Abstract

A identificação de linha germinativa variantes que predispõem ao câncer colorretal hereditário sem polipose (HNPCC) é crucial para o manejo clínico de portadores, mas vários probands permanecem negativos para essas variantes ou variantes urso de significado incerto (USV). Aqui nós descrevemos os resultados das análises moleculares integrativas em 132 pacientes HNPCC fornecendo evidências para melhorou testes genéticos de HNPCC com os métodos tradicionais ou de próxima geração. Os pacientes foram selecionados para: Expressão da linha germinativa alelo-específico (ASE), variantes de nucleotídeos, rearranjos e metilação do promotor de reparação incompatibilidade genes (MMR); germinal

EPCAM

rearranjos; instabilidade de microssatélites tumor (MSI) e imuno-histoquímica a expressão da proteína (IHC) MMR. Probandos negativos para as variantes patogênicas de genes MMR foram rastreados para a linha germinal

APC

e

MUTYH

sequência de variantes. A maioria dos defeitos da linha germinativa identificados foram variantes de sequência e rearranjos de genes MMR. Notavelmente, germinal alterado ASE de genes MMR foi detectado em 8/22 (36,5%) probands analisados, incluindo 3 casos negativos em outros exames. Além disso, ASE forneceu evidências para o papel patogênico e guiou a caracterização de um USV partilhada por 2 probands adicionais. Nenhuma linha germinal gene MMR metilação do promotor foi observada e apenas um

EPCAM

rearranjo foi detectado. Em vários casos, o tumor IHC e MSI divergiram de resultados de rastreio da linha germinativa. Notavelmente,

APC

ou bialélico

MUTYH

defeitos germinativas foram identificadas em 2/19 probands negativos para as variantes patogênicas de genes MMR. Os nossos resultados mostram que a ASE complementa análises baseadas em ADNg na identificação de defeitos MMR e na caracterização da expressão do gene que afecta VUS, o aumento do número de alterações da linha germinal detectados. Uma fração apreciável de probands negativas para o gene MMR variantes portos

APC

ou

MUTYH

variantes. Estes resultados indicam que a análise ASE linha germinal e triagem para

APC

e

MUTYH

defeitos devem ser incluídos em algoritmos de diagnóstico HNPCC

Citation:. De Lellis L, Aceto GM, Curia MC, Catalano t, Mammarella S, Veschi S, et al. (2013) Análise integrativa da Hereditárias sem Polipose câncer colorretal: a Contribuição de Expressão específica de alelo e outros ensaios para diagnóstico Algoritmos. PLoS ONE 8 (11): e81194. doi: 10.1371 /journal.pone.0081194

editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de junho de 2013; Aceito: 09 de outubro de 2013; Publicação: 20 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 De Lellis et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado por recursos do Ministério da Educação, Universidade e Pesquisa italiano. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer colorretal hereditário sem polipose (HNPCC), também conhecida como síndrome de Lynch, é a forma mais frequente de predisposição autossômica dominante ao cancro colorectal (CRC) [1]. O diagnóstico genético dos portadores de defeitos germinativas em famílias afetadas é fundamental para uma vigilância clínica eficiente e permite quimioprevenção alvejado que foi mostrado recentemente para reduzir substancialmente a incidência de câncer nesses pacientes [2]. No entanto, a identificação de defeitos germinativas patogênicas nesta síndrome não é trivial, como refletido pela grande flutuação da taxa de alterações genéticas identificadas em diferentes estudos e pelo número relevante de variantes com significância incerta (USV) detectado [3-6] . A taxa variável de alterações detectadas reflete nas diferenças de peça na sensibilidade dos métodos moleculares utilizados e, em parte, o fato de que o diagnóstico clínico não totalmente explicar a heterogeneidade genética subjacente, mesmo quando a seleção de probands é baseado em rigorosos critérios de Amsterdam I (AC critérios -I) ou Amesterdão II (AC-II) [7]. A maioria dos pacientes HNPCC estão ligadas com a linha germinal de reparação incompatibilidade defeitos (MMR) e desenvolver tumores com altos níveis de instabilidade de microssatélites (MSI-H), a marca da deficiência de MMR. Linha germinal

MLH1

ou

MSH2

variantes são identificados na maioria desses pacientes, enquanto que as variantes de outros genes MMR são detectados em uma fração menor de casos [1-6]. Notavelmente, também deleções da linha germinativa que afectam a extremidade 3 ‘do gene da molécula de adesão da célula epitelial (

EPCAM

) pode causar HNPCC através hipermetilação e silenciamento do jusante

MSH2

promotor nos tecidos que expressam EpCAM [ ,,,0],8].

