Abstract

Background

inibidores da deacetilase

histona (HDACis) são promissoras drogas anticâncer ; No entanto, os mecanismos moleculares que conduzem à morte celular induzida por HDACi não têm sido bem compreendida e não há mecanismo claro da resistência tem sido elucidado de explicar a eficácia limitada da HDACis em ensaios clínicos.

Métodos e Descobertas

Aqui, mostramos que os níveis de proteína da quinase checkpoint 1 (Chk1), que tem um papel importante no G

2 celular regulação do ciclo checkpoint, foi marcadamente reduzida na proteína e níveis de transcrição em células de câncer de pulmão tratados com pan-e seletiva HDACis LBH589, Scriptaid, ácido valpróico, apicidina, e MS-275. Em HDACi células função de Chk1 foi prejudicada, como determinado por fosforilação inibidora diminuiu de cdc25C e a cdc2-alvo a jusante e aumento da expressão de Cdc25A e histona H3 fosforilada, um marcador de entrada mitótico tratada. Em experimentos de evolução no tempo, Chk1 downregulation ocorreu após o tratamento HDACi, precedendo a apoptose. A expressão ectópica de Chk1 venceu a morte celular induzida por HDACi e pré-tratamento de células com o purvalanol inibidor cdc2 A bloqueou a entrada em mitose e impediu a morte celular por HDACis. Finalmente, a inibição farmacológica de Chk1 mostrou um forte efeito sinérgico com LBH589 em células de câncer de pulmão.

Conclusões

Estes resultados definir um caminho através do qual a inibição Chk1 pode mediar HDACi induzida entrada mitótico e morte celular e sugerem que Chk1 pode ser um marcador farmacodinâmico cedo para avaliar a eficácia HDACi em amostras clínicas

citação:. Brazelle W, Kreahling JM, Gemmer J, Ma Y, agrião WD, Haura E, et al. (2010) histona Deacetilase regular negativamente Checkpoint Kinase 1 Expressão para induzir a morte celular em Non-Small Cell Lung Cancer Cells. PLoS ONE 5 (12): e14335. doi: 10.1371 /journal.pone.0014335

editor: Rory Edward Morty, Universidade de Giessen Lung Center, Alemanha |

Recebido: 25 de junho de 2010; Aceito: 26 de novembro de 2010; Publicação: 14 de dezembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Brazelle et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi financiado em parte pela concessão SPORE Moffitt cancer Center, em câncer de pulmão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

histona desacetilase (inibidores HDACIs) representam uma classe nova e promissora de compostos para o tratamento de cancro [1]. Alguns HDACis mostram ampla atividade contra várias classes de HDAC (Scriptaid, LBH589), enquanto outros são de classe, ou isotipo seletivo (MS-275) [1], [2].

Os mecanismos precisos pelos quais HDACIs exercer a sua efeitos citotóxicos são desconhecidos; No entanto, os efeitos antitumorais destes fármacos são pensados ​​para resultar de hiperacetila�o de histonas, desmetilação de ADN genómico, e a activação de genes que inibem a proliferação e induzem a apoptose [1]. Em adição aos seus efeitos epigenética, HDACis também têm demonstrado ter efeitos significativos pós-traducionais sobre proteínas não-histona, incluindo factores de transcrição de p53, a proteína de choque térmico 90 (HSP90), e α-tubulina [3]. Além dos efeitos directos anti-tumorigénica, a supressão da angiogénese por HDACis pode também ter um impacto sobre a inibição do crescimento do tumor [4].

Um passo regulador essencial para o G

2 /H transição do ciclo celular em eucariotas é activação do complexo cdc2-ciclina B [5]. A regulação da cdc2 requer uma fosforilação de activação em treonina-161 e fosfolarização inibidoras sobre treonina-14 e tirosina-15 (Tyr15) [6]. A fosforilação inibitória sobre a Tyr15 mantém o complexo cdc2-ciclina B num estado inactivo se não houver incompletamente ADN replicado ou ADN danificado na célula [7], [8]. activação de Cdc2 através da remoção da sua fosforilação inibidora por fosfatases cdc25 permite que as células entram na fase mitótica do ciclo celular [9]. Chk1 é um componente crítico da replicação do DNA, a fase intra-S, L

2 /M fase e postos de controle do eixo-montagem mitóticas [10]. Em resposta a uma variedade de factores de stress genotóxico, Chk1 torna-se activado por cinases a montante tais como ATM e ATR, levando ao aumento da degradação proteossomal da fosfatase Cdc25A e inibição de cdc25C por meio de serina-216 (Ser216) fosforilação, colectivamente provocando inactivação de cdc2 e consequentemente G

2 /M detenção [10] – [14].

