Abstract

A fase mais mortal na progressão do cancro é metastático conversão. Epitelial-mesenquimal-a transição (EMT) é um processo fundamental pelo qual as células cancerosas adquirem fenótipos invasivo e metastático. A fim de gerar metástases macroscópicas, as células cancerosas disseminadas parece exigir capacidade de auto-renovação. No entanto, o mecanismo subjacente definição destes processos é pouco compreendida. Um mecanismo de metástase subjacente possível é a fusão entre as células mielóides e células cancerosas. Neste estudo, descobrimos que os híbridos tumorigênicos espontaneamente formados entre células de osso derivadas de medula tronco mesenquimais (MSCs) e três linhas de células diferentes do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) contribuiu para subpopulações altamente malignas com tanto EMT e células estaminais-like propriedades. Hybrids perdeu sua morfologia epitelial e assumiu uma aparência de fibroblastos-like. -Regulação de vimentina, actina de músculo liso-α (α-SMA), e a fibronectina, e a sub-regulação de E-caderina e pancitoqueratina foram observadas em híbridos tumorigénicas. Estas células também exibiu um aumento da expressão do marcador de células estaminais prominin-1 (CD133) e a sobre-expressão de factores de transcrição OCT4, Nanog, BMI1, Notch1, ALDH1, bem como Sox2, todos os genes responsáveis ​​pela regulação e manutenção do fenótipo de células estaminais. Além disso, nos híbridos formados espontaneamente tumorigénicas, maior capacidade e a capacidade de formação de tumores em ratinhos NOD /SCID formando-pneumosphere eram detectáveis. Assim, a fusão celular entre as células de câncer de pulmão e MSC fornece um mecanismo nonmutational que possam contribuir para os padrões de expressão de genes aberrantes e dar origem a subpopulações altamente malignas ambos capazes de EMT e com propriedades de células-tronco cancerosas (CSCs).

citação: Xu MH, Gao X, Luo D, Zhou XD, Xiong W, Liu GX (2014) EMT e Aquisição de tronco propriedades semelhantes a células estão envolvidos na formação espontânea de tumorigenos Híbridos entre câncer de pulmão e derivadas da medula óssea células-tronco mesenquimais . PLoS ONE 9 (2): e87893. doi: 10.1371 /journal.pone.0087893

editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 17 Agosto, 2013; Aceito: 06 de janeiro de 2014; Publicação: 06 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China (81.071.728). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão, especialmente cancro do pulmão de não-pequenas células (NSCLC), continua a ser a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo. As formas mais comuns de chamada NSCLC incluem adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas e carcinoma de grandes células [1], [2]. Metástase tumoral é a principal causa de morte por NSCLC. No entanto, os mecanismos envolvidos em metástase tumoral permanecem pouco compreendidos.

A transição epitelial-mesenquimal (EMT) é um processo de trans-diferenciação pelo qual as células passam por um interruptor morfológica do fenótipo epitelial polarizado para o fenótipo mesenquimal fibroblastóide, e envolve a perda da polaridade celular, diminuição da adesão célula-a-célula, e aumento da motilidade e da capacidade de migração de [3]. EMT tem sido sugerido para ser um passo essencial na disseminação de células de cancro e metástases. Durante o processo de metástase de tumor, que é muitas vezes activado por um EMT, células cancerosas disseminadas parece exigir a capacidade de auto-renovação, a fim de gerar metástases macroscópicas. Trabalhos recentes revelaram que o processo de EMT gera células com propriedades stemlike na população de células mamárias [4]. A ligação entre EMT e aquisição de propriedades semelhantes a células-tronco por células cancerosas pode explicar porque EMT induz a progressão do tumor. No entanto, os mecanismos que induzem e, em seguida, manter esta mesenquimais /haste estado celular permanecem obscuros.