EpCam

eliminações foram notificados com uma frequência relativamente elevada (16-21%) em diferentes estudos realizados nos casos negativos para os defeitos MMR germinativas [9,10]. A maior freqüência (até 33%) do

EPCAM

rearranjos foi observado no subgrupo de pacientes MSI-H negativas para alterações MMR germinativas e sem expressão tumor MSH2 [11,12], mas a frequência global destas rearranjos em série de probands HNPCC, não selecionados para o estado mutacional ou imunocoloração tumor MSH2, não foi avaliado.

Além de genes MMR e

EPCAM

, outros genes desempenham um papel nesta síndrome geneticamente heterogénea. A proporção relativamente elevada de famílias que atendem AC tem “familiar tipo de cancro colorrectal X” (FCCTX), uma agregação de cancro colo-rectal sem evidência de defeitos de linha germinal ou MMR associados ao tumor [4]. Para a maioria dessas famílias, a alteração genética responsável pela predisposição ao câncer de cólon não é conhecido, embora defeitos em genes não-MMR, como

MUTYH

,

OGG1

ou

BMPR1A

, ocasionalmente são detectadas [13-15]. A este respeito, também

APC

variantes associadas a muito fenótipos atenuados podem sobrepor-se com HNPCC [16], ampliando ainda mais a gama de CRC predisponentes genes para ser exibido.

Com base nas considerações acima, teste genético tradicional na HNPCC focado na análise dos genes MMR e vários algoritmos de diagnóstico foram propostos para otimizar essa triagem [17-21]. No entanto, estes algoritmos podem limitar a sensibilidade dos testes genéticos, subestimando portadores de variantes patogênicas em genes MMR. Recentemente, um ensaio gDNA altamente processive (ColoSeq, da Universidade de Washington, Seattle, WA) com base na captura de alvo e sequenciamento de próxima geração (NGS) foi projetado para analisar simultaneamente genes relacionados com a MMR e -unrelated no HNPCC [22]. testes baseados em NGS pode superar algumas das limitações dos métodos de baixo rendimento, mas mesmo esta abordagem tem algumas desvantagens. Por exemplo, NGS não fornecem informações sobre o papel patogénico do VUS que são mais susceptíveis de ser detectado por estes métodos altamente processive. Além disso, abordagens genómicas à base não são projetados para definir o potencial patogênico de

cis viajantes – variantes e trans-acting que afetam a expressão do gene. Estas limitações podem ser, em parte, ultrapassar por ensaios à base de cDNA, tais como a análise de expressão específica para o alelo (ASE) que tem o potencial de revelar defeitos da linha germinativa de predisposição para cancro colorectal, mesmo quando uma variante patogénica não tenha sido determinada ou o papel de as variantes detectadas está claro [23-27].

no presente estudo, ilustram os resultados de integrativa análises realizadas em uma série de 132 pacientes HNPCC italianos utilizando ensaios previamente desenvolvidos e inovadoras para o rastreio de linha germinal e defeitos tumorais. Mostra-se que a análise da linha germinal ASE complementa ensaios baseados em ADNg na identificação e caracterização de defeitos que predispõem para CRC. A nossa abordagem integrativa também mostra que a inclusão de

MUTYH

e

APC

na triagem aumenta o número de variantes patogênicas detectados. Considerando o número de pacientes analisados, o painel de genes rastreadas e a escala dos métodos empregues, neste estudo fornece indicações para a tradução clínica dos testes genéticos HNPCC que podem ser aplicados para as abordagens tradicionais ou NGS. Em particular, os nossos resultados apoiam a inclusão da análise ASE e seleção de genes polipose em algoritmos para o diagnóstico genético de HNPCC.

Materiais e Métodos

Pacientes e estratégia de rastreio integrativa

Foram estudados 132 pacientes não relacionados AC-I ou AC-II previamente recrutados em diferentes instituições italianas. DNA e RNA foram extraídos tal como descrito anteriormente [25]. Todos os participantes do estudo, consentimento informado foi obtido após o aconselhamento verbal e o estudo foi aprovado pelo Comitê da Universidade de Chieti de Ética. Tumorais análises MSI e IHC foram realizados em probandos com amostras de tumores disponíveis. Todos os pacientes, independentemente dos resultados do tumor MSI e IHC análises, foram submetidos a triagem para substituições de nucleotídeos germinativas em genes MMR como detalhado abaixo. Probandos negativos para substituições de nucleotídeos patogênicos foram ainda testados para rearranjos germinativas estendidos em

MSH2

,

MLH1

e

EPCAM

, seguido de rastreio de linha germinativa

MSH2

e

MLH1

metilação do promotor. ASE análises de genes MMR foram realizados em doentes com ARN disponível e heterozigóticos para pelo menos um marcador alélicas, independentemente, a partir dos resultados dos rastreios acima referidos. Pacientes negativos nas análises acima foram testados para a

APC

e

MUTYH

variantes de sequência como descrito abaixo. Os dados de variação identificados neste estudo foram submetidos a Sociedade Internacional para gastrointestinais Hereditárias Tumores (Insight, https://www.insight-group.org/variants/database/) banco de dados.

