Abstract

O desenvolvimento de um suprimento de sangue independente por um tumor é essencial para manter o crescimento além de um certo tamanho limitado e para fornecer um portal para disseminação metastática. células derivadas de hospedeiras endoteliais (ECS) que residem dentro e comprometendo a vasculatura do tumor originam através de processos distintos conhecidos como brotando angiogênese e vasculogênese. Mais recentemente ECs proveniente directamente das próprias células tumorais têm sido descritos, embora a base para este fenómeno permanece pouco compreendido. Aqui nós descrevemos

in vitro

condições que permitem às células de cancro do ovário pulmão e se submeter a uma transição rápida e eficiente em ECs que são indistinguíveis daqueles obtidos

in vivo

. Uma variedade de métodos foram utilizados para estabelecer que os fenótipos adquiridos e comportamentos destes ECs derivadas de tumor (TDECs) se assemelham aos da autêntica ECs. Xenotransplantes decorrentes da

células in vitro

-derived TDECs e tumorais co-inoculado também foram mais altamente vascularizada do que os tumores de controlo; Além disso, seus vasos sanguíneos eram, em média, maiores e frequentemente continham misturas de ECs e TDECs derivados do hospedeiro derivados do inóculo inicial. Estes resultados demonstram que as células cancerosas podem ser manipulados sob bem definida

in vitro

condições para iniciar uma transição tumor de células-to-CE, que é em grande parte de células-autônoma, altamente eficiente e estreitamente imita o

in vivo

processo. Estes estudos fornecem um meio adequado pelo qual a identificação e talvez modificar os primeiros passos na geração de TDEC

Citation:. Elster JD, McGuire TF, Lu J, Prochownik EV (2013) Rápido

In Vitro

Derivação do endotélio Diretamente a partir de células cancerosas humanas. PLoS ONE 8 (10): e77675. doi: 10.1371 /journal.pone.0077675

editor: Ken Arai, Massachusetts General Hospital /Harvard Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de maio de 2013; Aceito: 11 de setembro de 2013; Publicação: 09 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Elster et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo NIH RO1 concessão CA140624 a EVP e pela concessão bolsa de pós-doutoramento de um St. Baldrick para J.D.E. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Em seus estágios iniciais, um tumor incipiente cumpre o seu metabólica necessidades através de simples difusão de nutrientes e resíduos de produtos [1-3]. Ao atingir uma determinada massa crítica, no entanto, a difusão deixa de ser suficiente para esta finalidade e mais em crescimento requer o desenvolvimento de uma vasculatura independente [3,4]. Sem isso, a dormência tumor segue e pode persistir por anos durante os quais a proliferação de células tumorais adicionais tempo é equilibrada pela morte apoptótica ou necrótica [5,6]. A indução de um “interruptor angiogênico”, em que um suprimento vascular não é mais limitante da velocidade, é agora reconhecido como um factor decisivo para o crescimento de um tumor subsequente, a sua comunicação com a circulação sistêmica, e sua disseminação metastática [3,4]. Consistente com estes resultados, a densidade vascular é um factor de prognóstico bem reconhecida em muitos tipos de cancro, incluindo cancro da mama, neuroblastoma, e astrocitoma /glioblastoma [7-10].

O interruptor angiogénico é um processo complexo que envolve a elaboração pelo tumor avascular de citocinas e factores de crescimento incluindo o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), factor de crescimento de fibroblastos (bFGF), factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crescimento transformante beta (TGF-β), e uma variedade de angiopoietinas [1,11-13]. Alguns destes são quimio-atractores que mobilizar ambas as células endoteliais maduras e progenitoras (ECS) a partir da medula óssea e dirigem a sua maturação e organização em vasos sanguíneos ( “vasculogénese”), enquanto outros induzir o endotélio dos vasos sanguíneos adjacentes a proliferar e invadem o tumor ( “brotando angiogênese”) [14-16].

