de microvasos tumorais foi maior em ambas as regiões do aro e do núcleo de tumores com superexpressão VEGF189 (
p
0,001 para ambos aro do tumor e do núcleo). A densidade de vasos relativa e os índices de tamanho dos vasos relativas derivadas de SSCE-MRI revelou que os tumores com superexpressão-VEGF189 teve o menor (
p Art 0,05) e os mais densos (
p Art 0,01 microvasos), que penetraram profundamente a partir do aro do tumor para dentro do núcleo, seguidos pelo tumor-overepxressing FCEV165, cuja microvasos estavam localizados principalmente na borda do tumor. Os microvasos menor densidade foram encontradas no tumor que sobre-expressam VEGF121; destes microvasos tinha um lúmen relativamente grande, e verificou-se principalmente no rebordo do tumor. Conclui-se que entre as três isoformas de VEGF avaliados, VEGF189 induz os microvasos tumorais mais densamente brotando e menores com a mais alta
in vivo
perfusão e permeabilidade funções. Estas características de microvasos de tumor podem contribuir para os efeitos adversos relatados de sobreexpressão VEGF189 sobre a progressão do tumor, metástase, e a sobrevivência do paciente em vários cancros humanos, incluindo o cancro do pulmão de células não pequenas, e sugerem que a aplicação de terapia agressiva pode ser necessária em cancros humanos em que VEGF189 é overexpressed
Citation:. Yuan A, Lin CY, Chou CH, Shih CM, Chen CY, Cheng HW, et al. (2011) características funcionais e estruturais do Tumor Angiogenesis em cancros do pulmão superexpressão diferentes isoformas de VEGF avaliada por DCE- e SSCE-MRI. PLoS ONE 6 (1): e16062. doi: 10.1371 /journal.pone.0016062
editor: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 16 de Agosto de 2010; Aceito: 07 de dezembro de 2010; Publicação: 20 de janeiro de 2011
Direitos de autor: © 2011 Yuan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O estudo é financiado pelo Conselho Nacional de Ciência (https://web1.nsc.gov.tw), conceda número NSC 98-3112-B-001-019. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a angiogénese é necessária para o crescimento tumoral e metástase [1], [2], e tem sido demonstrado que a actividade elevada da angiogénese do tumor está associada com o crescimento do tumor avançado, metástases distantes, e um prognóstico desfavorável em cancros humanos [ ,,,0],3], [4]. factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um factor angiogénico potente tanto em condições fisiológicas e patológicas, e pode induzir a angiogénese tumoral [5], [6]. O gene de VEGF humano (
VEGF-A
), que está localizado no cromossoma 6p, contém oito exões [7]. O splicing alternativo do gene VEGF dá origem a múltiplas isoformas. Três principais isoformas de VEGF-A (VEGF121, VEGF165, e VEGF189) são expressos numa variedade de tecidos humanos e de espécimes tumorais [5], [8], e tem propriedades bioquímicas diferenciais e funções biológicas em angiogénese fisiológica [9] – [13 ].
As funções biológicas de diferentes isoformas de VEGF-A na angiogénese patológica, tal como a angiogénese de tumores, ainda não são claras. Vários estudos, incluindo o nosso estudo anterior, têm demonstrado que a expressão de VEGF189 em um tumor está fortemente associado com uma elevada contagem de tumor de microvasos, metástase do cancro, e a sobrevivência do paciente curto em vários cancros humanos [14] – [16], e com a xenotransplantability alta de várias células cancerosas humanas em ratos [17]. No entanto, os mecanismos subjacentes a essas atividades permanecem desconhecidas. Poucos estudos avaliaram os papéis dos diferentes principais isoformas de VEGF na determinação das funções da microcirculação tumor e na facilitação tumorigênese e metástase do tumor através de angiogênese tumoral.
dinâmico com contraste MRI (DCE-MRI) com a utilização do meio de contraste T1 Magnevist (Gd-DTPA, PM: 938 Dalton), é capaz de proporcionar um parâmetro funcional vascular, a constante de transferência vascular (
K
trans), o que dá uma medida da perfusão e permeabilidade dos vasos [18] – [21]. Além disso, a ressonância magnética (SSCE-MRI) steady-state com realce de contraste em combinação com o agente T2, Resovist (óxido de ferro super-paramagnético (SPIO) partículas, tamanho: 45-60 nm), pode dar informações estruturais sobre microcirculação, ou seja, a relação índice de densidade vascular (rVDI) e o índice de tamanho relativo do reservatório (RVSI) [22] – [26]. MRI é, portanto, rapidamente emergindo como um método promissor para a avaliação da perfusão vascular e permeabilidade e densidade microvascular (MVD) e tamanho
in vivo
em vários cancros humanos [27] – [30].