Triagem de nucleótidos da linha germinativa substituições em genes MMR

Os pacientes foram inicialmente selecionados para a sequência de variantes em

MSH2

e

MLH1

usando análise de polimorfismo único fio conformação (SSCP) ou eletroforese desnaturante (DGGE) . Todos os casos negativos na SSCP ou DGGE foram ainda rastreados para variantes em

MSH2

,

MLH1

e

MSH6

por desnaturação cromatografia líquida de alta eficiência (dHPLC) e sequenciamento automatizado, que detectada algumas mutações adicionais escaparam no rastreio inicial (dados não mostrados). Para prever os potenciais efeitos deletérios da novela USV usamos a seguinte

in silico

ferramentas: PolyPhen-2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), SIFT (http: //peneirar. jcvi.org/), HSF (https://www.umd.be/HSF/), mosca da fruta (https://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html), Mutation Taster (http: //www. mutationtaster.org/), Alamut (https://www.interactive-biosoftware.com). Nós também utilizado MAPP-MMR (https://mappmmr.blueankh.com/) e PON-MMR (https://bioinf.uta.fi/PON-MMR/) algoritmos de previsão, que foram especificamente validadas para variantes missense nos genes MMR .

Análise de rearranjos germinativas estendidos em

MSH2, MLH1

e

EPCAM

Genomic

MSH2

e

MLH1

rearranjos foram rastreados por MLPA (MLPA) em 78 pacientes negativos na análise inicial para a sequência patogênico variantes ou com USV. Confirmação de rearranjos foi obtido por PCR multiplex fluorescente não-acoplada a HPLC (PGFN-HPLC) ou por tecnologia de lab-on-a-chip para a análise das variações do número de cópia (LOC-CNV), tal como previamente descrito [28,29] . Uma vez que a versão original do

MSH2 /MLH1

kit MLPA (P003 SALSA, MRC-Holland, Amsterdam, The Netherlands) empregados não incluem sondas correspondentes a

EPCAM

, desenvolvemos 3 novela PGFN ensaios -HPLC para triagem e de confirmação de rearranjos genômicos que afetam a extremidade 3 ‘de

EPCAM

eo intergênico

MSH2 Restaurant –

EPCAM e região (Tabela S1). Estes ensaios foram realizados em um subconjunto de 33 casos com VUS ou negativa em rastreios anteriores e para os quais o ADN não havia sido utilizada em análises anteriores. análise de ponto de interrupção foi realizada como descrito anteriormente [28,29].

germinativa

MSH2

e

MLH1

promotor metilação

conversão de DNA bissulfito foi realizada em em 44 casos negativos no rastreio inicial para variantes da sequência de patogénicos e rearranjos genómicos utilizando o kit de modificação do ADN que imprime (SIGMA, Saint Louis, MO), de acordo com as instruções do fabricante. Rastreio de linha germinal

MLH1

metilação do promotor foi realizado por PCR específicos de metilação (MSP) usando um degenerado e um iniciador específico do metilação concebido por Suter et al [30]. Além disso, foi elaborado um controle de PCR em que o iniciador degenerado usado para MSP foi emparelhado a um primer específico para o DNA não metilado (Tabela S2). ADN a partir da linha de células SW48 foi usado como o

MLH1

controlo positivo metilação do promotor. Rastreio de linha germinal

MSH2

metilação do promotor de MSP foi realizada pela utilizando iniciadores específicos para os alelos metilados e não metilados, tal como descrito por Chan et al [31]. Os controlos positivos para

MSH2

metilação do promotor foram obtidas utilizando DNAs de controle que haviam sido universalmente metilados usando S-adenosilmetionina (SAM) e M.SssI CpG methyltrasferase (New England BioLabs, Ipswich, MA).

análise ASE

ASE análises de

MSH2

,

MLH1

ou

MSH6

foram realizadas por extensão de primer em pacientes com RNA disponíveis e heterozigotos para, pelo menos, um marcador alélicas, independentemente do seu estado mutacional. ASE análises foram realizadas como anteriormente descrito utilizando um

32P-marcado ou iniciadores não marcados acoplados a análise por Molecular Imager (Bio Rad Laboratories, Hercules, CA) ou por DHPLC (Transgenomic, Omaha, NE), respectivamente [23,25 ]. Três ensaios ASE foram realizadas tanto com iniciadores