A origem extra-tumoral da neovasculatura implica que as suas células componentes são ambos geneticamente normais e estável e, portanto, em grande parte imune ao desenvolvimento da resistência quimioterapêutica que normalmente surge dentro da população de células tumorais genomicamente instável. De facto, as terapias anti-angiogénese são parcialmente baseada na suposição de que a vasculatura tumoral retém a estabilidade genómica da sua população de células precursoras [17,18]. Bevacizumab, o primeiro inibidor de angiogénese clinicamente útil, é um anticorpo monoclonal anti-VEGF humanizado (mAb) que se mostrou promissor cedo no tratamento de uma variedade de cancros avançados [19-22]. No entanto, praticamente todas as respostas são incompletas e /ou transitória como tumores, eventualmente, re-vascularização e ficar sem resposta para continuar o tratamento com o mAb. Como resultado, a sobrevivência global paciente foi melhorado apenas moderadamente, se de todo [19-23].

Recentemente, nós e outros fornecida uma potencial explicação para as respostas incompletas para agentes anti-angiogénese, mostrando que uma sub-população significativa das células endoteliais associadas ao tumor derivam directamente das próprias células do tumor [24-28]. Estes “tumor derivado ECs” (TDECs) expressar uma variedade de marcadores da CE, para baixo-regular marcadores epiteliais e formam vasos funcionais

in vivo

onde se misturar com ECs extra-tumoralmente derivado. Porque contêm os mesmos cromossomas marcadores como a população de células tumorais, sugere-se que, como as próprias células tumorais, foram TDECs genomicamente instável [24-28]. Consistente com esta ideia, a passagem de série do TDECs leva ao eventual surgimento de populações clonal derivados que expressam progressivamente fenótipos CE mais robustos e são geneticamente relacionados, mas distinto de ambas as células tumorais e TDECs cedo-passagem [24]. TDEC de ter sido identificada num modelo murino de glioblastoma [27] e em xenoenxertos de glioblastoma humano [26,28]. Mais cedo, mas estudos inconclusivos também havia sugerido a presença de TDECs em outros tumores humanos primários [29-31]. Estes resultados sugerem que a produção de TDEC é um difundido, se não universal, fenómeno e que a resistência a terapias anti-angiogénicas podem surgir como um resultado da instabilidade genómica TDEC inerente.

A constatação de que TDECs constituem uma população funcionalmente significativa e distinta CE levanta uma série de questões que são difíceis ou impossíveis de resolver por estudar tumores primários ou xenotransplantes tumorais. Estes incluem a natureza e a importância relativa de sinais que dão início a célula tumoral para TDEC transição, o período de tempo ao longo do qual isto ocorre, se o desenvolvimento e a manutenção de células são TDEC autónoma e se todas as células dentro de um tumor são capazes de gerar TDECs. Descrevemos aqui o desenvolvimento de um

in vitro

sistema que nos permite abordar estas questões. Usando condições que favorecem o crescimento das células endoteliais e imitam a hipóxica e microambiente tumoral privados de nutrientes, que mostram que um fenótipo CE robusto pode ser prontamente gerado a partir de células tumorais e que a indução óptima exige a cooperação sinérgica destes factores. As propriedades do

em

derivado TDECs vitro- são praticamente indistinguíveis dos isolados directamente a partir de tumores. Além disso, a sua co-inoculação com células tumorais leva ao desenvolvimento de xenoenxertos de tumores com uma vasculatura mais denso e, em alguns casos, uma taxa de crescimento mais rápido. Estes estudos, assim, proporcionar um meio simples e quantitativos pelo qual TDEC ontogenia podem ser estudadas e manipuladas desde o seu início sob condições definidas.

Resultados

expressão de marcadores da CE em células tumorais humanas sob definido

in vitro

condições

inicialmente procurou-se identificar condições que promovam uma célula tumoral para a transição TDEC

in vitro

. Para estes estudos, utilizou-se o H460 humano e cancro CaLu1 pulmão de não pequenas células, do cancro da próstata PC3 e as linhas celulares de cancro do ovário OVCAR3. Na escolha de condições de cultura, a hipótese de que uma combinação de EC-específica meio de crescimento e hipóxia moderada, talvez juntamente com o esgotamento de certos nutrientes, poderia recapitular a