Nossa hipótese é que diferentes isoformas de VEGF pode induzir a angiogênese do tumor com diferentes funções biológicas. Portanto, nós utilizamos DCE- e SSCE-ressonância magnética para avaliar as características funcionais e estruturais da angiogênese do tumor em cancros do pulmão com superexpressão uma das três isoformas única VEGF diferentes (VEGF121, VEGF165 ou VEGF189) em um modelo de xenotransplante murino. O objetivo deste estudo foi testar se
K
trans, rVDI e RVSI da angiogênese tumoral diferiu entre os tumores de pulmão com superexpressão um dos três diferentes isoformas de VEGF. Os resultados ajudará a elucidar o papel de diferentes isoformas de VEGF na indução de angiogénese de tumor, a interacção entre a estrutura e função de angiogénese de tumor, e os mecanismos subjacentes à associação entre a expressão de uma isoforma de VEGF específica em um tumor e o resultado clínico do paciente em cancros humanos.
resultados
Geração de linhas celulares CL1-0 estáveis expressando diferentes isoformas de VEGF
A linha de células de cancro do pulmão pai CL1-0 foi transfectado de forma estável com VEGF121, VEGF165 ou cDNA isoforma VEGF189 ou o vector vazio (simulada transfectadas). Cerca de 20 clones de cada célula que expressa o VEGF–isoforma foram analisados, e um painel (isto é, VEGF121-3, FCEV165-C12, e VEGF189-A3) foi finalmente seleccionado para experiências, como apresentaram níveis semelhantes de expressão de VEGF isoforma. O ARNm de VEGF isoforma recombinante expresso por cada um dos clones foi confirmada por em tempo real quantitativa de RT-PCR. A proteína recombinante expressa também foi confirmada por Western blot (Fig. 1A), com os pesos moleculares esperados sendo de 18 kDa (VEGF121), 23 kDa (VEGF165), e de 26 kDa (VEGF189). A quantidade de cada isoforma de VEGF no sobrenadante da cultura, tal como determinado através de ELISA, foi de 1,14 x 10
2-2,9 x 10
2 ng /célula em um período de 48 h. O VEGF isoformas nível de expressão
in vivo
nos tumores implantados determinados pela quantitativa em tempo real RT-PCR foi semelhante entre os tumores com superexpressão uma das três isoformas VEGF (p = 0,953, ANOVA one-way) (Fig. 1B ).
A. Western blot de expressão da proteína isoforma VEGF em lisado celular de células de câncer de pulmão CL1-0 humanas transfectadas com diferentes construções individuais VEGF isoformas. Cada proteína VEGF isoforma constituído um glicosilada (superior) e um não glicosilada (inferior) proteína. Tubulina foi utilizada como um controlo interno. B. Quantificação da expressão de ARNm de VEGF
In vivo
nos implantes tumorais por reversa em tempo real quantitativa de transcrição-PCR. O nível de VEGF isoforma expressão foi semelhante entre linhas celulares de cancro de pulmão CL1-0 superexpressam uma das três isoformas de VEGF (p = 0,953, ANOVA one-way).