32P-marcado e com o método baseado no DHPLC, o que originou resultados semelhantes (Tabela S3). Para cada ensaio ASE, a razão média obtida com modelos de ADNg foi utilizada para normalizar os dados gerados em experiências de extensão de iniciadores realizadas utilizando modelos de ADNc. Estes rácios ADNc /ADNg normalizados foram designados como valores ASE. Com base em estudos anteriores, marcada apenas desequilíbrios na expressão do alelo relativa correspondente ao dobro desequilíbrios nos rácios alélicas ( 1: 2 ou 2: 1 rácios, o que equivale a valores 0,5 ou 2, respectivamente) foram conservadoramente considerados evidência de uma alteração patogénico [23,25,26]. Estes valores ASE desviar mais de 3 SDs de valores médios observados em controlos heterozigotos por dois genes que predispõem CRC que já anteriormente analisados ​​com base na disponibilidade de marcadores ASE frequentes na população italiana (ASE da

MLH1

nos controles, significa 1,04, SD 0.11, usando rs1799977; ASE da

APC

nos controles, significa 1,25, SD 0.21, usando rs2229992) [24,25].

No geral, ASE em

MLH1

,

MSH2

e

MSH6

foi medido utilizando 8 previamente descritos [23,25] e 3 novos ensaios. Primers para novos ensaios estão descritos na Tabela S4.

Tumor MSI e IHC analisa

ensaios de tumor foram realizadas nas instituições colaboradoras que recrutaram os pacientes. MSI foi analisada na maioria dos probandos (93/102) com as amostras de tumor disponíveis, de acordo com as directrizes internacionais [32]. Expressão imuno-histoquímica de proteínas MSH2, MLH1 e MSH6 foi analisado para 73/102 casos com amostras de tumores disponíveis, como descrito anteriormente [13].

Triagem para

APC

e

MUTYH

substituições de nucleotídeos

A sequência de codificação e as fronteiras intrão-exão de

APC

e

MUTYH

foram analisados ​​por sequenciação directa em 19 probandos negativos na triagem gene MMR. Estes pacientes foram selecionados com base na disponibilidade de DNA e com a presença de pelo menos um pólipo no momento do diagnóstico nos probandos e /ou seus familiares.

Resultados

Várias abordagens foram utilizadas para analisar 132 pacientes HNPCC não relacionados para os defeitos patogênicos na MMR e genes não-MMR. variantes

MSH2, MLH1 e MSH6 nucleotídeo

Detectamos 41 descrito anteriormente e 15 novas variantes de genes MMR (Tabela 1 e Tabela S5). Estes incluíram 27 alterações perda de função de nucleotídeos (sem sentido e quadro de leitura) que introduz codons prematuros de terminação (PTCs), 14 variantes localizadas em locais de splicing, 3 eliminações em-frame e 12 substituições de sentido trocado. Oito das variantes locais de splice foram verificados experimentalmente para associar com splicing alterada, incluindo 7 analisados ​​em estudos anteriores [33-38] e em um estudo (ver abaixo), enquanto que 5 foram consideradas patogénicas estar localizado nos dinucleótidos quase invariantes em extremidades intron (Tabela 1 e Tabela S5). Duas eliminações em-frame e 9 variantes missense foram relatados como patogênicos ou potencialmente patogênicos baseado em

in silico

análises, ensaios funcionais, classificador qualitativa ou modelo de previsão multifactorial em relatórios anteriores [39-44], conforme especificado na tabela S5.

pacientes

AC

MSI

MMR defeito IHC

defeitos germinativas

a

variantes de nucleotídeos e rearranjos

alterado ASE

b

LCH-1IMSI-hMLH1

MLH1

c.301GA (p.Gly101Ser) GDLM- 2 # III-1IMSI-hMSH2

MSH2

c.942 + 3ATGDLM-7 # III-3IMSI-hMLH1 /MSH2

MSH2

Del exão 7LCH-8IMSI-HMSH2GDLV-11 # II-9IMSI- HMLH196 # 1636IIMSI-HMLH1GDLM-9 # II-2IMSI-hMSH2

MSH2

c.1549_1550delGCinsT (p.Ala517Tyrfs * 9)

MSH2

GDLG-18 # III-19IMSI-Hn.i.

MSH2

Del exão 3LCH-19IMSI-hMSH2

MSH2

c.2245GT (p.Glu749*)GDLG-20#II-1IMSI-HMLH1

MLH1

LCH-27IMSI-HMSH2

MLH1

GDLG-49#IV-2IMSI-HMSH2

MSH2

c.1024GA (p.Val342Ile) GDLV-52 # II-2IMSI-hMLH1

MLH1

LCH-57IMSI-hMLH1

MLH1

c.1989GT (p.Glu663Asp) LCH-58IMSI-hMSH2

MSH2

c.2005 + 3_2005 + 14del12LCH-59IMSI-hMSH2

MLH1

c.1679delT (p.Phe560Serfs * 31) LCH-88IMSI-Hn.a.