in vivo

ambiente que fornece o sinal (s) para TDEC iniciação. As células de tumor foram cultivadas em, por conseguinte, quer específicos do CE meio EGM-2 + normoxia (condição 1), meio de crescimento padrão + hipoxia (condição 2) ou uma combinação de meio EGM-2 + hipoxia (condição 3). Para células OVCAR3, também foi utilizado meio suplementado com Glutamax CE factores específicos idênticos àqueles em meio EGM2 mas privado de asparagina, ácido aspártico, glutamina e prolina + hipoxia (Condição 4) ou do mesmo meio + normoxia (Condição 5). Referimo-nos a este conjunto de condições coletivamente como “EC-promoção”. As células tumorais mantidos em seu padrão recomendado meio de crescimento sob condições de normóxia serviu como iniciar controles de ponto. Os lisados ​​celulares foram preparados a partir destas amostras e analisados ​​por imunotransf erência para a expressão do factor de von Willebrand (vWF), o qual é induzido com fiabilidade durante a célula tumoral para TDEC transição

In vivo

[24,25]. Como mostrado na Figura S1, a maioria das linhas celulares de tumor crescidas em condições padrão mostrou pouca ou nenhuma expressão do vWF. Em contraste, o vWF foi induzida em vários graus, sob diferentes condições de CE-promovendo com os mais altos e sustentados níveis geralmente ser observados sob condições de 3. Embora o tempo para atingir indução máxima variou entre as linhas testadas e, por vezes, foi transitória, foi geralmente máximo d entre 5/3 e não aumentando subsequentemente.

Tendo estabelecido condições sob as quais a conseguir a expressão máxima do vWF em cada linha celular, que analisa expandido nosso inicial para incluir marcadores específicos adicionais-CE utilizando ensaios baseados na imuno-fluorescência, tal como descrito anteriormente [24,25]. Para estes estudos, que se concentrou em células H460 e OVCAR3 cultivadas durante 5 d em condições 3 e 4, respectivamente. As proteínas específicas do CE novamente analisados ​​incluídos vWF bem como a VEGFR1, VEGFR2, VE-caderina e a molécula de adesão CE-selectivo (ESAM). Além disso, a ligação de

Ulex Europeus

lectina (lectina de E-), captação de lipoproteínas de baixa densidade acetiladas (AcLDL), e morfologia foram seguidos como indicadores de fenótipos CE mais complexas. Citoqueratina 7 (CK7) e 19 (CK19) também foram examinados como marcadores para o fenótipo epitelial. Como mostrado na Figura 1, todos os marcadores CE foram induzidos em ambas as linhas celulares enquanto que ambas as citoqueratinas eram acentuadamente regulada para baixo. Estas alterações envolvido tanto a percentagem de células que coraram para os marcadores, bem como a intensidade da coloração de células positivas. Assim, os padrões de expressão de todos os marcadores imitou estreitamente aos observados com TDECs derivados de xenoenxertos de tumor reais [24,25].

(

Um

) H460 células foram cultivadas durante 5 d sob condição 3 . (

B

) células OVCAR3 foram cultivadas durante 5 d sob condição 4. coloração de anticorpos para os marcadores específicos-CE vWF, VEGFR1, VEGFR2, VE-cadhherin, ESAM, a ligação da e-lectina e absorção de acetilação AcLDL foram realizadas em ambos os conjuntos de células como descrito anteriormente [24,25]. coloração marcador epitelial foi realizada para CK7 e CK19. Contracoloração foi realizada com DAPI para visualizar núcleos. as imagens de campo claro de células tumorais e TDECs também estão incluídos. As imagens foram obtidas em cada 40-60X ampliação (confocal) ou aumento de 10x (campo claro). Números no canto superior direito de cada painel indicam a percentagem de cada população que demonstrou qualquer evidência de coloração, independentemente da sua intensidade. Resultados semelhantes foram obtidos em pelo menos três experiências independentes. Barra de escala = 25 um.

Análise funcional de

in vitro

-derived TDECs

Para comparar ainda mais os fenótipos da CE da

em vitro-

TDECs derivado com os de xenoenxertos de tumor reais, examinámos as células anteriores quanto à sua capacidade para formar estruturas semelhantes a tubos em meio semi-sólido. Para estes estudos, H460 células foram cultivadas sob condições de crescimento padrão (controlo) ou sob condições de 1-3 5 d, altura em que foram semeadas em meio semi-sólido e cultivados sob normoxia durante 5 dias adicionais. Sob ambas as condições padrão e CE-promovem 1 ou 2, H460 células persistiram como células individuais ou formado ácinos amorfa, enquanto que a cultura sob condições 3 grandemente aumentada a formação do tubo (Figura 2A). A quantificação desta mostrou a formação de tubos por células H460 ser aumentado em 10 a 50 vezes sobre a observada sob condições 1 ou 2 e em cerca de 25 vezes em relação a de condições normais (Figura 2B). Embora os números de tubos formado e sua qualidade foram inferiores àqueles provenientes de veia umbilical humana ECs (HUVECs) (Figura 2C), eram indistinguíveis dos tubos formados por