Os volumes tumorais e curvas de crescimento do VEGF tumores -isoform-superexpressão, medida pelo T2WI
Os volumes de VEGF121-, VEGF165- e VEGF189- com superexpressão tumores, como medido em imagens ponderadas em T2 (Fig. 2) aumentou a partir do dia 7 ao dia 35 após a inoculação, ao passo que os tumores simulados não mostraram qualquer aumento significativo no volume do tumor (o tumor simulada indica o tumor derivado da linha celular de cancro do pulmão CL1-0 transfectadas com um vector vazio). A curva de crescimento do tumor mostrou que os VEGF189- e VEGF165- tumores com superexpressão cresceu mais rápido do que os outros (
n
= 6,
p Art 0,0001 por ANOVA de duas vias, tudo
p
valores 0,001 por Fisher do
post hoc
teste; A Fig. 3). A curva de crescimento também mostrou que a VEGF189- e tumores com superexpressão VEGF165 cresceu rapidamente e de forma exponencial após o dia 21 (
p Art 0,05, por Fisher do
post hoc
teste; A Fig. 3).
O crescimento do tumor de células cancerosas que sobre-expressam CL1-0 uma das três isoformas de VEGF em diferentes pontos de tempo em ratinhos SCID, estimado utilizando T2WI. #, VEGF189 contra VEGF121 e os tumores simulados; +, VEGF165 contra VEGF121 e os tumores simulados; *, A comparação entre diferentes tumores que expressam isoformas e simulados. As diferenças entre tumores com superexpressão de VEGF e tumores simulados foram significativas no
p Art 0,05 (um símbolo),
p Art 0,01 (dois símbolos),
p
0,001 (três símbolos), e
p Art . níveis 0,0001 (quatro símbolos)
no final do dia 35, os volumes dos xenoenxertos tumorais foram 141,1 ± 22,4 mm
3, 610,8 ± 87,8 mm
3, e 738,0 ± 116,1 mm
3 para o VEGF121-, VEGF165- e VEGF189-superexpressão tumores, respectivamente, enquanto que a do xenotransplante tumoral simulada foi de 37,4 ± 7,9 mm
3. Os volumes do VEGF165- e tumores que sobre-expressam VEGF189 no dia 35 foram significativamente maiores do que os dos tumores transfectadas por simulação e que sobre-expressam o VEGF121 (figura 3;. Todas
P
0,001 por Fisher
pós
hoc teste). O volume do tumor que sobre-expressam VEGF189 tendeu a ser maior do que a de tumor que sobre-expressam VEGF165, mas a diferença não atingiu significância estatística.
perfusão e permeabilidade de microvasos de tumor avaliada pela
K
mapa trans no DCE-MRI
Figura 4A mostra o temporal,
K
mapa trans para os três tumores VEGF-isoforma-sobre-expressam desde o dia 7 ao dia 35. vários padrões angiogénicos de
K
trans foram observadas nos diferentes tumores VEGF-superexpressão e simulados. No dia 35, o
K
sinal trans foi observada principalmente na borda do tumor nos tumores transfectadas por simulação e que sobre-expressam o VEGF121, enquanto no tumor que sobre-expressam o VEGF165, o
K
sinal de trans foi localizado principalmente na borda, com algumas no núcleo. Uma quantidade substancial de sinal que se estende desde a borda para o núcleo foi observado no tumor VEGF189-superexpressão.