MLH1

c .1731GA (p.Ser577Ser) LCH-93IIMSI-Hn.a.

MSH2

c.1046CG (p.Pro349Arg) 19 # 719IIMSI-hMSH2

MSH2

c.1444dupA (p.Arg482Lysfs * 6) 297 # 875IMSI-hMLH1

MLH1

c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) 307 # 2619IMSI-hMLH1

MLH1

c.199GA (p.Gly67Arg) 309 # 3478IMSI-hMSH2

MSH2

Del exons 9-10311 # 2042IMSI-Hn.i.

MLH1

c.731GA (p.Gly244Asp) 338 # 1489IMSI-hMLH1 /MSH6

MLH1

c.382GC (p .Ala128Pro) 349 # 1581IMSI-hMSH2

MSH2

c.942 + 3AT363 # 2541IMSI-hMSH2

MSH2

Del exons 9-10412 # 3342IIMSI-hMSH2

EPCAM

Del exon 3

– MSH2

exão 7 459 # 2809IMSI-hMSH2

MSH2

Del 5’upstream região – exão 8476 # R26IMSI-hMSH2

MSH2

Del exons 1-6667 # 2412IMSI-hMSH2

MSH2

c.942 + 3AT668 # 2371IMSI-hMLH1

MLH1

c.545 + 3AG670 # 2413IMSI-hMLH1

MLH1

c.1989GT (p.Glu663Asp) 727 # AAIMSI -HMSH2

MSH2

c.942 + 2TA814 # DGRIMSI-Hn.a

MSH2

c.. [376GγA (;) 2251G C] (p [Gly126Ser (;) Gly751Arg].) 986 # 3487IMSI-hMLH1

MLH1

c.1731 + 4AG 1068 # 3015IMSI-hMLH1

MLH1

c.1050delA (p.Gly351Aspfs * 16) 1.070 # 2957IMSI-hMSH2

MSH2

c.2287G . C (p.Ala763Pro) 1.080 # 2974IIMSI-Hn.a

MSH2

c.2089CT (p.Cys697Arg) 1.251 # 3260IIMSI-hMSH2

MSH2

c.374C T (p.Gln125 *) 1256 # 3479IIMSI-hMSH2

MSH2

c.1786_1788delAAT (p.Asn596del) 1.293 # 3286IMSI-hMLH1

MLH1

Del exão 61301 # 3323IIMSI-hMSH2

MSH2

c.2519_2530del12 (p.Val840_Cys843del) 1.459 # 3324IIMSI-hMLH1

MLH1

c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) LES1 # LPIIMSI-Hn.a.

MLH1

c.731GA ( p.Gly244Asp) 298 # 668 /1584IMSI-hMSH2

MSH2

c.1077-2A C319 # 1004IMSI-hMSH2

MSH2

c.1046CG (p.Pro349Arg) 350 # 1933IMSI-hMLH1

MLH1

c.676CT (p.Arg226 *) 360 # 2916IMSI-hMLH1 /MSH6

MLH1

c.1731 + 4AG

MLH1

903 # 2630IIMSI-hMSH2

MSH2

Del exão 31218 # 3238IMSI-hMLH1

MLH1

exons Dup 2-31515 # 3442IIMSI-hMSH2

MSH2

c.1255CT (p.Gln419 *) 334 # 1170IMSI-hMSH2

MSH2

c.278_279delTT (p.Leu93Profs * 6)

MSH2

711 # 2495IIMSI-hMLH1

MLH1

c.1459CT (p.Arg487 *) 1.205 # BAIIMSI-hMLH1

MSH2

c.1215CA (p.Tyr405 *) 1.206 # GEIMSI-hMSH2

MSH2

c.1046CG (p.Pro349Arg) 357 # 2038IMSI-Hn.a.

MSH2

c. 2294delC (p.Ala765Valfs * 47) 600 # 2237IMSI-Hn.a.

MSH2

Del exons 4-61138 # 3149IMSI-Hn.a.

MLH1

c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) 737 # 2838IMSI-Hn.a.

MLH1

c.1989GT (p.Glu663Asp) TO9726IMSI-Hn.a.

MLH1

c.2040CA (p.Cys680 *) GE9804IMSI-Hn.a .

MSH2

c.1705_1706delGA (p.Glu569Ilefs * 2) GE9726IMSI-Hn.a.

MSH2

c.2536CT (p.Gln846 *) SI9744IMSI-Hn.a

. MSH2

c.942 + 3ATGE9914IMSI-Hn.a

MLH1

c.677 + 1GAF102IMSI-Hn.a

MLH1

c.546-2A … GSI9606IMSI-Hn.a

MLH1

c.911AT (p.Asp304Val)LCH-4IMSI-Hn.i.LCH-12IMSI-Hn.i.LCH-85IMSI-Hn.a.LCH-47IMSI-Hn.a.871#R08IMSI-Hn.a.GE0101IMSI-Hn.a.GE9801IMSI-Hn.a.GE9903IIMSI-Hn.a.LCH-6IMSSn.a.LCH-13IMSSn.i.LCH-79IMSSn.a.296#776IMSSn.i.303#2547IMSSn.i.308#1260IMSSn.i.