in vivo

-derived TDECs [24,25 ]. Estas observações indicam que o derivado TDECs-H460 poderia formar tubos em condições de normóxia sob as quais o ensaio de formação de tubo foi conduzido e sugeriu que o fenótipo TDEC pode ser estável. Para testar isto, células H460, primeiro expostas a condição 3, foram plaqueadas directamente em meio semi-vendido como descrito para a Figura 2A ou foram mantidos sob condições padrão para um adicional de 7 d antes do plaqueamento em um ensaio de formação de tubo. Surpreendentemente, de acordo com este último esquema, a capacidade de formação de tubo de TDECs foi mantida, mas não só os tubos resultantes mais intimamente se assemelhavam aos formado por células HUVEC (Figura 2C). Assim, enquanto TDEC potencial de formação de tubo foi mostrado para exigir hipóxia, foi mantido por pelo menos 2 semanas após o regresso a condições de crescimento padrão. (

A

) foram induzidos

células tumorais H460 para formar TDECs por 5 d de exposição às condições indicadas. 2 x 10

4 células de cada grupo foram então plaqueadas em Matrigel em um ensaio de formao de tubo, sob condições de normóxia durante 5 d, como previamente descrito [24,25]. células não tratadas H460 cultivadas sob condições normais serviram como controlos. campos microscópicos de luz típicas estão mostradas. Todas as fotos são mostradas em ampliações idênticas. (

B

) Os resultados apresentados na (

Um

) são representados graficamente como a média do número de tubos completamente fechados por campo ± SEM. os valores de p foram obtidos utilizando ANOVA de uma via (**: p 0,01). (

C

) células tumorais H460 foram cultivadas sob condições padrão ou condição 3 para os tempos indicados. Metade das células foram logo em seguida plaqueadas em Matrigel e cultivadas sob condições de normóxia durante 6 d adicional. O restante das células foram devolvidos às condições padrão durante 7 d antes de serem plaqueadas em Matrigel por 6 d para avaliar a persistência do potencial de formação de tubo. As HUVECs foram usadas como controlo positivo para a formação do tubo. fotografias de campo claro foram tiradas a 10X de ampliação. Resultados semelhantes foram obtidos em quatro experiências independentes (A) e duas experiências independentes (C). Barra de escala = 100 um.

Um ensaio baseado em biosenser para monitorar

in vitro

TDEC indução

Para confirmar e quantificar melhor o

in vitro

tumor transição cellTDEC, geramos populações distintas de células H460 e OVCAR3 que expressam de forma estável a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) sob o controlo do promotor do receptor específico angiopoietina-CE (Tie2) [32]. Em condições de crescimento normais, estas células expressaram EGFP pouco, mesmo quando avaliada por citometria de fluxo (Figura 3). Após a indução de TDEC sob condição para 3 e células H460 condição para 4 células OVCAR3, aumentos de 3-5 vezes no sinal de EGFP foram rotineiramente observado (Figura 3). Assim, a indução de Tie2-EGFP serve como um substituto do ensaio simples, reprodutível e quantificável de diferenciação TDEC que, em células vivas, espelhos com precisão os resultados obtidos por outros ensaios padrão de fenótipo CE. Ele também fornece evidência directa para a transcrição a regulação positiva de, pelo menos, alguns dos marcadores no decurso da diferenciação TDEC e ajuda a comprovar a coordenar-se-regulação ao longo de um intervalo de tempo de 4-5 dias (Figura S2).

culturas separadas de células de tumor H460 e OVCAR3 foram estavelmente cotransfectadas com Tie2-EGFP plasmídeo pFR400 e que codifica uma forma mutante da di-hidrofolato reductase [36,37] e seleccionada em G-418 e concentrações crescentes de metotrexato para permitir a amplificação dos dois vectores integrados em tandem e um aumento de intensidade de sinal de EGFP correspondente. As células foram expostas a condições indicadas anteriormente para induzir o fenótipo TDEC máxima (isto é, a condição para 3 e H460 da condição 4 para OVCAR3) e em comparação com células de controlo cultivadas sob condições padrão. (

A

) micrografias de fluorescência de cada linha de células após cinco dias de crescimento em cada conjunto de condições. (

B

) citometria de fluxo e as mesmas células. Os resultados representativos de pelo menos três experiências independentes estão representados. Barra de escala = 25 um.