Além disso, combinando HDACis com os reguladores de checkpoint G2 poderia melhorar a eficácia e ajuda na superação de resistência. De facto, a inibição farmacológica ou siRNA knockdown directa de Chk1 tem sido demonstrado causar revogação ponto de verificação, a regressão cytokinetic, e multinucleação, bem como segregação errada dos cromossomas e instabilidade cromossómica [15]. Assim, os inibidores de Chk1, que efectivamente anulam o S e G

2 pontos de controlo, estão a ser investigados em ensaios clínicos, quer isoladamente ou em combinação com agentes citotóxicos [16] – [18] e pode ser eficazmente combinado com HDACi para melhorar os efeitos citotóxicos .

Aqui, demonstramos que o tratamento HDACi regula negativamente a expressão da proteína de Chk1, que por sua vez leva à activação de marcação cdc2, entrada mitótica, e morte celular em células de cancro do pulmão humano. Os resultados deste estudo demonstram que Chk1 downregulation e revogação da G

2 checkpoint são importantes medidas regulamentares em sensibilidade e resistência ao efeito citotóxico do tratamento HDACi em células de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Nossos dados sugerem que Chk1 pode ser um marcador farmacodinâmica cedo para prever e avaliar a eficácia do HDACis e inibidores de Chk1 pode aumentar os efeitos citotóxicos de HDACis em estudos clínicos.

Resultados

O tratamento de células NSCLC com HDACis provoca G

2 /M paragem do ciclo celular e morte celular

estudos anteriores demonstraram que uma pan-HDACi LBH589 (IC

50 que varia entre cerca de 9 e 54 nmol /L) faz com que a paragem do crescimento e morte celular em células NSCLC [19]. Para analisar os mecanismos moleculares pelos quais HDACIs regular a progressão do ciclo celular e a morte celular, de forma assíncrona crescente A549 (tipo EGFR selvagem, K-ras mutante, e p53 do tipo selvagem) e PC9 (mutante de EGFR, K-ras tipo selvagem e mutante p53) [20] – [22], as células foram tratadas com LBH589 (40 nM) durante 24 horas e colhidas para análise de citometria de fluxo. A Figura 1 mostra que, em células A549 e PC9 LBH589 tratamento produziu um aumento significativo nas células em G

2 /H de fase sugestivo de um L

2 /H bloqueio e uma redução significativa em células em fase S. Estes resultados estão de acordo com os relatórios anteriores que HDACis levar a G

2 /M detenção e morte celular por apoptose em células NSCLC [19].

A

, as células de forma assíncrona em crescimento foram incubadas em meio com FCS a 5% durante 24 horas na ausência (controlo, C) ou na presença (L) de LBH589. A percentagem de células em diferentes fases do ciclo celular foi determinada por análise de citometria de fluxo.

B

, representação de dados do histograma do ciclo celular determinada por análise de citometria de fluxo.

Tal como ilustrado na Figura 2A, o exame microscópico das células tratadas com LBH589 produzida uma gama de morfologias nucleares diferentes, de binucleação para multinucleações. Tomados em conjunto, estes dados mostram que o tratamento LBH589 provoca a morte celular associada com a mitose anormal e não a citocinese, o que é sugestivo de uma catástrofe mitótica, um tipo de morte celular que ocorre durante a mitose e anteriormente foi descrito em células tratadas com o HDACi tricostatina A [ ,,,0],23].

células A549 foram tratadas com veículo (controlo) ou 40 nM LBH589 durante 24 horas.

A

, setas indicam células bi ou multinucleadas com citocinese prejudicada em células NSCLC tratados com LBH589.

B

, as células foram fixadas e coradas com DAPI ou clivado poli (ADP-ribose) polimerase (cPARP) anticorpo (× 100 ou 400 × de ampliação).