In vivo
temporal,
K
mapa trans e quantitativa curva para xenoenxertos de tumor de células cancerosas que sobre-expressam CL1-0 uma das três isoformas de VEGF em diferentes pontos do tempo, avaliada por DCE-MRI. (A) Representante
K
mapa de cores trans nos diferentes tumores VEGF-superexpressão e transfectadas por simulação (dentro do círculo pontilhada) em momentos diferentes, a partir do dia 7 ao dia 35 pós-implantação. A cor variou de azul (0 /min, o mais baixo
K
trans) ao vermelho (0,8 /min, mais alto
K
trans). B) A análise quantitativa de
K
valores trans ao longo do tempo nas regiões de todo o tumor (superior), rim tumor (meio) e núcleo tumoral (inferior). #, VEGF189 versus outras isoformas e os tumores simulados; +, FCEV165 contra tumores VEGF121 e simulados. As diferenças entre tumores com superexpressão de VEGF e tumores simulados foram significativas no
p Art 0,05 (um símbolo),
p Art 0,01 (dois símbolos),
p
0,001 (três símbolos), e
p Art 0,0001 (quatro símbolos) níveis. (C)
K
valores trans no dia 35 no aro tumor (superior) e núcleo tumoral (meio), ea proporção de
K
valores trans entre o núcleo do tumor e do tumor da jante (inferior). As diferenças entre tumores com superexpressão de VEGF e tumores simulados foram significativos a *
p Art 0,05, **
p Art 0,01, ***
p Art 0,001, e ****
p
. 0,0001 níveis
a mudança temporal na
K
valores trans em toda a, borda, e núcleo do tumor aumentou significativamente após o dia 14 na VEGF189- e tumores com superexpressão VEGF165, enquanto não houve aumento significativo no
K
valores trans para os tumores transfectadas por simulação e-superexpressão VEGF121 (Fig . 4B). O temporal,
K
curvas trans foram significativamente maiores nos tumores com superexpressão VEGF189 em todo o tumor (Fig. 4B, superior), rim tumor (Fig. 4B, no meio), e do núcleo do tumor (Fig . 4B, menor) do que nos outros (todo o
p Art 0,001 por
post hoc
teste de Fisher)
no dia 35, o
K
valores trans do aro e do núcleo dos tumores eram de 0,25 ± 0,07 /min e 0,06 ± 0,03 /min, respectivamente, para tumores que sobre-expressam o VEGF121, 0,53 ± 0,08 /min e 0,28 ± 0,05 /min para VEGF165- superexpressando tumores, 0,88 ± 0,1 /min, e 0,66 ± 0,12 /min para tumores que sobre-expressam VEGF189, e 0,19 ± 0,05 /min e 0,06 ± 0,02 /min para xenoenxertos de tumor simulada (Fig. 4C).
K
trans no dia 35 foi significativamente maior nos tumores com superexpressão VEGF189 do que nos outros três tipos (todo o
p Art 0,01 para o aro e
p
0,001 para o núcleo por Fisher
post hoc
teste; a Fig. 4C, superior, médio). O rácio core /borda do
K
trans em tumores com superexpressão VEGF189 no dia 35 foi de 0,73 ± 0,09, que foi significativamente maior do que aqueles no VEGF165- (0,53 ± 0,03) e VEGF121- (0,26 ± 0,08) tumores com superexpressão e nos xenoenxertos de tumor simulada (0,25 ± 0,05;
p Art 0,05,
p Art 0,0001, e
p Art 0,0001, respectivamente, pela
pós
hoc teste de Fisher). Isso indica que o sinal do
K
mapa trans foi distribuído mais profundamente a partir da borda para as regiões centrais dos tumores com superexpressão-VEGF189 (Fig. 4C, inferior).
características estruturais vasculares de angiogénese de tumor avaliados pelo rVDI e RVSI em SSCE-RM
Figura 5A e B mostram mapas representativos de rVDI RVSI e, respectivamente, em tumores que sobre-expressam VEGF simulados e diferentes no dia 36. o rVDI mapa mostra apenas alguns sinais de densidade de vasos espalhados no aro tumor em um tumor mock-transfectadas. O tumor que sobre-expressam VEGF189 mostra uma alta densidade de microvasos a partir do aro distribuídos ao núcleo do tumor. Em contraste, o tumor VEGF121 que sobre-expressam apresenta uma baixa densidade de microvasos que se limita ao aro, e o tumor VEGF165 que sobre-expressam tem uma baixa densidade e alta mista de microvasos que são distribuídas principalmente na borda, com um pouco de no núcleo ( A Fig. 5A). Como mostrado no painel superior da Fig. 5C, o rVDI de todo o tumor foi maior nos tumores com superexpressão VEGF189 (0,26 ± 0,03 /s
1/3), intermediário em tumores com superexpressão VEGF165 (0,17 ± 0,01 /s
1/3) e menor in-VEGF121 superexpressão (0,11 ± 0,01 /s
1/3) e mock-transfectadas (0,07 ± 0,02 /s
1/3) tumores (todos os
p Art 0,01 por Fisher
post hoc
teste). Em ambos o aro e core, tumores com superexpressão VEGF189 apresentaram os maiores valores rVDI entre todos os tumores VEGF-isoforma-superexpressão e falsamente infectadas (Fig. 5C, médio e painéis inferiores).