Os resultados anteriores, em conjunto com os representados na Figura 2, sugerem que a maioria das células tumorais exibir plasticidade suficiente para permitir a sua

In vitro transição para

TDECs. Para testar isto directamente, foi examinada 80 clones de células únicas derivadas de células H460 e OVCAR3 para determinar o grau em que podiam expressar marcadores CE. Como mostrado na Tabela 1, praticamente todos os clones mostrou absorção de alto nível de AcLDL, a ligação de E-lectina e de expressão EGFP-Tie2 conduzido sob condições que promovem a CE-enquanto que a expressão única fraco destes marcadores podem ser detectados em células mantidas em condições padrão. Assim, como previamente sugerido para

em TDECs derivados vivo-

[25], a aquisição do fenótipo CE não se limita a qualquer subconjunto celular particular.

H460

OVCAR -3

% + células (Std Condition /Condição 3)

% + células (Std Condition /Condição 4)

Clone No.

E-lectina

AcLDL

Clone No.

Tie-2-GFP

Clone No.

E-lectina

AcLDL

Clone No.

Tie-2-GFP

1 3/90-95 3/ 9521 3/90-9541 3/80 3/9061 3/ 952 3/90-95 3/ 9522 5/90-9542 3/90 3/9062 3/ 9535/80 3/90-9523 5/ 9543 3/ 95 3/9563 3/ 345/ 95 3/ 9524 3/ 9544 3/ 95 3/9064 3/ 9555/ 95 3/80253-5/ 9545 3/ 95 3/9065 3/ 9565/ 95 3/90-9526 3/ 9546 3/90 3/9566 3/ 9575/90-95 3/ 9527 3/ 347 3/80 3/9567 3/ 9585/ 955/90-9528 3/ 9548 3/90 3/9068 3/ 395/ 955/ 9529 3/90-9549 3/90 3/9069 3/ 95105/80-855/ 9530 3/ 9550 3/50 3/9070 3/ 31110/ 955/90-9531 3/ 9551 3/ 95 3/9571 3/ 9512 3/ 95 3/ 9532 3/ 352 3/ 3 3/5072 3/ 95135/ 95 3/ 9533 3/ 9553 3/30-40 3/9573 3/ 951410/ 953/ 95345/ 9554 3/30-40 3/8074 3/ 31510/90-95 3/ 9535 3/ 95555/90-95 3/9575 3/ 316 3/90-953/ 9536 3/ 95565/ 95 3/9576 3/ 9517 3/90-95 3/ 9537 3/ 95575/ 95 3/9577 3/ 95185/ 953/ 9538 3/ 3585/90-95 3/9578 3/ 95195/ 95 3/ 9539 3/ 3595/ 95 3/9579 3/ 320 3/ 95 3/90-95405/ 9560 3/ 95 3/9580 3/ 95Table 1. diferenciação endotelial de clones de célula única linha de tumor humano.

triagem celular foi usado para propagar células OVCAR3 H460 individual e em placas de 96 poços. 20 clones derivados de cada tipo de célula foram expandidas e avaliadas sob condições padrão ou CE-promovendo para E-lectina captação de ligação e AcLDL. Um adicional de 20 clones de cada um derivado a partir de células OVCAR3-Tie2-GFP-H460 Tie2-GFP e foram também avaliadas para a expressão de GFP. A percentagem de células positivas para cada um destes marcadores específicos seguintes-CE 5 dias de propagação foram medidos sob condições padrão ou condições 3 ou 4 e os dois valores obtidos são separados pelo “/”. Estes estudos não levam em conta as grandes diferenças de intensidade de marcador que ocorreram na sequência de propagação hipóxica, os quais são ilustrados na Figura S2. CSV Baixar CSV