C

, análise de Western blot demonstrando que a inibição de HDAC por LBH589 provoca a fosforilação da histona H3 (H3-P10), histonas H4 acetilação (acetil-H4), e clivagem PARP (cPARP) em células A549 tratadas com LBH589 para 24 horas. β-actina foi utilizado como controlo de carga.

Uma vez que as células do L

2- e M-fase não puderam ser discriminados com base nas suas diferenças em conteúdo de ADN por citometria de fluxo, foi testada se as células presos em L

2 /M após o tratamento HDACi entrar na fase mitótico. Para este fim, primeiro executada coloração por imunofluorescência, utilizando o anticorpo contra o poli clivado (ADP-ribose) polimerase (cPARP) e mostraram que o tratamento LBH589 provoca a morte celular por apoptose em 78% das células mitóticas binucleadas (Figura 2B). Em seguida, em análise de transferência de Western foi testado se a inibição de HDAC aumenta a fosforilação de histona H3 na serina-10, que tem lugar no inicio da mitose. A Figura 2C ilustra que o tratamento LBH589 causada fosforilação da histona H3 acompanhado pelo aumento da acetilação de histonas e a clivagem de PARP, indicando que o tratamento HDACi faz com que células NSCLC de introduzir a mitose e a sofrer morte celular. Para determinar se o crescimento de células e alterações de viabilidade observada após tratamento LBH589 são um efeito generalizado de inibição de HDAC, também utilizado outro sistema pan-HDACi, Scriptaid (1 uM), que produziu alterações bioquímicas indistinguíveis dos apresentados acima utilizando LBH589 (Figura 3).

a

, A549, PC9, H1299, H292, H358, H441 e HCC827 células foram cultivadas na presença de veículo (C), ou LBH589 (LBH) 40 nM durante 24 horas e níveis de cPARP, fosforilação de CDC2 (pCDC2

Y15), CHK1, e histona H4 acetilada (acetil-H4) de expressão foram determinados por Western blot e quantificada utilizando software de AlphaEase. p-actina foi utilizado como controlo de carga. células

B

, PC9 e A549 foram cultivadas na presença de veículo (C), ou LBH589 (LBH) 40 nM, ou Scriptaid (S) 1 uM durante 24 horas e os níveis de expressão cPARP, tirosina-15 fosforilação de CDC2 (pCDC2

Y15), serina-216 fosforilação de cdc25C (pCDC25c

S216), Cdc25A (T-Cdc25A), cdc25C (T-cdc25C) e CDC2 (T-CDC2), acetilado histona H4 ( acetil-H4), e ciclina B1 foi determinada por análise de Western blot. p-actina foi utilizado como controlo de carga.

C

, alterações mediadas por drogas na expressão de CHK1, CHK2, AKT, e c-RAF foram determinados por análise de Western blot. p-actina foi utilizado como controlo de carga.

D

, células PC9 ou A549 foram tratadas com ou sem 40 nM LBH589 e analisados ​​para células positivas para anexina utilizando o BD Anexina V-FITC /7-AAD kit de Citometria de Fluxo.

E

, células A549 foram tratados com EM-275 (MS), (500 nM), o ácido valpróico (VA) (1 mM), ou apicidina (API) (400 nM) durante 24 h. Os níveis de expressão de cPARP, CHK1, pCDC2

Y15, e β-actina foram determinados por análise de Western blot. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes.

de inibição de HDAC resulta na activação de proteínas cdc25 e cdc2 que são necessários para mitótico entrada

A activação da proteína cinase cdc2 pela proteína cdc25 fosfatases é um passo regulador crucial para o G