In vivo
rVDI e RVSI mapas e curvas quantitativos para xenotransplantes tumorais de células cancerosas CL1-0 superexpressam uma das três isoformas de VEGF, avaliados por SSCE-MRI. mapas representativos de alta resolução da (A) rVDI e (B) RVSI nos diferentes tumores VEGF-superexpressão e simulados no dia 36 após a implantação do tumor. Em rVDI mapa, a cor variou de azul (0 S
-1/3, menor rVDI) para vermelho (0,4 S
-1/3, maior rVDI). Em RVSI mapa, a cor variou de azul (0, menor RVSI) para vermelho (30, maior RVSI) análise .Quantitative de (C) rVDI e (D) RVSI em todo o tumor (superior), borda de tumor (média), ou núcleo do tumor (inferior). As diferenças entre tumores com superexpressão de VEGF e tumores simulados foram significativos a *
p Art 0,05, **
p Art 0,01, ***
p Art 0,001, e ****
p
. 0,0001 níveis
o mapa RVSI mostra alguns sinais no aro tumor no tumor simulada. O mapa RVSI também indica que os microvasos tumorais foram quase todos os grandes vasos nos tumores com superexpressão VEGF121 (no aro), misturado grandes e pequenas nos tumores com superexpressão VEGF165 (principalmente na borda com alguns no núcleo), e quase todos os pequenos nos tumores que sobre-expressam VEGF189 (a partir da borda para o núcleo; a Fig. 5B).
Como se mostra no painel superior da Fig. 5D, o RVSI de todo o tumor foi maior nos tumores com superexpressão VEGF121 (37,24 ± 4,88), intermediário nos tumores com superexpressão VEGF165 (28,84 ± 1,46) e menor no-VEGF189 superexpressão (18,82 ± 2,27) e simulada ( 9,84 ± 2,25) tumores (todos os
p
0,05 por
post hoc
teste de Fisher). Em ambos o aro e núcleo, o tumor VEGF189-superexpressão teve a menor RVSI entre os tumores VEGF-superexpressão-isoformas (Fig. 5D, médio e painéis inferiores).
fenótipo angiogênese de tumores com superexpressão diferentes isoformas de VEGF por coloração imuno-histoquímica
e com baixa potência (Fig. 6A, × 100), a coloração imuno-histoquímica revelou um pequeno número de microvasos distribuídos na periferia dos ninhos tumorais dos tumores simulados, e microvasos de tumor mais densas distribuídas principalmente na periferia dos ninhos de tumor ou o tumor em VEGF121- e tumores que sobre-expressam VEGF165. Nos tumores que sobre-expressam VEGF189, microvasos muito densas foram observadas tanto no rebordo e no núcleo.
A angiogénese fenótipos de microvasos avaliados por coloração imuno-histoquímica de xenoenxertos de tumores que sobre-expressam diferentes isoformas de VEGF. (A) coloração imuno-histoquímica de microvasos tumorais (cor marrom, × 100 no painel principal, × 400 na inserção) em xenoenxertos tumorais. (B) A densidade de microvasos foi maior nos tumores com superexpressão VEGF189, intermediário nos tumores com superexpressão VEGF165, e menor nos tumores com superexpressão VEGF121. (C) O número de navios com um diâmetro maior que 15 mm por seção tumor no xenotransplante tumoral foi maior nos tumores com superexpressão VEGF121, intermediário nos tumores com superexpressão VEGF165, e menor nos tumores com superexpressão VEGF189. As diferenças entre os tumores VEGF-superexpressão e simulados foram significativos a *
p Art 0,05, **
p Art 0,01, ***
p Art 0,001 e ****
p
. 0,0001 níveis
em alta potência (Fig. 6A, × 400, insert), tumores com superexpressão VEGF121 tinha mais grandes microvasos com lúmens dilatadas para além dos microvasos pequeno lúmen, e tumores que sobre-expressam VEGF165 tinha microvasos de tamanho intermediário. Em contraste, o VEGF189 em que sobre-expressam e os tumores transfectadas por simulação, quase todos os microvasos tinha um pequeno lúmen.