TDECs incorporar na neovasculatura do tumor, aumentar o crescimento do tumor e aumentar a densidade de vasos

As nossas descobertas anteriores de que

em TDECs derivados vivo-

pode incorporar em que o tumor neo-vascularização e aumentar a densidade de vasos sanguíneos [24,25] sugeriu que

in vitro

-derived TDECs pode se comportar de forma semelhante. células tumorais H460 Para resolver isso, EGFP-tag [25] foram cultivadas sob condição de 3 para 5 d, misturado com um excesso de 20 vezes de

Discosoma

sp.

proteína fluorescente vermelha (DsRed ) tagged H460 células tumorais e propagada como xenoenxertos subcutâneos em ratinhos imunocomprometidos. injecções de controlo foram realizadas de forma idêntica mas com a população de EGFP + cultivadas sob condições padrão. Os tumores que surgem a partir da mistura de células ex cresceu significativamente mais rapidamente do que aqueles a partir da última (Figura 4A). microscopia de fluorescência de secções congeladas também mostrou os vasos sanguíneos dos tumores antigos para ser enriquecido para EGFP + ECs (Figura 4B), indicando uma predileção por

in vitro

-derived TDECs incorporar na vasculatura do tumor. Finalmente, os vasos sanguíneos dos tumores antigos eram tanto mais densa e maiores do que os dos últimos tumores (Figura 4C-4F). Experiências semelhantes realizadas com células OVCAR3 mostrou que os xenotransplantes tumorais resultantes, embora não crescendo significativamente mais rápido do que os seus homólogos de controle, continha maior proporção de EGFP + TDECs luminais e uma vascularização mais densa (Figura S3). Assim, a co-injecção de

em vitro-

derivado TDECs facilita a neovascularização do tumor, o que, em alguns casos, permite o crescimento do tumor acelerada.

células H460 marcado com EGFP foram mantidas durante 5 d sob condição 3. os TDECs resultantes foram então misturadas com um excesso de 20 vezes de células tumorais H460 DsRed-tag cultivadas sob condições padrão e com um total de 10

6 células foram inoculadas subcutaneamente nos flancos de ratinhos nus e propagada como tumoral xenotransplantes. Os tumores de controlo consistiu da mesma mistura de células tumorais DsRed-tag e células tumorais marcadas com EGFP propagadas sob condições padrão. (

A

) Representação gráfica de crescimento do tumor. Os volumes dos tumores foram determinados nos tempos indicados e as médias foram representados graficamente (± EPM). O

valor p

mostrado para o dia 17 volumes de tumor foi calculado utilizando um teste t de Student unilateral. (

B

) imagens de fluorescência confocal de secções congeladas de tumores a partir de cada um dos dois grupos. Barra de escala = 25 um. (

C

) de baixa potência hematoxilina-eosina-coradas secções de tecido embebidas em parafina representativas obtidas a partir de tumores típicas em cada um dos dois grupos. (

D

) representação gráfica do número médio de vasos sanguíneos do tumor por campo (± SEM) nos domínios típicos de cada tipo de tumor. O número total de campos examinados foi de 32 para a condição 3 tumores e 24 para os tumores de condição padrão. Apenas os navios que exibem lumens distintas e contendo células vermelhas do sangue, indicados por

black

setas

, foram contados. (

E

) representação gráfica da área da secção transversal dos vasos sanguíneos média (± SEM) nos dois tipos de tumor. O número total de navios medidos foi de 85 a partir de tumores standard e 248 da condição 3 tumores. (

F

) O número médio de vasos sanguíneos do tumor com áreas transversais (± SEM) que eram pequenos (30-499 hum

2), médio (500-1999 hum

2) , grande (2000-4999 hum

2), e muito grande (≥ 5000 hum

2), medida usando software ImageJ. A análise estatística foi realizada utilizando

t

teste de Student unilateral (*,

p Art 0,01; **,

p Art 0,001; ***,

p Art 0,0001). Resultados semelhantes foram obtidos em dois experimentos independentes.