MUTYH

. C [1145G A]; [1395_1397delGGA] (p.[(Gly382Asp)];[(Glu466del)]313#1381IMSSn.a.342#2803IMSSn.i.365#2192IIMSSn.a.368#2506IMSSn.i.369#2169IMSSn.a.370#3105IMSSn.i.

APC

c.1100_1101delCT (p.Ser367Cysfs*10)633#3114IMSSn.i.728#2509IMSSn.i.818#2543IMSSn.i.933#R14IMSSn.a.1165#3159IMSSn.i.1193#3187IMSSn.i.SV0001IMSI-Ln.a.TO9913In.a.MLH1705#3035In.a.MLH1

MLH1

c.1367C A (p.Ser456 *) 1.008 # 2829In.a.MSH2

MSH2

c.1757C G (p.Ser586 *) 1.077 # 2979In.a.MLH1

MLH1

c.453 + 1GA1420 # 3343IIn.a.MSH2

MSH2

c.868GT (p.Glu290 *) LCH-15In.ani

MLH1

c.1918CT (p.Pro640Ser) LCH-23IIn .ana

MSH2

Del exão 1GDLG-29 # III-8IIn.ana

MLH1

c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) GDLG-31 # III-11In.ana

MLH1

c.954delC (p.His318Glnfs * 49)

MLH1

LCH-86In.ana

MSH2

c.212-1G A83 # 3103In.ana

MLH1

Del exon1

MLH1

601 # 2307In.ana

MSH6

c.3013CT (p.Arg1005 *) 1.157 # 834In.ana

MSH2

c.119delG (p.Gly40Alafs * 24) 324 # R10In.ana

MLH1

c.1896GA (p.Glu632Glu) 337 # 2224In.ana

MLH1

c.1989GT (p.Glu663Asp) 359 # 2578In.ana

MLH1

c.1639_1643dupTTATA (p.Leu549Tyrfs * 44) 463 # 3031In.ana

MLH1

c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) 602 # 2416In.ana

MLH1

c.1011delC (p. Asp338Ilefs * 29) 985 # 2683In.ana

MLH1

Del exão 61074 # 3001In.ana

MSH2

c.1059delG (p.Asn354Thrfs * 3) 1.200 # 3221In.ana

MSH6

c.738_741delAAAA (p.Lys246Asnfs * 32) GE0201In.ana

MSH2

Del exon16GE9911In.ana

MLH1

c.1011delC (p.Asp338Ilefs * 29) TO0012In.ana

MLH1

c.1888_1892delATTGA (p.Ile630 *) TO0225In.ana

MLH1

c.2040CA (p.Cys680 *) GE0410In.ana

MSH2

c.942 + 3ATGE0330In.ana

MSH2

c.1216CT (p.Arg406 *) 162 # 2696In.ana

MLH1

c.1559-2A GLCH-10In.a.n.i.LCH-16In.a.n.a.LCH-51In.a.n.a.LCH-53In.a.n.a.54#982In.a.n.i.314#1200In.a.n.i.353#1114In.a.n.a.455#2186In.a.n.a.1082#2982In.a.n.a.F435In.a.n.a.GE0002In.a.n.a.Table . 1. Visão Geral do MSI, IHC e estado mutacional em 132 pacientes não relacionados HNPCC reunião AC

na, dados não disponíveis; ni, IHC variantes não informative.aNovel estão em negrito. defeitos genéticos MMR germinativas para alguns pacientes foram previamente relatado (ver Tabela 2 e quadros S3, S5, S6 e S7). Nós também detectou diversas variantes previamente relatados como não patogênico (ver Tabela S5) .bASE valor 0,5 ou 2. CSV Baixar CSV

Realizamos

in silico

analisa a inferir o efeito funcional de 4 variantes (3 missense e 1 intrônica) para os quais tal informação não estava disponível a partir de relatórios anteriores. Para o 3 novel missense variantes de um efeito deletério sobre a função da proteína foi prevista por

in silico

ferramentas, incluindo PON-MMR e MAPP-MMR (Tabela S5).