2 /H transição em eucariotas [9]. A desfosforilação de cdc25C em Ser216 aumenta a sua actividade durante a transição M-fase, que conduz à activação da cinase cdc2 [10]. Para investigar se-induzida HDACi entrada mitótico e morte celular são mediados através da activação da via de cdc25 /cdc2, PC9, A549, H1299, H292, H358, H441 e HCC827 células foram tratadas com ou sem LBH589, e análise de Western blot foi realizada. A Figura 3A mostra HDACi tratamento resultou no aumento dos níveis de clivagem de PARP, um decréscimo na fosforilação inibitória sobre a cdc2 e 45-94% de diminuição (baseado em análise de mancha de Western quantitativa) no total de Chk1 entre as 7 linhas celulares diferentes de NSCLC, com A549s mostrando o mais decréscimo significativo na proteína de Chk1. Estas alterações são todas associadas com um aumento da acetilação da histona. Outras investigações de células A549 e PC9 tratados com HDACis pan (Figura 3B), LBH589 e Scriptaid, mostrou activação de cdc25C e cdc2, tal como avaliado por uma diminuição da sua fosforilação inibitória sobre a Ser216 e Tyr15, respectivamente, os quais foram acompanhados por aumento da histona H4 acetilação. Nenhuma redução foi observada nos níveis de proteínas totais cdc25C e cdc2 (Figura 3B) Expressão. Estes resultados indicam que a entrada de mitose induzida por HDACi é mediada pelo aumento da actividade de cdc25 /cdc2. Além disso, o tratamento HDACi também aumentou o nível de Cdc25A, que é alvo de Chk1 para degradação rápida (Figura 3B) expressão. Estes dados demonstram que, em células tratadas com HDACi, a função biológica de Chk1 foi inibida.

Além fosforilação na posição Tyr15, outro importante mecanismo de regulação da actividade de cdc2 e a progressão para a fase mitótica do ciclo celular é o seu complexo formação com ciclina B, um cofactor necessário para a actividade de cdc2-quinase. Assim, o próximo determinado se o tratamento HDACi afeta os níveis de expressão B ciclina. Tal como mostrado na Figura 3B, as células tratadas com NSCLC LBH589 ou Scriptaid exibida mais elevados os níveis globais de expressão da ciclina B1. Tomados em conjunto com a fosforilação Tyr15 diminuiu de cdc2, esta conclusão implica uma atividade B alta cdc2-ciclina em células tratadas com HDACi, proporcionando mais apoio que as células tratadas com HDACis são capazes de entrar mitose.

A inibição da actividade de HDAC correlaciona-se com a diminuição da expressão de Chk1 em células NSCLC

a ordem e fidelidade do ciclo celular estão ligadas à integridade do Chk1 e vias fosfatase cdc25. Manutenção da via /cdc25 Chk1 é essencial para que as células normalmente progridem através de um ciclo de divisão celular perturbado e para células de prender em resposta à activação de ponto de verificação [10].

Para determinar o papel de Chk1 em HDACi induzida activação de cdc25C, cdc2 e, analisou-se as alterações nos níveis de proteína de Chk1 em células tratadas com HDACis. A análise de imunotransferência mostrou que o tratamento com LBH589 ou Scriptaid provoca uma diminuição significativa na expressão de proteína de Chk1 (Figura 3C). Esta inibição parece ser específica uma vez que não foi observada alteração na expressão da proteína Chk2, outro regulador de checkpoint de DNA-danos via [10] sinalização, [11].

HDACis, incluindo LBH589, têm sido relatados para funcionalmente inactivar HSP90 através de acetilação da proteína, conduzindo ao esgotamento das proteínas do cliente, tais como AKT e c-RAF [22]. Curiosamente, a proteína de Chk1 tem também sido relatada como sendo um cliente HSP90 [24], [25], sugerindo que a inactivação de HSP90 por HDACis pode ser responsável pela degradação de Chk1 observados nas nossas experiências. Para testar esta possibilidade, foi analisado se a regulação negativa de Chk1 coincide com a diminuição da expressão de AKT e c-RAF em extractos preparados a partir de células tratadas com LBH589 ou Scriptaid. Tal como ilustrado na Figura 3C, não foram observadas alterações nos níveis de expressão de proteínas AKT ou C-RAF, nas condições em que LBH589 e Scriptaid causada Chk1 regulação negativa.

Para demonstrar ainda mais o efeito citotóxico do tratamento HDACi em células NSCLC medida que a morte celular apoptótica utilizando Anexina V detecção. Tal como mostrado na Figura 3D, as células A549 e PC9 mostrou um aumento medido na quantidade de células positivas para anexina, indicando que o tratamento com HDACi resulta em aumento significativo em células que sofrem apoptose.