Discussão

As observações recentes em uma variedade de diferentes tipos de câncer indicaram que a ECs compreendendo o tumor neo-vascularização pode originar directamente a partir do tumor células próprias e co-existir com ECs derivadas de fontes extra-tumoral [24-28]. Muito parecido com seus antecessores de células tumorais, estes TDECs são genomically instável [24]. Isto pode conferir uma vantagem de sobrevivência em face de terapias anti-angiogênese, assim, talvez a contabilização dos efeitos transitórios de esses agentes [19-22]. Com efeito, observou-se que

em

derivado TDECs vitro- tais como os descritos aqui podem ser derivados em meio EGM2 falta de VEGF e assim parecem ser independentes do presente factor de crescimento, mesmo na ausência de selecção prévia. Além disso, os níveis extremamente baixos de transcritos de VEGF que foram detectados em células H460 e OVCAR3 por tempo real qRT-PCR, não foram significativamente alterados após a indução do fenótipo TDEC (não mostrado).

Os nossos resultados indicam que o tumor as células podem ser manipuladas

in vitro

sob condições definidas para gerar TDECs que são bioquimicamente e funcionalmente similares aos provenientes

in vivo

[24,25]. Que praticamente todas as células do tumor pode adquirir EC-como propriedades (Tabela 1), enquanto a perder suas características epiteliais é consistente com a nossa conclusão anterior de que clones de uma única célula derivadas de células tumorais pode gerar TDECs

in vivo

[25]. Assim, a capacidade de geração TDEC parece ser um comum, se não universal, característica que é partilhada pela maioria da população de células tumorais e de células é autónomo. A componente variável da TDECs encontrado em tumores diferentes [25] pode, assim, ser menos indicativo de qualquer capacidade de geração inerente do que de processos concorrentes, como brotando angiogênese e vasculogênese, condições sub-ótimas para indução TDEC ea falta de outras pressões seletivas como a terapêutica prévia intervenções. A propriedade parece estar confinado a populações de células tumorais à medida que não observaram ECs para surgir a partir de células não transformadas, tais como de rim embrionário humano ou primária ou brônquica imortalizadas e células epiteliais da glândula mamaria, quando cultivadas sob condições idênticas às aqui descritas (não mostrados).

a capacidade de gerar TDECs sob

in vitro

condições respostas a várias perguntas definidas que não podem ser facilmente tratadas usando

in vivo

modelos em que o microambiente do tumor é muitas vezes heterogêneo , sujeitas a mudanças rápidas [1,33] e onde a formação TDEC é provável que competir com processos de remodelação vasculares adicionais. Essas questões incluem a natureza e inter-relações dos sinais indutivos para TDECs e sua calendarização. Os candidatos óbvios para essas moléculas de sinalização incluem factores específicos de CE de crescimento tais como VEGF, bFGF e TGF-beta, assim como a hipóxia, os quais são fortes indutores da neovascularização do tumor [3-5,11-14]. Os nossos resultados indicam que, pelo menos,

In vitro

, nem os factores de crescimento fornecidos pela CE-específico meio de crescimento sozinho nem hipóxia são indutores potentes particularmente da célula de tumor a transição TDEC mas que, em combinação, são altamente sinérgica. Isto não é inteiramente inesperado uma vez que estes factores têm sido conhecidos por serem necessários para a geração e manutenção da neovasculatura do tumor provenientes de fontes tradicionais mais [34,35]. Em alguns casos, como exemplificado pelos nossos resultados com células OVCAR3, outros fatores, como a privação de nutrientes seletiva ou acidose pode desempenhar funções de apoio adicionais e ainda precisam ser exploradas mais a fundo. A natureza precisa destes efectores e a sua importância relativa para geração TDEC são susceptíveis de ser bastante dependente de propriedades inerentes de tipos de tumores específicos, as alterações secundárias adquiridos e vários outros factores ambientais concorrentes e cooperantes. É também provável que o tempo de exposição a vários factores indutivos, bem como quando a célula tumoral durante a período de transição TDEC eles são operativas irá desempenhar papéis importantes. Todas estas questões devem ser endereçáveis ​​usando os tipos de ensaios aqui descritos, que permitem o controle eo calendário de potenciais estímulos ambientais precisos.