A aquisição de capacidade metastática de células de tumor é considerado um evento no final da evolução de tumores malignos, em que a célula é metastático presume-se que surgem de forma progressiva e gradual para acumular as mutações adicionais necessários para a motilidade. Recentemente, no entanto, este paradigma foi contestada. Novas evidências sugerem que as células malignas podem disseminar em um estágio muito mais cedo do que anteriormente reconhecido na tumorigênese [5], [6]. Isto sugere que um gatilho anterior deve ser dirigindo o desenvolvimento do fenótipo móveis, permitindo que algumas dessas células para libertar-se do tumor primário, invadir a microcirculação, viagens e estabelecer focos em locais distantes. A formação de híbridos entre células cancerosas e células derivadas de medula óssea normal dentro de estroma associado ao tumor foi preconizada como um mecanismo nonmutational que poderia contribuir para os padrões de expressão de genes aberrantes associadas com sub-populações altamente malignas [7] – [11].

a fusão celular é um processo fundamental que ocorre na saúde e na doença, na qual duas ou mais células se tornam um a fusão de suas membranas plasmáticas e reorganizando seus conteúdos nucleares. A progênie de fusão celular são conhecidos como híbridos. Esses híbridos de fusão partilham as características genéticas e funcionais de ambas as células parentais [7], [9], [12]. O genoma de células cancerosas pode contribuir para tumorigenicidade os híbridos, enquanto que as células mielóides poderia contribuir expressão de genes mesenquimais e aumento do potencial metastático

.

Durante a última década, vários subconjuntos distintos de células mielóides infiltrantes tumorais têm sido descritos [ ,,,0],13], entre os quais as células estaminais mesenquimais (MSCs) têm chamado a atenção para ter um papel na progressão do cancro [14] – [16]. MSCs são uma pequena população de células dentro do compartimento da célula do mesênquima do estroma que têm a capacidade de auto-renovação e diferenciação em múltiplas linhagens de células. MSC de infiltração é comum em NSCLS [17]. Na maioria dos casos, as MSCs-se infiltram no tumor fornecer vários auxiliares funcionais para promover malignidade, variando de suporte estrutural para a criação de um ambiente de pré-metastático [18], [19].

Tomados em conjunto, estas linhas de diversas evidências sugerem a hipótese de que fusogénico populações de células mielóides, tais como as MSCs, pode facilitar a capacidade de células tumorais para adquirir mesenquimais e haste propriedades semelhantes a células, transferindo recursos celulares distintas durante um evento de fusão física com as células cancerosas. Portanto, o objetivo deste estudo foi identificar se híbridos formados pela fusão entre as células de câncer de pulmão humanos e MSCs derivadas da medula óssea poderia tornar-se um recurso para mesenquimais /câncer de células estaminais-like.

Resultados

formação espontânea de MSC-Lung Cancer Híbridos

MSCs cultivadas exibiram a morfologia das células de fibroblastos-like (Figura S1A), fenótipos típicos e foram positivas para CD44, CD105 e negativo para CD34 (Figura S1B), e têm multipotency se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condrócitos após osteogênico, diferenciação de indução adipogênica e condrogênica (Figura S1C-e).

em primeiro lugar, avaliaram se os híbridos heterotípicos espontaneamente formados poderia ser encontrado em um experimento de co-cultura. As MSCs foram fluorescente etiquetado por transdução retroviral com vectores que expressam RFP, e as células de carcinoma de pulmão foram marcados por vetores que expressam EGFP. Nós co-cultivadas MSCs humanas com A549 humano, H460, ou SK-MES-1 células de câncer de pulmão. Após 72 horas, as células expressando tanto EGFP e RFP foram detectados (Figura 1A). Como a fusão celular progrediu, observou-se MSCs gradualmente transformando as células verdes e câncer de pulmão transformando gradualmente vermelho, assim as células duplamente fluorescentes, com morfologia distinta do estroma e emitindo fluorescência amarela, surgiu (Figura 1B). A presença de dois ou mais núcleos foi detectada na maior parte destas células. A população híbrido heterotípica constituído 2,91 ± 0,35%, 1,23 ± 0,13% ou 3,20 ± 0,48% do total de células no MSC-A549 de co-cultura, a co-cultura MSC-H460 ou MSC-SK-MES-1 co-cultura, respectivamente , tal como avaliado por citometria de fluxo (Figura 1C). No entanto, uma experiência de controlo mostraram que a fusão das células era relativamente não-detectável quando co-cultura de MSCs humanas com BEAS-2B (linha bronquial humano normal das células epiteliais) ou MRC-5 (linha celular de fibroblastos de pulmão humano normal), respectivamente.