In silico

ferramentas indicou um efeito potencial sobre a emenda para a nova variante intrônica (

MLH1

c.1731 + 4AG) (veja abaixo) (Tabela S5). Uma variante adicional, a novel

MSH2

em-deleção (c.2519_2530del12, p.Val840_Cys843del), foi considerado potencialmente patogénico porque remove 4 resíduos de aminoácidos altamente conservados em outras espécies e situa-se no domínio ATPase da proteína MSH2, onde as variações foram previamente relatado para causar defeitos de incompatibilidade de ligação ou liberar [45,46].

foi encontrado Um paciente (814 # /DGR) para realizar duas substituições missense no

MSH2

(c.376GA e c.2251GC) previsto para ser patogenicidade (ver Tabela S5). Infelizmente, não há parentes deste paciente estavam disponíveis para testes genéticos e a fase das duas variantes não pôde ser verificada.

No geral, o rastreio de variantes de sequência em genes relacionados HNPCC permitiu a detecção de 56 substituições diferentes com um significado patogênico definitiva ou potencial em 72 pacientes, incluindo 26 em

MLH1

(46,5%), 28 em

MSH2

(50%) e 2 em

MSH6

(3,5%) (Tabelas 1 e S5).

rearranjos genômicos de MSH2, MLH1 e EPCAM

Triagem de

MLH1

e

MSH2

por MLPA, seguido por testes de confirmação usando LOC-CNV e /ou PGFN-HPLC, indicaram a presença de rearranjos genômicos (incluindo 14 supressões e 1 duplicação) em 15 dos 78 pacientes analisados ​​(19%) (Tabelas 1 e S6). O gene afetado pelo rearranjo foi de

MSH2

em 10 probandos (13%) e

MLH1

em 5 probands (6,5%).

EPCAM

rearranjos foram rastreados por PGFN-HPLC em pacientes sem variantes patogênicas detectáveis ​​ou com USV. Além disso,

EpCam

rearranjos foram avaliadas em 3 pacientes (476 # R26, 459 # 2809 e 412 # 3342) que com base em MLPA e rastreio PGFN-HPLC tinham evidência de

MSH2

deleções envolvendo o primeiro exão do gene (Tabela S6). Um desses pacientes (476 # R26) tinha uma deleção de

MSH2

exons 1-6 e ensaios EpCam baseados em PGFN-HPLC indicou que o rearranjo não se estendia ao

EPCAM-MSH2

região intergénica (Tabela S6). Em outro paciente (459 # 2809), previamente relatado para ter uma deleção que abrange exons 1-8 de

MSH2

[28], os ensaios EpCam mostrou que a exclusão incluíram a

MSH2

5 ‘a montante região, mas poupou a extremidade 3 ‘de

EPCAM

(Figura S1). No terceiro paciente (412 # 3342) a exclusão afetou toda

EPCAM

exons incluídos nos ensaios EpCAM (exons 3, 8 e 9) (Figura S1). Esta supressão prolongada até ao exão 7 de

MSH2

, como indicado por MLPA e PGFN-HPLC (Tabela S6). Não

EpCam

rearranjos foram detectados em outros pacientes analisados. Todos

MLH1, MSH2

e

EPCAM

rearranjos foram confirmadas por pelo menos 2 ensaios independentes com base em MLPA, PGFN-HPLC ou LOC-CNV. Em 9 casos confirmação dos rearranjos pode também ser obtida por análise de ponto de interrupção ou de RT-PCR (Tabela S6), como descrito anteriormente [28,29].

promotor da linhagem germinativa do gene de metilação

Germline MMR metilação do promotor foi analisada nos casos negativos no rastreio inicial para variantes nucleotídicas patogénicas e rearranjos genómicos. CpG metilação do promotor foi observada apenas com DNAs de controlo positivo (linha SW48 celular para

MLH1 Comprar e DNA controle universalmente metilado para

MSH2

, respectivamente – dados não mostrados).

germinal análise da linhagem germinativa ASE

Entre os 22 pacientes que poderiam ser analisados, observamos alterado ASE da

MLH1

em 6 pacientes e

MSH2

em 2 pacientes (Tabela 2 e Tabela S7). Desses pacientes, 2 apresentaram expressão monoalélicos de

MLH1

(GDLV-52 # II-2 e 83 # 3103) e 6 teve expressão marcadamente desequilibrados de

MLH1

(360 # 2916, GDLG- # 20 II-1, GDLG-31 # III-11 e LCH-27, ASE significativo valores 4.7, 2.01, 2.24 e 2.64, respectivamente) ou

MSH2

(GDLM-9 # II-2 e # 334 1170, média ASE valoriza 3,58 e 9,20, respectivamente). Os demais pacientes tinham modestamente desequilibrada ou ASE equilibrada (Tabela 2 e Tabela S7). ASE valores observados nos 22 probandos estão representados na Figura 1. Para referência, a figura representa também os valores que foram anteriormente medidos em indivíduos heterozigóticos para o controlo variante c.655AG frequente (rs1799977) de

MLH1

[ ,,,0],25].