Os nossos estudos anteriores tinham indicado que tanto a expressão de marcadores específicos-CE eo função do

In vivo

-derived TDECs eram line-dependente de células e este foi confirmada pelos estudos atuais. Talvez o exemplo mais óbvio disso foi ilustrado pelas diferenças entre H460 e OVCAR3 TDECs no que diz respeito à sua capacidade de afetar as taxas de crescimento de xenotransplante tumoral e tamanho do vaso (Figuras 4 e S3). Se isso reflecte as diferenças funcionais intrínsecas de TDECs, os padrões de crescimento das próprias células tumorais, as interacções do estroma ou uma combinação destes factores é actualmente desconhecido. evidência definitiva para tais relações causa-efeito aguarda confirmação futuro.

A capacidade de recapitular a célula tumoral à transição TDEC de forma eficiente, rapidamente e sob as avaliações mais completas bem definidos e facilmente alteráveis ​​condições deve agora permitem dos papéis precisos desempenhado por fatores indutivos individuais para facilitar este processo, bem como a sua importância relativa. A facilidade com que podem ser gerados TDECs também sugere que podem servir como reagentes valiosos para ser utilizado na identificação de novos agentes que impedem este processo.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Todos os estudos com ratos foram conduzidos de acordo com animal Welfare Act e da política de Serviço de Saúde Pública e aprovado pela Universidade de animal Care Institucional de Pittsburgh e Use Committee (IACUC) (número de autorização: 0.812.276). Os animais foram alojados em unidades isentos de agentes patogénicos no Hospital Infantil de Pittsburgh, em conformidade com os regulamentos IACUC.

Animais

Idade e nu /nu foram adquiridos de Harlan Sprague-Dawley Laboratories pareados por sexo ( Indianapolis, IN). Foram realizados estudos de tumor xenoenxerto como descrito anteriormente [24,25].

In vitro

indução de TDECs e xenotransplante tumoral crescimento

carcinoma de pulmão humano NCI-H460 (H460) , Calu-1 de carcinoma humano do pulmão, o cancro da próstata PC3, e linhas celulares de cancro do ovário OVCAR3 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e foram mantidos sob condições de normóxia “padrão”, tal como anteriormente descrito [24,25]. Os meios de cultura incluído alfa Meio Mínimo Essencial ( “MEM”) para H460 e PC3 e meio de McCoy 5A para Calu-1 e OVCAR3, ambos suplementados com 10% de soro fetal bovino, glutamina 2 mM, 110 ug /piruvato ml, mínimo e não-essencial aminoácidos, 100 ug /ml de estreptomicina e 100 unidades /ml de penicilina G). As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e meio de crescimento específico CE-EGM-2 foram adquiridos à Cambrex Bio Science (Walkerville, MD). Todas as linhas celulares foram mantidas em 5% de CO

2 atmosfera a 37 ° C. Para a maioria das linhas de tumor, a indução de um fenótipo CE foi conseguida através da cultura de células sob uma variedade de condições. Estes incluíram meio EGM-2 sob condições de normóxia (condição 1); meio padrão sob condição hipóxica [1% O

2 em um hipóxico Glove Box incubadora (Coy Laboratory Products Inc., Grass Lake, MI)] (condição 2); ou EGM2 médio + hipóxia (condição 3). Para algumas experiências, a indução óptima adicionalmente exigida [Glutamax meio D-MEM sem o não-essencial aminoácidos asparagina, ácido aspártico, glutamina e prolina (Invitrogen, Inc.)] nutriente deficiente em meio sob condições hipóxicas, mas de outro modo idêntica contendo o crescimento fatores e suplementos como meio EGM-2 (condição 4). A condição final incluiu o meio deficiente em nutrientes acima, mais normoxia (condição 5). embalagens e infecções de lentivírus para produzir EGFP- ou DsRed-marcadas células foram realizados como previamente descrito [25].

xenoenxertos tumorais subcutâneos foram obtidos através da inoculação de 10

6 células tumorais, que foram compostos por TDECs EGFP-marcados e células tumorais marcadas com DsRed (1:20), subcutaneamente nos flancos de ratinhos nu /nu como previamente descrito [25]. as medições de volume de tumor foram feitas a cada 2-3 dias, até o diâmetro máximo admissível de ca. 2 cm foi atingido (tipicamente 4-6 wks para ambas as células H460 e OVCAR3) altura em que os tumores foram excisados. fragmentos separados de tumores foram usadas para a preparação de secções congeladas e embebidas em parafina.