Para determinar se HDACis selectivos também causar inibição de Chk1 , células A549 e PC9 foram tratados com eM-275, que inibe selectivamente a HDAC1, e em menor grau HDAC3. Tal como ilustrado na Figura 3E, o MS-275 (0,5 uM) produziu alterações na expressão de Chk1, cdc2 fosforilada (Tyr15), e cPARP semelhante aos resultados observados com LBH589 e Scriptaid. Dois outra classe I HDACIs ácido valpróico (1 mM) e apicidina (400 nM) resultados idênticos também produzidos (Figura 3E). Estes dados demonstram que HDACi mediada por regulação negativa de Chk1 não é dependente de drogas e as HDACs de classe I são susceptíveis de mediadores HDACi o efeito sobre a regulação negativa de Chk1 em células NSCLC.

Chk1 revogação precede a iniciação da apoptose por LBH589

Chk1 tem sido relatado para ser sujeito a degradação mediada por caspases em células que sofrem morte celular apoptótica [26]. Por conseguinte, foram analisados ​​em experiências de curso de tempo se a regulação negativa da proteína de Chk1 observada em células tratadas com HDACi é a causa ou a consequência de morte celular por apoptose. Como mostrado na Figura 4A, o tratamento de células A549 com LBH589 levou a uma diminuição de 70% em proteínas de Chk1 no prazo de 1 hora de tratamento, com base na quantificação de manchas de Western, que foi acompanhada pela diminuição da fosfo-cdc25C (Ser216) e fosfo-cdc2 ( Tyr15) níveis consistentes com a inativação funcional da atividade Chk1. De importância, estas mudanças ocorreram antes da activação da caspase detectável, tal como evidenciado pela clivagem de PARP que foi observado pela primeira vez em 12 horas de tratamento. Um perfil semelhante curso de tempo foi observado em células tratadas com PC9 LBH589 ou Scriptaid (dados não mostrados).

células A549 foram não tratadas ou tratadas com LBH589 (40 nM) para vários pontos de tempo. Os lisados ​​celulares foram preparados, e os níveis de cPARP, CHK1, Tyr15 fosforilação de pCDC2 (pCDC2

Y15), Ser216 fosforilação de Cdc25C (pCDC25

S216), acetil-H4 da expressão da proteína, e ciclina B1 foram determinados.

B

, análise de expressão quantitativa Chk1 mRNA. O ARN total foi preparado a partir de células A549, após 24 horas de tratamento com 40 nM LBH589 ou veículo. Os níveis de expressão de mRNA foram quantificados utilizando a análise por PCR em tempo real. Todos os resultados foram normalizados para os níveis de mRNA GAPDH, e os valores médios e desvios-padrão de quatro experimentos independentes são mostrados.

C

, expressão ectópica de Chk1 inverte a apoptose induzida por HDACi mas não acetilação das histonas. As células A549 foram transfectadas transitoriamente com um vector vazio (controlo) ou GFP ou marcaram-FLAG (GFP-CHK1 ou FLAG-CHK1) o plasmídeo de expressão de Chk1. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram cultivadas sem (controlo, C) ou com LBH589 (L) (40 nM) durante um adicional de 24 horas antes da colheita para análise de Western blot. mudanças induzidas pelo tratamento em cPARP, acetil-H4, fosfo-CDC2

Y15 e ectopicamente expressa GFP-CHK1 ou proteínas Bandeira-CHK1 foram determinados por análise de Western blot. expressão de p-actina foi utilizado como controlo de carga. As experiências foram repetidas 3 vezes, e uma experiência representativa é mostrada. As setas indicam a posição da GFP-CHK1 e proteínas Bandeira-CHK1.

D

, em amostras de pacientes com NSCLC primários, regulação baixa proteína Chk1 se correlaciona com o aumento cPARP

ex vivo

. As amostras de tumor foram recolhidas com uma agulha de calibre 23 a partir de tumores derivado do paciente, e as células foram tratadas em duplicado com veículo (controle) ou LBH589 (40 nM) durante 18 horas. Após o tratamento, as células aderentes e não aderentes foram reunidas, os extractos celulares foram preparados, e os níveis de cPARP, Chk1, e acetil-H3 de expressão foram analisados ​​por Western blot. expressão de p-actina foi utilizado como controlo de carga. SCC: carcinoma de células escamosas; AC:.. Adenocarcinoma

Em conjunto, estes resultados suportam um modelo em que a inibição da expressão Chk1 por HDACis leva à morte celular através da ativação marcação da cdc2-quinase promover a mitose em células NSCLC

tratamento HDACi leva à regulação negativa da transcrição de Chk1

para determinar se o tratamento HDACi regula a expressão de Chk1 ao nível da transcrição em células NSCLC, foi realizada PCR em tempo real. Tal como ilustrado na Figura 4B, a análise quantitativa de ARN revelou mais do que uma redução de 50% nos níveis de ARNm de Chk1 em células A549 24 horas após o tratamento LBH589 (40 nM). Esta descoberta demonstra que o tratamento HDACi leva a transcrição repressão da Chk1 em células NSCLC.