MVD e grande número de microvasos em xenoenxertos de tumor na coloração imuno-histoquímica
Como mostrado na Fig. 6B, o MVD medido a partir de coloração imuno-histoquímica de CD31 foi maior em tumores com superexpressão VEGF189 (100,00 ± 13,30 /mm
2), intermediário em tumores com superexpressão VEGF165 (70,66 ± 6,84 /mm
2), e menor na -VEGF121 superexpressão (40,07 ± 10,15 /mm
2) e mock-transfectadas (29,98 ± 4,24 /mm
2) tumores (todos os
p Art 0,05 por Fisher do
post hoc
teste).
Como se mostra na Fig. 6C, o número de navios com um diâmetro maior que 15 mm por seção tumor no xenotransplante tumoral foi maior em tumores com superexpressão VEGF121 (13,21 ± 0,95 /mm
2), intermediário em tumores com superexpressão VEGF165 (8,58 ± 1,11 /mm
2), e menor na VEGF189-superexpressão (5,58 ± 0,76 /mm
2) e mock-transfectadas (3,21 ± 0,47 /mm
2) tumores (todo o
p
0,05 por
post hoc
teste de Fisher)
Discussão
Ainda há muito a ser elucidado sobre alterações vasculares associadas ao tumor.; portanto, a coleta de dados mais completos sobre as mudanças na estrutura microvascular angiogênico e função pode facilitar a compreensão dos mecanismos subjacentes a angiogênese do tumor e, assim, proporcionar implicações terapêuticas. O
K
trans, parâmetros rVDI e RVSI obtidos por DCE- e SSCE-MRI são capazes de fornecer dados sobre a perfusão vascular e permeabilidade, densidade de vasos, e do tamanho do vaso, respectivamente. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que usaram ressonância magnética com contraste para avaliar as características funcionais e estruturais de microvasos tumorais induzidas por diferentes isoformas de VEGF
in vivo
, e têm correlacionado o funcional e características estruturais de angiogênese em tumores VEGF-superexpressão-isoformas.
diferentes isoformas de VEGF supostamente apresentam diferentes propriedades bioquímicas. VEGF121 é uma proteína ácida mais curto, não vinculativo de heparina e é livremente difusível, enquanto VEGF165 e VEGF189 pode ligar heparina e proteoglicanos heparan sulfato (HSPGs) [13]. VEGF189 é frequentemente associada com a superfície da célula e a matriz extracelular, enquanto que VEGF165 é tanto uma proteína secretada e é PGHS-associada [13]. VEGF165 e VEGF189 cada possuem afinidades diferentes para os diferentes co-receptores, tais como neuropilina-1 e a neuropilina-2, e para HSPGs, tais como sindecam [14]. Estudos recentes têm mostrado que diferentes isoformas de VEGF pode induzir angiogénese tumor apresentando características morfológicas diferentes [31] – [34]. VEGF121- e microvasos de tumor induzida por VEGF165 foram associados com a vasodilatação, erupção de microvasos, e hemorragia [32]. Em contraste, VEGF189 pode induzir angiogénese tumoral intensa que consiste em pequenos, microvasos recém formados [31], [33]. Neste estudo, os dados do SSCE-MRI eram consistentes com esses achados morfológicos. Nós também demonstrado que diferentes isoformas de VEGF pode induzir microvasos com funções diferentes
In vivo
vasculares, e que a angiogénese induzida por VEGF189 em cancros do pulmão é caracterizada por as maiores características de perfusão e permeabilidade. Estes resultados sugerem que o VEGF189 pode induzir as menores microvasos de tumor germinação mais densas e que têm as mais elevadas características de perfusão e de permeabilidade entre os três tumores que sobre-expressam o VEGF-isoformas-examinados.
Os mecanismos moleculares e biológicas precisas subjacentes aos diferentes características morfológicas e funcionais da angiogênese do tumor induzidas por diferentes isoformas de VEGF permanecem obscuros; mais estudos são necessários para esclarecer este assunto. Algumas investigações recentes forneceram explicações possíveis para essas diferenças. Ruhrberg
et al.