pacientes

a

variantes germinativas patogênicas

análise ASE

Gene

ASE marcador

Consequência

valor ASE normalizada (SE)

b

GDLM-2 # III-1

MSH2

c.942 + 3AT

MLH1

c. 655AGp.Ile219Val1.00 (0,07) LCH-8

MSH2

c.984CTp. (=) 1,09 (+0,07)

MLH1

c.655AGp.Ile219Val0.97 (0,16) GDLG -18 # III-19

MSH2

Del exão 3

MLH1

c.655AGp.Ile219Val0.91 (0,10) LCH-27

MLH1

c.655AGp.Ile219Val2. 64 (0,38) GDLG-31 # III-11

MLH1

c.954delC (p.His318Glnfs * 49)

MLH1

c.655AGp.Ile219Val2.24 (0,07) LCH-51

MLH1

c.655AGp.Ile219Val0.84 (0,10) LCH-59

MLH1

c.1679delT (p.Phe560Serfs * 31)

MLH1

c. 655AGp.Ile219Val0.97 (0,11) GE9804

MSH2

c.1705_1706delGA (p.Glu569Ilefs * 2)

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.09 (+0,05) 96 # 1636

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.17 (0,06) 334 # 1170

c.278_279delTTp.Leu93Profs MSH2

em> MSH2

c.278_279delTT * 69.20 (+3,97) 359 # 2578

c.1639_1643dupTTATA MLH1

(p.Leu549Tyrfs * 44)

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.33 (+0,04) 314 # 1200

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.01 (+0,03) 1082 # 2982

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.07 (0,02)

MSH6

c.540TCp. (=) 1,10 ( 0,12) 83 # 3103

c

MLH1

Del exão 1

MLH1

c.655AGp.Ile219ValLoss de G alleleTable 2. resultados de extensão do primer as análises ASE realizada neste estudo.

aVisando Tabela S7 resumimos os resultados das análises ASE para 8 pacientes adicionais incluídos no presente estudo, cujos resultados ASE havia sido relatado [23,25] .bMarkedly desequilibrado valores ASE estão em negrito .cFor esta análise PE paciente realizado no presente estudo confirmou a perda de expressão para o alelo G previamente demonstrado por sequenciação de ADNc [28]. CSV Baixar CSV

valores ASE entre as 2 linhas tracejadas correspondem a menos de dupla desequilíbrios nas taxas de alélicas (ver Métodos).

Três pacientes com alteração da linha germinativa ASE (GDLG-31 # III-11, 83 # 3103 e 334 # 1170) eram conhecidos portadores de

MLH1

ou

MSH2

eliminações. Por outro lado, em 2 pacientes com triagem inicial ASE desequilibrada para variantes patogênicas por SSCP ou DGGE foi negativa, mas subsequente re-análise de DHPLC e sequenciamento identificou um frameshift de

MSH2

(caso GDLM-9 # II-2) e um intrônica

MLH1

variante com um efeito potencial sobre splicing (case 360 ​​# 2916, veja abaixo) (Tabelas 1 e S7). Em geral, as variantes com um papel patogénico claro ou potencial foram detectados em 5 dos 8 pacientes com ASE desequilibrada (Tabela 1 e Tabela S7), ao passo que em 3 pacientes (GDLG-20 # II-1, LCH-27 e GDLV-52 # II-2) alterou ASE foi o único defeito da linha germinativa detectado [23,25].

análise de um romance putativa variante de splicing

In silico

análise pela previsão emenda diferente ferramentas de software (ver Métodos) indicou que o efeito da novela

MLH1

c.1731 + 4AG variante partilhada por 2 probands (360 # 2916 e 986 # 3487) era incerto. No entanto, eles sugerem que esta alteração pode afectar o splicing por diminuir a força do local dador (diminuição média de 13%, intervalo de 7,4-22%). A disponibilidade dos ADNc de paciente 360 ​​# 2916 nos permitiu testar se a variante c.1731 4AG + foi associada a um defeito de splicing. Esta alteração foi evasivo em teste inicial de RT-PCR de ADNc amplificado, porque apenas transcritos de tipo selvagem foram revelados através de sequenciação directa ou através de análise electroforética (dados não mostrados). No entanto, com base nos resultados da análise de ASE mostrando um acentuado desequilíbrio na expressão alélica (proporção alélica média normalizada de 4,7, derivado a partir de ensaios radioactivos e baseados em DHPLC, Tabela S3), a hipótese de que um processamento alterada pode ser revelada por DHPLC. Como previsto, a análise mais sensível DHPLC permitiu a detecção de um pico principal com um tempo de retenção correspondente ao transcrito de tipo selvagem e de um pico secundário correspondente a um transcrito mais curto menos expressas. Sequenciamento confirmou que a menor expressão

MLH1

transcrição realizado um out-of-frame exão 15 skipping (Figura S2).