A expressão ectópica de Chk1 supera induzida por LBH589 apoptose

Para determinar a importância de Chk1 downregulation no celular por apoptose induzida por HDACi morte, que teve como objetivo determinar se a expressão ectópica de Chk1 pode superar a morte celular desencadeada por LBH589. Portanto, as células A549 foram transfectadas transitoriamente com um plasmídeo que codifica uma proteína de Chk1 Chk1 fusão GFP. Tal como mostrado na Figura 4C, a expressão transiente da proteína de Chk1 ectópica suprimiu a apoptose induzida por LBH589, tal como detectado pela proteína de clivagem de PARP. Além disso, em células que expressam ectópica de Chk1, tratamento LBH589 não conseguiram activar cdc2, tal como avaliado por desfosforilação Tyr15 (Figura 4C), enquanto não foram observadas alterações na acetilação de histona-induzida HDACi. Dados semelhantes foram obtidos com um plasmídeo de expressão de Chk1 marcada com Flag em células NSCLC (Figura 4C). Estes resultados indicam que Chk1 downregulation desempenha um papel essencial na morte celular HDACi mediada.

Chk1 downregulation correlaciona-se com a morte celular por apoptose em células NSCLC primários tratados com LBH589

ex vivo

Para verificar a regulação baixa de Chk1 em amostras de tumor clinicamente relevantes, as células tumorais recolhidas de tumores de pacientes com NSCLC foram tratadas ex vivo com LBH589. As proteínas totais foram extraídas e alterações mediados por drogas na expressão de Chk1, acetilação da histona, e clivagem PARP foram analisados ​​por Western blot. Tal como ilustrado na Figura 4D, o tratamento ex vivo de células com LBH589 (40 nM) causou aumento da histona H4 acetilação em todas as amostras de tumor, enquanto que, o tratamento LBH589 clivagem de PARP aumentada em apenas 2 de cinco amostras, que se correlaciona intimamente com a regulação negativa de Chk1. Tais resultados corroboram os resultados apresentados acima, com linhagens de células NSCLC e sugerem que a diminuição da Chk1 e fosfo-cdc2 (Tyr15), os níveis podem ser marcadores farmacodinâmicos sensíveis para eficácia HDACi em amostras de tumores de pacientes para prever e avaliar a resposta do paciente ao tratamento HDACi em estudos clínicos.

morte celular HDACi mediada requer mitóticas entrada

Os dados apresentados acima do suporte de um modelo em que a falha de activação do ponto de verificação Chk1 mediada desempenha um papel essencial na morte celular HDACi mediada. Deste modo, os autores sugerem que o bloqueio da entrada mitótico iria diminuir a sensibilidade das células de cancro aos efeitos citotóxicos de tratamento HDACi. Para testar esta hipótese, as células A549 foram pré-tratadas com um inibidor de cdc2 potente, purvalanol A [27], para bloquear a entrada em mitose. A análise de citometria de fluxo mostra que 40 nM LBH589 durante 24 horas provocou um aumento significativo de células em G

2 /M e um aumento de aproximadamente 20 vezes o número de sub-G

1 pico (células hipodiploidia) após 24 horas de tratamento, consistente com o aumento da morte celular. O aumento na sub-L

uma população após o tratamento LBH589, contudo, foi significativamente reduzida pelo pré-tratamento das células com purvalanol A (Figura 5), ​​indicando que o bloqueio mitótico faz com que a resistência aos efeitos citotóxicos de LBH589. Para confirmar esta observação, foi realizada a análise de mancha de Western com extractos preparados a partir de células A549 expostos a LBH589 com ou sem um pré-tratamento purvalanol. A Figura 5 ilustra que purvalanol A morte celular por apoptose induzida por LBH589 inibida pré-tratamento, tal como medido por cPARP, proporcionando mais apoio que HDACi induzida morte celular requer em grande medida a entrada em mitose.