(a) micrografias fluorescentes de uma co-cultura de A549-EGFP (verde) e o MSC-RFP (vermelho), que mostra a formação de células híbridas de marcação dupla com dois núcleos e uma forma fibroblástica (setas). Barra de escala, 50 mm. (B) micrografias fluorescentes, tomadas em intervalos de 2 por hora, de co-culturas de SK-MES-1-EGFP (verde) com MSC-RFP (vermelho), demonstrando aparente envolvimento de fusão celular (setas) e mudança de cor em a interação das células de câncer de pulmão com CTMs. Barra de escala, 10 | im. (C) Quantificação de hibridação espontânea entre as células de cancro do pulmão (A549-EGFP, H460-EGFP ou SK-MES-1-EGFP) e MSC-RFP em co-cultura de alta densidade. O número de híbridos foi avaliada por análise de citometria de fluxo e expresso como uma percentagem do total de células. Os dados representam a média ± SEM de três experiências. (D) a análise FISH de HCC827 /MSC co-culturas. MSCs do sexo masculino foram cultivadas com células de câncer de pulmão HCC827 fêmea por 8 dias e fixa. PEIXES (Spectrum red-cromossomo Y e Spectrum verde-cromossomo X) foi realizada e os núcleos foram coradas com DAPI (azul). setas verdes mostram cromossomos X e setas vermelhas, cromossomas Y. Homem MSCs expressa um cromossomo Y e um cromossomo X enquanto que as células HCC827 femininos expressas apenas cromossomos X. Em HCC827 híbridos /MSC: exemplo de duas células, uma abrigar dois núcleos e o outro com um núcleo. Estas duas células cada possuem um cromossomo Y indicando um células derivadas de MSC. Barra de escala, 25 um.

A fim de confirmar o papel da fusão, MSCs de género incompatíveis e HCC827 células foram co-cultivadas e híbridos heterotípicos foram avaliados por FISH de cromossomos sexuais. Para estas experiências, as células HCC827 fêmeas foram tornadas resistentes puromicina por transdução lentiviral. Os híbridos HCC827 /MSC foram seleccionadas por exposição a 1 ug /ml de puromicina, o que causou o desaparecimento completo de MSC do sexo masculino. Após 5 dias de selecção, foi detectado o aparecimento de híbridos derivados do sexo masculino e com a morfologia do estroma. Alguns dos híbridos continha um único núcleo com um cromossoma Y e vários cromossomas X, indicando que o núcleo de um MSC do sexo masculino tinha fundido com o núcleo de uma célula HCC827 fêmea. Algumas células continha dois núcleos, um com um cromossoma Y e o outro sem um cromossoma Y, o que indica que a membrana de um MSC do sexo masculino tinha fundido com a membrana de uma célula HCC827 fêmea sem fusão dos dois núcleos (Figura 1D). Outras células continham um único núcleo com um cromossomo Y e um cromossomo X, sugerindo a mitose de células multinucleadas fundidos, dando origem a MSC derivadas de células-filhas mononucleadas (Figura S2A).

A fim de confirmar a ocorrência de fusão

in vivo

, MSCs de género incompatíveis e HCC827 células foram recém-misturado na mesma proporção que o utilizado no

in vitro

ensaios seguida xenoenxerto por injecção subcutânea em ratos imunodeficientes NOD /SCID. fusão celular entre MSCs e células HCC827 foi avaliado por FISH de cromossomos sexuais. Cinco semanas após xeno, híbridos tumorigénicas derivadas de machos espontaneamente formados foram detectados (Figura S2B). Colectivamente, estes dados indicam que espontaneamente formados híbridos câncer MSC-pulmonares pode ser observada tanto

in vitro

e

in vivo

.