Mostrou que no
VEGF
188/188
cérebro do rato, houve um aumento nas extensões filopódios endoteliais, o que pode levar a um aumento vascular ramificação e brotando angiogênese [ ,,,0],35]. Em contraste, VEGF121 foi demonstrado que falta a capacidade para induzir a germinação angiogénese [35], mas apenas coopts vasos preexistentes, peritumoral e induz vasodilatação. Nossos dados de MRI fornecem evidências sólidas das diferenças comportamentais biológicas de células endoteliais estimuladas por diferentes isoformas de VEGF
in vivo
na angiogénese tumoral. Existe também evidência de que a sinalização molecular difere entre estas isoformas. VEGF165 e VEGF189 pode ligar-se a co-receptores de VEGF, tais como neuropilina-1 e HSPGs, e estas ligações podem modificar a sinalização de VEGF em células endoteliais, controlando a biodisponibilidade do VEGF aos receptores de VEGF [36] – [38]. As actividades de VEGF189 em translocação nuclear [34] e a interferência das vias de sinalização de VEGF com integrinas [39] também pode afectar as funções biológicas de diferentes isoformas de VEGF, em angiogénese tumoral. A célula diferencial funções biológicas e transduções sinais moleculares também traduzir para os diferentes
in vivo
morfológico e características funcionais de angiogênese do tumor induzidas por diferentes isoformas de VEGF em cancros humanos.
K
mapeamento trans revelou que o
K
trans dos microvasos foram maiores nos tumores com superexpressão VEGF189. A alta
K
trans valor de tumores que sobre-expressam VEGF189 pode ser atribuída à maior densidade de microvasos que penetram profundamente a partir do aro do núcleo do tumor, o que pode proporcionar uma função de perfusão vascular elevada. Estudos anteriores mostraram que o VEGF189 pode aumentar a permeabilidade vascular dos vasos da pele e vasos intratumorais em proliferação, tal como avaliado por ensaio de Miles permeabilidade vascular e coloração com Ig G [13], [31]. Nossos dados são consistentes com estes resultados, e sugerem que o aumento da permeabilidade pode contribuir para o mais alto
K
valor trans observado em tumores com superexpressão VEGF189. Além disso, o nosso relatório anterior demonstrou que o fluxo de sangue (Fρ), permeabilidade microvascular (PSρ) e o volume de sangue (Vb) determinado por DCE-MRI foram todos significativamente aumentados em tumores que sobre-expressam o VEGF 189 a isoforma [40]. Tozer
et al.
Recentemente mostrou que VEGF188 mouse pode induzir microvasos estreitas com o maior comprimento de microvasos, resistência à hemorragia e resistência à terapia agente antiangiogenesis, mas está associada com vencimento vascular tumor [34]. Isto pode surgir a partir de diferentes linhas celulares para ser utilizado para sobre-expressar a isoforma de VEGF (linha de células de fibrossarcoma vs linha celular de adenocarcinoma do pulmão), método diferente de experiência e modelo diferente utilizado. No entanto, ambos os estudos demonstraram os diferentes isoformas VEGF tem função diferente e isso pode determinar as características diferentes de microvasos em tumores em diferentes órgãos. Embora os tumores com superexpressão-VEGF121 têm diâmetros microvasos maiores, como mostrado pela alta RVSI, o
K
valor correspondente trans é baixa. Isso pode indicar que
K
trans é dependente principalmente na rVDI ao invés do RVSI. A relação precisa entre
K
trans e RVSI ou rVDI pode ser difícil de determinar devido à complicada fisiologia microambiental tumor com expressão excessiva de diferentes isoformas de VEGF. No entanto,
K
trans tem sido mostrado previamente para ser associada com a densidade de vasos. Os dados anteriores mostraram também que a estase do sangue irá ocorrer nos espaços vasculares dilatados e tortuosos.