As células tratadas com LBH589 40 nM com ou sem purA (10 uM) de pré-tratamento foram analisadas por citometria de fluxo para a distribuição do ciclo celular ou através de Western blot para determinar mudanças mediadas por drogas em cPARP. β-actina foi utilizado como um controlo de carga.

inibidores de HDAC e Chk1 mostram um efeito sinérgico em células NSCLC

Os nossos resultados mostraram que os alvos de tratamento HDACi de Chk1 para induzir inadequado mitótico entrada e assim, exerce os seus efeitos citotóxicos em células tumorais. A sensibilidade diminuída das células para o tratamento HDACi observada em células A549 que expressam ectopicamente de Chk1 (Figura 4C) sugere que a activação de cinases Chk1 e a sua via de sinalização a jusante, os quais controlam o G

2 ponto de controlo, podem causar resistência à terapia HDACi. Assim, é plausível que os inibidores de Chk1 pode potenciar efeitos citotóxicos de HDACis em células de tumor que são resistentes à HDACis. Para testar esta possibilidade, células A549 foram tratadas com LBH589 e um inibidor de Chk1 (UCN-01) durante 24 horas. A Figura 6A mostra que, em baixas concentrações, não LBH589 (4 nM) ou UCN-01 (250 nM) sozinho pode causar a clivagem de PARP em células A549, ao passo que a combinação das duas drogas aumentou drasticamente clivagem da proteína PARP, sugerindo um potencial de sinergia. Para corroborar a interacção sinérgica entre os inibidores de HDAC e Chk1, nós próxima realizadas análises efeito dose média. Para este fim, as células A549 foram expostas a concentrações crescentes de LBH589, UCN-01, ou a combinação destas drogas numa relação fixa. A viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio de CT-Blue, e o efeito foi analisada utilizando análise de efeito mediano. Como mostrado nas Figuras 6B e 6C, a exposição das células à combinação de inibidores do Chk1 e LBH589 exerceu um efeito sinérgico forte. Usando estes mesmos métodos, também de uma interacção sinérgica entre LBH589 foi visto e um novo inibidor de Chk1 AZD7762 [28] em células NSCLC que resultou num valor de CI 0,76 indicativo de um efeito sinérgico moderadamente (dados não mostrados).

um

, células A549 foram tratadas com 40 nM LBH589 e /ou um a UCN-01 (250 nM) durante 24 horas, foram preparados extractos celulares, e análise de Western blot foi realizada com PARP (T: total, C: clivada). As experiências foram repetidas pelo menos 3 vezes, e uma experiência representativa é mostrada.

B

, células A549 foram tratadas com LBH589 e UCN-01, quer isoladamente ou em combinação a uma razão constante (1:40) durante 72 horas. As concentrações de fármaco são indicados no eixo horizontal e representada graficamente contra a viabilidade celular de poços de controlo, que foi arbitrariamente fixados em 100% de viabilidade para cada experimento. As barras de erro representam SD ± de 4 poços em duplicado.

C

, efeitos combinados de LBH589 e Chk1 inibidor da UCN-01 foram quantificados com o índice de Chou e Talalay combinação (CI) método (40). A CI usado para combinação de drogas análises foi determinada pela equação isobolograma (ver texto). símbolos Ranking (+/-) indicam a variação média calculada Chou e Talalay índice de combinação (CI) (+++, forte sinergismo).

Os dados apresentados acima sugerem que as drogas inibindo a atividade de proteínas que regular negativamente a função do complexo cdc2-ciclina B pode aumentar a G

2 revogação ponto de verificação e os efeitos citotóxicos da HDACis em células tumorais.