Fusão entre MSCs e câncer de pulmão Células Induz alterações morfológicas e Inibição do Crescimento

a 5 a 7 dias após o final do tratamento puromicina, foram isoladas híbridos fluorescentes puromicina-resistentes por separação de células activadas por fluorescência. Após a fusão com a MSC-RFP, células A549-EGFP perderam a sua morfologia epitelial. Tornaram-se dispersa e assumiu uma aparência de fibroblastos-like com uma forma alongada e polaridade front-to-back. O mesmo efeito foi observado com a EGFP-H460 e SK-MES-1-EGFP células (Figura 2A). Estes híbridos EGFP expressa simultaneamente e RFP (Figura 2B), e dois ou mais núcleos foram detectados na maioria destas células. Nossas observações sugerem que uma transição do epitélio para características morfológicas mesenquimais-like foi induzida por fusão.

(A) imagens de contraste de fase de híbridos heterotípicos e respectivas células de câncer de pulmão parentais. Após a fusão com CTMs, cancro do pulmão células dispersas, perdeu sua morfologia epitelial e assumiu uma aparência de fibroblastos-like com forma alongada e polaridade front-to-back. barra de escala, 500 mm. (B) confocal imagens de microscopia de laser. híbridos A549 /MSC assumiu uma aparência de fibroblastos-like e expressa tanto EGFP e RFP. Barra de escala, 25 um.

Em seguida, testamos a hipótese de que a fusão com MSCs poderia influenciar a proliferação de células cancerígenas. Em todas as linhas celulares testadas (A549, H460 e SK-MES-1), a fusão com as MSCs induzida a inibição do crescimento. Hybrids começou a crescer mais lento do que as respectivas células de câncer de pulmão parentais de Dia 2, ea diferença de velocidade de crescimento entre os dois grupos foi significativa após o Dia 4 (Figura S3). Estes resultados indicam que o potencial de proliferação de híbridos diminuiu significativamente em comparação com as respectivas células de câncer de pulmão parentais em cada ponto de tempo após o Dia 2.

Fusão com MSCs promove uma mudança de epitelial para mesenquimal Fenótipo em células de câncer de pulmão

Tendo em conta as alterações morfológicas dos híbridos câncer MSC-pulmonares, o próximo investigado se eles adquiriram uma mudança na expressão de um epitelial para mesenquimal um repertório. Usamos imunofluorescência e QRT-PCR para examinar a expressão e distribuição de E-caderina, pancitoqueratinas, vimentina, actina de músculo α-liso (α-SMA) e fibronectina em híbridos heterotípicos e em suas respectivas células de câncer de pulmão parentais. Nós também utilizado QRT-PCR para examinar a expressão de fatores de transcrição EMT indutores tais como Caracol, Lesma, Zeb1, Zeb2, FOXC2 e genes torção.

imunofluorescência mostrou que, em comparação com células de câncer de pulmão parentais, MSC híbridos cancerosas Pulmão exibiu uma forte redução na expressão de proteínas de e-caderina e pancitoqueratinas, bem como aumento significativo da expressão de vimentina, α-SMA e a fibronectina em todas as três linhas celulares de NSCLC (Figuras 3A-e).

as MSCs e células de câncer de pulmão foram fluorescente etiquetado por transdução retroviral com RFP- e vectores expressando EGFP, respectivamente. híbridos heterotípicos espontaneamente formados expressa tanto EGFP e RFP. A imunocoloração foi realizada com anticorpos primários contra (A) a E-caderina (E-Cad), (B) pancitoqueratina (pCK), (C) vimentina (VIM), (D) α-SMA, e fibronectina (E) (fibro) e revelou usando anticorpos secundários AlexaFluor 647-rotulados (roxo); núcleos foram coradas com DAPI (azul). Barra de escala, 25 um. (F) Os níveis de mRNAs que codificam E-caderina, vimentina, α-SMA, fibronectina, FOXC2, Slug, Caracol, Twist, Zeb1 e Zeb2 espontaneamente formado A549 /MSC, H460 /MSC, SK-MES-1 /expressão híbridos heterotípicas MSC em relação às respectivas células de cancro do pulmão parentais, tal como determinado por qRT-PCR. GAPDH mRNA foi utilizada para normalizar a variabilidade na carga molde. Os dados são apresentados como média ± SEM.

QRT-PCR, análises revelaram que, em relação à expressão em células de cancro de pulmão parentais, o nível de ARNm da E-caderina em híbridos foi significativamente reduzida, enquanto que a expressão de mRNAs que codificam marcadores mesenquimais foi marcadamente aumentada (Figura 3F). Houve também um considerável aumento na expressão de factores de transcrição de EMT-indutores (Figura 3F).