Como VEGF121 é um menor, não-ligação à heparina proteína ácida que é livremente difusivel, eles vão ser segregado a partir de células de o ambiente exterior, uma vez que são sintetizados. A quantidade de proteína VEGF121 permaneceram na célula é suposto ser mais baixo, em comparação com outras isoformas de VEGF, que têm maior proporção de proteínas de VEGF nas células restantes. Portanto, a densidade da banda de proteína VEGF121 em Western blot obtida a partir de lisados de células de células cancerosas CL1-0 não pode estar para a quantidade total de proteínas sintetizadas VEGF121 ou a quantidade que são secretadas para o meio ambiente. Temos quantificada a quantidade de isoformas de VEGF que são secretadas para fora da célula para o sobrenadante por ELISA, e os resultados mostraram que a quantidade de proteína no sobrenadante VEGF121 foi semelhante à quantidade dos outros dois isoformas de VEGF. Além disso, nós quantificada ainda mais o nível de expressão de VEGF
In vivo
nos implantes de tumores ressecados a partir de ratinhos SCID utilizando em tempo real quantitativa de RT-PCR, e o resultado mostrou o nível de expressão de VEGF isoforma foi semelhante entre os tumores de linhas celulares de cancro de pulmão CL1-0 que sobre-expressam um dos três isoformas de VEGF (p = 0,953, ANOVA de um factor) (Fig. 1B). Por conseguinte, as diferenças no crescimento tumoral e propriedades angiogénicas entre isoformas de VEGF neste estudo são por causa da função de diferentes isoformas de VEGF, em vez de resultar da diferente nível de expressão do VEGF entre diferentes isoformas de VEGF em tumores.
o nosso estudo, a angiogénese induzida por VEGF189 teve a maior MVD, penetrou profundamente a partir do aro do tumor para o núcleo do tumor, e tinham as maiores funções de perfusão e permeabilidade entre os três tipos de tumor que sobre-expressam o VEGF-isoformas diferentes. No entanto, o tamanho do tumor não diferiram significativamente entre VEGF165- e tumores overepxressing VEGF189. Observou-se a viabilidade dos tumores usando imuno-histoquímica e hematoxilina-eosina, e verificou-se que a necrose central é maior para tumores que sobre-expressam VEGF165 do que para tumores que sobre-expressam VEGF189. Isto indica que apesar de ter volumes de tumor totais semelhantes, a parte viável do tumor é maior do que em VEGF189- em tumores que sobre-expressam VEGF165. Isto também implica que microvasos induzida por VEGF189 funcionar melhor do que microvasos induzida por VEGF165 na manutenção da viabilidade dos tumores.
Clinicamente, uma associação foi encontrada entre a expressão de diferentes isoformas de VEGF em tumores humanos e diferentes características clinicopatológicas e evolução de pacientes. Tokunaga
et ai.
[14], [41] demonstraram que, em doentes com cancro do cólon, tumores com expressão de ARNm de VEGF189 têm uma maior incidência de metástases no fígado, maior envolvimento das veias, e estão associados a um paciente mais pobre prognóstico do que aqueles que não possuem a expressão do mRNA VEGF189. Em nosso próprio estudo [15] e outros [14] – [16], [41], [42], uma expressão elevada do tumor de VEGF189 foi significativamente correlacionada com tumores grandes, estádio clínico avançado, e metástase sistêmica, e foi um independente factor de prognóstico no colo-rectal, das células renais, e cancros do pulmão de não-pequenas células. Além disso, Tokunaga
et ai.
[17] mostraram que a expressão VEGF189 está associada com o aumento da xenotransplantability de cancro do esófago humano na pele de ratinhos. No presente estudo, a DCE-MRI revelou uma alta função perfusão e permeabilidade dos microvasos de tumor, e SSCE-MRI revelou uma muito elevada densidade de microvasos pequenas que penetram a partir do bordo do tumor para o núcleo em tumores que sobre-expressam VEGF189. Estas características de angiogénese de tumores pode fornecer um bom suprimento de nutrientes e O
2 para o crescimento tumoral, e as altamente permeáveis, microvasos densas podem facilitar a metástase de células de cancro. Estas características funcionais e estruturais específicos de angiogénese tumoral induzida por VEGF189 pode contribuir para o aumento da tumorigénese relatado, alta incidência de metástases sistémico, e o prognóstico desfavorável de pacientes e a alta xenotransplantability de cancros humanos que sobre-expressam VEGF189 [14] – [17], [ ,,,0],41], [42].
um método tradicional usada para avaliar a angiogénese do tumor é uma técnica chamada histológica MVD contagem em secções de espécimes tumorais.