Discussão

estudos anteriores demonstraram que HDACi induzida morte celular está associada com a mitose anormal e ruptura dos pontos de verificação do ciclo celular [29] – [34]. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais o tratamento HDACi mitótica leva a morte celular não é bem compreendido. Aqui, demonstramos que o tratamento HDACi de células NSCLC humanas conduz a regulação negativa do total de níveis de proteína de Chk1. Mostrámos que esta regulação negativa é biologicamente relevantes, demonstrando uma redução concomitante nos níveis de fosforilação do inibidor de chave do ciclo celular de cdc25C proteínas reguladoras e cdc2. Os níveis diminuídos de proteína total de Chk1 indução de apoptose e a acetilação da histona precedida, demonstrando que a regulação negativa de Chk1 é um evento precoce em modo HDACi de acção e que desempenha um papel essencial na morte celular mediada por drogas

.

expressão de Chk1 tem sido mostrado a flutuar durante o ciclo celular [35]. No entanto, uma vez que Chk1 é expresso principalmente no S para H de fase do ciclo celular em ambos os níveis de RNA e proteína [35], é improvável que a inibição HDACi-mediada de Chk1 é uma consequência da paragem do crescimento em G

2 /fase M. experiências de RT-PCT demonstrado que a inibição da transcrição de Chk1 desempenha um papel importante na regulação HDACi mediada por proteína de Chk1. O mecanismo pelo qual HDACIs regular a expressão transcricional de Chk1 é desconhecida e continua por ser elucidado.

O tratamento de células tumorais com HDACis pan tem sido relatado como causador de acetilação da Hsp90 através da inibição da HDAC6 e exaustão de vários cliente Hsp90 proteínas, incluindo AKT e c-RAF [22], [36], [37]. Os nossos resultados mostraram que, sob as condições em que LBH589 induzidas Chk1 regulação negativa, não foi observada inibição dos níveis de AKT e c-RAF expressão. Além disso, os inibidores de HDAC selectivos ácido valpróico, apicidina e MS-275 sem efeitos inibidores conhecidos na HDAC6 foram capazes de inibir a expressão de Chk1. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a inibição da expressão de Chk1 em células tratadas com HDACi provavelmente não é mediada por inactivação da proteína HSP90, mas é sim devido a repressão da expressão de CHK1.

Um dos principais desafios no desenvolvimento de HDACis é a definição dos pontos de extremidade relevantes clinicamente para avaliar a eficácia do fármaco em tumores de doentes na fase inicial do tratamento para prever o resultado clínico. No presente estudo, mostrou que a regulação negativa do total de níveis de proteína muito mais Chk1 correlaciona fortemente com a indução de efeitos citotóxicos, em vez de com hiperacetila�o histona em ambas as linhas de células e nas células NSCLC primários obtidos a partir de tumores de pacientes ex vivo. Juntos, esses resultados sugerem que a regulação baixa de Chk1 e Tyr15 fosforilação de níveis cdc2 podem ser marcadores farmacodinâmicos sensíveis e clinicamente relevantes de eficácia de HDACis.

Apesar de sua promessa como uma terapia do cancro emergente, em ensaios clínicos, a eficácia da HDACis tem sido limitado, e nenhum mecanismo claro da resistência tem sido elucidado [1]. Os nossos resultados actuais proporcionam uma possível visão sobre o mecanismo de acção HDACi e resistência. Nós mostramos que a expressão ectópica de Chk1 e prevenção de entrada mitótico por um inibidor de cdc2 purvalanol Um diminuída de morte celular induzida por LBH589. Estes achados sugerem que o nível de expressão de Chk1 ou estado de activação de enzimas que regulam a entrada de fase M, tal como o complexo de cdc25 e ciclina B-cdc2, podem desempenhar um papel importante na determinação da sensibilidade ou resistência de células tumorais a HDACis. Os dados aqui apresentados sugerem um modelo onde a entrada mitótico é um passo necessário para a morte celular HDACi mediada. Além disso, os mecanismos celulares que bloqueiam Chk1 regulação baixa e /ou desvio Chk1 e atuam diretamente no G

controle de 2 ponto de verificação para evitar que as células de entrar em fase de mitose poderia causar resistência a HDACis. Por exemplo, Chk1 tem sido mostrado para ser altamente expressa em tumores NSCLC [38], que pode conferir resistência a entrada mitótica induzida HDACi e morte celular. Assim, em tumores com o aumento da actividade de Chk1, combinações racionais de HDACis com drogas que inibem simultaneamente Chk1 e as suas vias de sinalização a jusante que controlam L

2 /M do ciclo celular ponto de verificação pode aumentar os efeitos citotóxicos do HDACis.

HDACis demonstraram sinergia com agentes de ADN danificar [1]. No entanto, os mecanismos moleculares da sinergia não têm sido bem compreendido.