De forma a determinar a capacidade de células de cancro do pulmão para adquirir características mesenquimais sem eventos de fusão, que expressam EGFP-células de cancro do pulmão e as MSCs expressam RFP foram plaqueadas nos poços superior e inferior de uma inserção de cultura de 0,4 uM de células. Após a co-cultura indirecta, durante 8 dias, as células de cancro do pulmão exibiram expressão semelhante da E-caderina, vimentina, α-SMA e a fibronectina em todas as três linhas celulares de NSCLC, em comparação com células de cancro do pulmão parentais que foram cultivados sozinhos (dados não mostrados). Estes resultados demonstraram que os híbridos câncer MSC-pulmonares expressa marcadores associados às células que foram submetidos a um EMT.

Hybrids Adquirir aumento da motilidade e invasão

Para investigar mais outra marca funcional do mesenquimais /célula-tronco estado, realizamos

in vitro

ensaios de motilidade. Em ensaios de migração, híbridos A549 /MSC foram mais migratório (5,5 vezes) em comparação com células A549 parentais, híbridos H460 /MSC foram mais migratório (5,9 vezes) em comparação com células H460 parentais, e SK-MES-1 híbridos /MSC eram mais migratório (4,1 vezes) em comparação com parentais SK-MES-1, células (Figura 4A). Em ensaios de invasão, híbridos A549 /MSC foram mais invasiva (3,8 vezes) em comparação com células A549 progenitor, híbridos H460 /MSC foram mais invasiva (5,9 vezes) em comparação com células-mãe H460 e SK-MES-1 híbridos /MSC eram mais invasiva (5,8 vezes) em comparação com pai SK-MES-1, células (Figura 4B). Tomadas em conjunto, as nossas observações indicam que os híbridos espontaneamente formados entre as células do cancro do pulmão e MSC representam uma sub-população enriquecida em células móveis.

O potencial migratório e invasiva das células foi determinada por contagem do número de células que tinham migrado para a superfície inferior do filtro em 12 campos microscópicos seleccionados aleatoriamente por pastilha. (A) Os ensaios de migração: imagens microscópicas e quantificação. (B) ensaios de invasão: imagens de microscopia e quantificação. Os dados são apresentados como média ± SEM de três experiências independentes. Asteriscos mostram diferenças estatisticamente significativas entre os híbridos heterotípicos e respectivas células de câncer de pulmão parentais (*

P Art 0,001). Barra de escala, 50 mm.

Gene Expression Profiling de stemness Marcadores em Hybrids

O marcador de células-tronco prominin-1 (CD133), uma proteína de membrana pentaspan, pode não ser a única marcador, mas continua a ser o marcador mais amplamente divulgado de células-tronco cancerosas (CSCs) de câncer de pulmão, e foi validado por diferentes grupos [20] – [22]. Foram avaliados ainda mais a expressão de CD133 em híbridos de câncer MSC-pulmonar, utilizando citometria de fluxo e QRT-PCR. A citometria de fluxo mostrou que as análises em células A549 parentais, a percentagem expressa CD133 foi de cerca de 0,94% da população total de células. Após a fusão com as MSCs, o aumento da expressão de CD133 de 30 vezes. Além disso, a expressão aumentada em CD133 híbridos comparado com os respectivos pais H460 e linhas celulares SK-MES-1 (Figura 5A). QRT-PCR A análise revelou também que, em relação à expressão em células de cancro de pulmão parentais, o nível de ARNm de CD133 em híbridos foi significativamente aumentada (Figura 5B). Estes dados fornecem provas adicionais de que espontaneamente formada tumorigénicas híbridos entre células do cancro do pulmão e MSC adquirir a sobre-expressão de marcadores de células estaminais acompanhados por passagem através de um EMT.

(A) análise de citometria de fluxo da expressão de CD133 em híbridos heterotípicas e respectivas células de câncer de pulmão parentais. Percentagens de CD133

+ células são indicados no anticorpo controle e as células marcadas com anticorpos específicos. Cinza e linha preta indicada controle negativo e da amostra, respectivamente. (B) Os níveis de mRNAs que codificam CD133, Nanog, BMI1, Notch1, ALDH1, Sox2 e OCT4 espontaneamente formado A549 /MSC expressão, H460 /MSC e SK-MES-1 /MSC híbridos heterotípicos em relação ao respectivo câncer de pulmão parental células tal como determinado por qRT-PCR. GAPDH mRNA foi utilizada para normalizar a variabilidade na carga molde. Os dados são apresentados como média ± SEM.

Para investigar os genes responsáveis ​​pela regulação e manutenção do fenótipo de células-tronco de híbridos A549 /MSC, foi realizada QRT-PCR para OCT4, Nanog, BMI1, Notch1 , ALDH1 e Sox2. Curiosamente, os factores de transcrição OCT4, Nanog, BMI1, Notch1, ALDH1 e Sox2, conhecido por ser suficiente para reprogramar células somáticas humanas rato ou de células-tronco indiferenciadas, pluripotentes, verificou-se ser significativamente aumentada em híbridos em comparação com células de cancro do pulmão parentais, indicando o seu fenótipo stemness (Figura 5B). Estes resultados indicam que os genes de auto-renovação são sobre-expressos em híbridos espontaneamente formados entre células e MSCs de câncer de pulmão.

Capacidade para formar esferas tumorais é aumentada em híbridos

O ensaio de agar mole serve como um

in vitro

medida substituta da tumorigenicidade [23], enquanto o pneumosphere ensaio mede a proliferação de ancoragem-independente a densidade clonal

in vitro

e tem sido associada com a presença de populações de células estaminais [ ,,,0],24]. Por isso, estas células submetidas a ambos os ensaios de agar mole e pneumosphere. Curiosamente, observou-se que os híbridos heterotípicos formado pelo menos 7,5 vezes mais colônias em cultura de suspensão de agar mole do que os de controle de células de câncer de pulmão parentais (Figura 6A e Figura S4A). células igualmente importantes, híbridos mostraram aumento significativo na capacidade para formar pneumospheres em comparação com as suas células de câncer de pulmão parentais, formando, pelo menos, 7,3 vezes mais do que os seus pneumospheres células parentais (Figura 6B). O tamanho pneumosphere de células híbridas também era significativamente maior do que a de células de cancro do pulmão parentais. Dissociando as mammospheres inicialmente formados e reintroduzir essas células em culturas mammosphere secundárias, observou-se um aumento modesto na formação esfera por híbridos (Figura S4B). Com base nesta análise, concluiu-se que os híbridos tumorigênicos espontaneamente formados entre as células de câncer de pulmão e MSCs adquirir mais um atributo da CSCs

(A) macias ensaios de agar:. Células individuais (1 × 10

3 por poço) foram plaqueadas em agar mole em placas de 6 poços em triplicado. As imagens microscópicas e quantificação de híbridos heterotípicos e respectiva A549 parental, H460 ou células SK-MES-1. Os dados são apresentados como média ± SEM. (B) Pneumosphere ensaio: As imagens microscópicas e quantificação de híbridos heterotípicos e respectiva A549 parental, H460 ou SK-MES-1 células; n = 12. Os dados são apresentados como média ± SEM. Asteriscos mostram diferenças estatisticamente significativas entre os híbridos heterotípicos e respectivas células de câncer de pulmão parentais (*

P Art 0,001). barra de escala, 100 mm.

heterotípicos Hybrids Exhibit reforçada tumorigenicidade e reproduzir o Tumor Humano

in vivo

A fim de testar se a fusão com MSCs consegue alterar a frequência de iniciação tumor de células de câncer de pulmão, injetamos híbridos A549 /MSC, H460 híbridos /MSC, bem como SK-MES-1 híbridos /MSC e respectivas células de câncer de pulmão parentais em camundongos NOD /SCID. Como relatado na Tabela 1, verificou-se que a injecção de tão pouco quanto 10

4 híbridos consistentemente resultou no crescimento de xenoenxertos de tumor com características morfológicas que assemelham-se de perto do tumor induzida pelas respectivas células de cancro do pulmão parentais, como mostrado por hematoxilina e eosina coloração (Figura 7A). O volume de tumor foi gerado por híbridos significativamente maior do que a que resulta a partir de células parentais (Figura 7B). Estes resultados confirmaram que espontaneamente formado híbridos tumorigênicos entre as células de câncer de pulmão e MSCs representam uma subpopulação enriquecida para células iniciadoras de câncer de pulmão.

(A) híbridos câncer MSC-pulmão são tumorigénico e regenerar tumores semelhantes ao respectivo parental células de câncer de pulmão em NOD /SCID. Hematoxilina e eosina (H E) Coloração realizados em amostras de tumor derivadas de um tumor parental ou a partir de tumores gerados por injecção subcutânea de híbridos de cancro do pulmão em MSC-NOD /SCID (xenoenxerto). Os dados são representativos de três experiências independentes. (B)

Painel superior:

potencial tumorigénico de 1 × 10

3 A549 /MSC em comparação com 1 × 10

4 células A549 parentais. As células foram simultaneamente injectados no direito (A549 /MSC) e esquerda (A549) do mesmo ratinho, rato e a fotografia foi feita 12 semanas depois da injecção.

Painel inferior:

patologia grave de tumor geradas por injecção subcutânea de híbridos A549 /MSC no painel superior. Os dados são representativos de três experiências independentes. barra de escala, 100 mm.

Células Híbridos readquirir epitelial-como características morfológicas

in vitro

e

in vivo

na diferenciação

Após 3 meses em cultura, uma transição generalizada de mesenquimal-epitelial como características morfológicas foi observada para os híbridos de cancro MSC-pulmão (Figura 8A). Também foi observada uma mudança morfológica similar durante o crescimento de xenoenxertos de tumor. A forma da célula de xenoenxertos híbridos era muito mais parecida com a das células de câncer de pulmão parentais na aparência. expressão membranoso forte de pancitoqueratinas e E-caderina em xenoenxertos híbridos, comparáveis ​​com a expressão em xenoenxertos de cancro do pulmão parentais e morfologia celular foram sugestivos da natureza epitelial dos tumores, enquanto que a expressão aumentada de vimentina, α-SMA e fibronectina sugeriu um MSC contribuição para o fenótipo híbrido (Figura 8B). Estes dados sugerem que a instabilidade dos híbridos. Conforme o tempo passa, uma reversão do fenótipo misto e o processo inverso chamado mesenquimal-epitelial (MET) ocorre.

(A) Imagens, em momentos sucessivos, mostrando reversão das características morfológicas fibroblásticas de híbridos A549 /MSC para um epitelial, aparência A549-como na cultura. Barras de escala: 500 mm. (B) coloração imuno-histoquímica para os antigénios indicados realizados em amostras de tumor derivadas de tumores A549 parental ou a partir de tumores gerados por injecção subcutânea de híbridos A549 /MSC em ratinhos NOD /SCID. Explantes de xenotransplantes tumorais de A549 híbridos /MSC e células A549 parentais apresentaram características morfológicas semelhantes pulmonares cancerosas-like. barra de escala, 100 mm.

Discussão

Os resultados aqui apresentados descrevem uma convergência inesperada de EMT e haste propriedades da célula em híbridos tumorigênicos espontaneamente formados entre as células de câncer de pulmão e osso marrow- MSC derivadas. A transição epitelial-mesenquimal (EMT) tem sido descrita na última década como um processo normal crítico durante o desenvolvimento e cicatrização de feridas, mas, recentemente, propriedades de EMT têm sido implicados na patologia humana, incluindo metástases do cancro [25]. Independente destes resultados, os estudos têm descrito evidência de células estaminais em uma variedade de cancros. Mani

et al.

Primeira encontraram uma ligação entre estes dois conjuntos de fenômenos nas células tumorais de mama em 2008 [4]. No entanto nenhuma pesquisa revelou ainda os mecanismos por trás deles, ou identificou a fonte das células com ambos EMT e haste propriedades da célula. Neste estudo, demonstramos pela primeira vez que as células de cancro do pulmão pode adquirir características mesenquimais e haste propriedades da célula através de um mecanismo de fusão com as MSC. A descoberta de híbridos tumorigênicos espontaneamente formados entre as células de câncer de pulmão e MSCs derivadas da medula óssea com muitas das propriedades de ambos células-tronco auto-renovação EMT e mantém a promessa de resolver um problema importante na biologia do câncer. Durante o processo de metástase de tumor, EMT propriedades podem permitir a difusão das células tumorais a partir do tumor primário para dentro do estroma circundante e, portanto, para locais distantes [26]. No entanto, se a grande maioria das células que se espalham falta a capacidade de auto-renovação, a sua capacidade de metástases encontraram macroscópicas é comprometida desde o início, devido ao seu potencial proliferativo limitado. Este mistério pode ser resolvido, pelo menos em parte, pelos presentes resultados, uma vez que os híbridos espontaneamente formados entre as células e as MSCs obter tanto EMT e originam propriedades semelhantes a células de cancro, o desenvolvimento do qual permite que as células cancerosas para difundir a partir de um tumor primário e para formar colónias à distância.

recentemente, a ligação entre a progressão do cancro e infiltração com células mielóides foi reconhecida em uma variedade de cancros [13]. A infiltração com células mielóides é geralmente associada a resultados menos favoráveis ​​clínicos [27] – [29]. A inflamação é um constituinte importante do ambiente local dos tumores [30]. Quimiocinas e citocinas são elementos cruciais, que contribuem para a inflamação relacionada com o cancro [31], [32]. Atraídos por quimiocinas, uma variedade de MSCs da medula óssea são recrutados para locais de tumor, e desempenham um papel em facilitar a progressão do câncer de pulmão [17]. Um trabalho recente indica que a inflamação crónica pode promover a fusão das células [33] – [35]. O presente estudo demonstra pela primeira vez que MSCs pode promover EMT e divulgação por meio da fusão com células de câncer de pulmão. Ele também fornece uma explicação mecanicista para o link reconhecido há muito tempo entre inflamação e progressão do câncer.

O presente estudo demonstra que a fusão celular entre MSCs e células de câncer de pulmão resulta em uma subpopulação que exibem características morfológicas mesenquimais e anomalias citogenéticas, juntamente com características invasoras e capacidade de auto-renovação. Claramente, o genoma das células de cancro pulmonar contribuiu para tumorigenicidade os híbridos, enquanto que as MSCs contribuiu expressão de genes mesenquimais e aumento do potencial metastático. Alguns dos híbridos podem também ter a capacidade de auto-renovação e diferenciação em múltiplas linhagens de células a partir das MSCs derivadas de medula óssea. híbridos tumorigênicos Curiosamente, em um estudo anterior, espontaneamente formados entre MSCs e células de cancro da mama tinha uma aparência mesenquimal-like e expressão mista de genes de carcinoma mesenquimais e da mama [9]. Nossos dados são consistentes com relatos anteriores de que espontaneamente fusionados híbridos tumorigênicos entre MSCs e células cancerosas pode posteriormente adoptar o fenótipo das células receptoras [9], [12]. O

in vivo

ensaio tumorigênico confirmaram suas propriedades tumorigénicas, enquanto que a expressão aumentada de vimentina, actina de músculo α-liso (α-SMA) e fibronectina, e superexpressão de genes de regulação da transcrição, como o Slug, Caracol, Zeb1 , Zeb2, FOXC2 e twist, indicam que os híbridos podem adquirir propriedades mesenquimais de MSCs. Além disso, a sobre-expressão de genes de auto-renovação, como Bmi1, ALDH1, e Oct-4 indica que as células de câncer de pulmão pode adquirir propriedades semelhantes a células-tronco de MSCs por fusão.

Cogle

et al.

demonstrou nenhuma evidência de um cariótipo fusão entre células epiteliais e células de medula óssea usando microscopia confocal e XY enumeração vez que as células derivadas do doador (cromossomo Y positivos) detectadas por FISH continha apenas um cromossomo X [36]. Os resultados paradoxais acima mencionados pode, devido à instabilidade dos híbridos. Dentro de 3 meses, tanto

in vitro

e

in vivo

, as características morfológicas de células híbridas alterado. Isto indica que os híbridos são instáveis. As células que surgem como produtos de fusão podem ser submetidos a “divisão de redução,” e ploidia de DNA diminuiu em 60 [9] dias. O meio foi mudado de três em três dias.