Abstract
Purpose
Apesar do advento de terapias aprovadas pela FDA para um número limitado de destinos disponíveis (cinases e mTOR), PFS de cancro do rim (RCC) foi apenas um estendida a dois anos, devido ao desenvolvimento de resistência ao fármaco. Aqui, nós avaliar uma terapêutica inovadora para RCC que tem como alvo o inibidor exportina-1 (XPO1).
Materiais e Métodos
células RCC foram tratadas com o inibidor XPO1 por via oral disponíveis, KPT-330, e a viabilidade celular e anexina V (apoptose) os ensaios, e ciclo celular as análises foram realizadas para avaliar a eficácia de KPT-330 em duas linhas celulares de RCC. Imunotransferência e análise de imunofluorescência foram realizadas para validar os mecanismos de inibição XPO1. A eficácia e efeitos sobre-alvo de KPT-330 foram ainda analisados in vivo em murganhos de xenoenxerto de CCR, e as células resistentes a KPT-330 foram estabelecidas para avaliar potenciais mecanismos de resistência KPT-330.
Resultados
KPT-330 viabilidade atenuada CCR através de inibição do crescimento e indução da apoptose tanto in vitro e in vivo, um processo no qual o aumento de localização nuclear de p21 por XPO1 inibição desempenhou um papel importante. Além disso, KPT-330 células resistentes permaneceram sensíveis ao actualmente aprovado para RCC inibidores multi-cinase (sunitinib, sorafenib) e inibidores de mTOR (everolimus, temsirolímus), sugerindo que estas terapias orientadas permaneceria útil como segundo terapêutica linha seguinte KPT-330 tratamento.
Conclusão
O inibidor XPO1 oralmente disponíveis, KPT-330, representa um novo alvo para RCC cuja eficácia in vivo aproxima-se de sunitinib. Além disso, as células resistentes a KPT-330 conservam a sua capacidade de responder à terapêutica RCC disponíveis sugerindo uma nova abordagem para tratamento em KPT-330-naïve, bem como pacientes com CCR resistentes ao
Citation:. Wettersten HI, Landesman Y, Friedlander S, Shacham S, Kauffman M, Weiss RH (2014) inibição específica do Exportador Nuclear exportina-1 Atenua Crescimento cancro do rim. PLoS ONE 9 (12): e113867. doi: 10.1371 /journal.pone.0113867
editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 23 de junho de 2014; Aceito: 31 de outubro de 2014; Publicação: 02 de dezembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Wettersten et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health concede 5UO1CA86402, 1R01CA135401-01A1 e 1R01DK082690-01A1 e por Karyopharm Therapeutics. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:. Enquanto algum do trabalho foi financiado, e alguns dos autores empregado, por Karyopharm , isso não altera a adesão dos autores para PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento. Além disso, nenhuma das experiências ou conclusões do trabalho foram influenciados de forma alguma pelo Karyopharm
Introdução
O cancro do rim (carcinoma de células renais; RCC). É o 13
th mais câncer comum em todo o mundo e é um dos poucos cancros cuja incidência está a aumentar, a encontrar não apenas devido às técnicas de diagnóstico melhorados [1], [2]. Os sinais e sintomas de RCC frequentemente são subtis ou mesmo ausente, de tal modo que mais de metade dos pacientes são diagnosticados incidentalmente, e muitas vezes na fase metastático, enquanto está a ser avaliado para outras doenças tais como lesão renal aguda [3]. Enquanto a sobrevivência de cinco anos para aqueles que se apresentam com RCC localizada é mais do que 70%, para aqueles com doença metastática, a sobrevivência de cinco anos cai para um lúgubre 16 para 32%. Cerca de metade dos pacientes com CCR desenvolver doença avançada e exigem terapia sistêmica. Apesar do advento de diversas terapias aprovadas pela FDA direcionados ao longo dos últimos anos, que são limitados a inibidores da multi-quinase e inibidores de mTOR, sobrevivência livre de progressão (PFS) é estendido apenas um a dois anos com estas terapias-alvo em grande parte devido ao desenvolvimento de resistência a drogas [4]. Assim, é crítico para o desenvolvimento de novas terapias para outros alvos que cinases e da via mTOR
p21 foi originalmente descrito como um inibidor dependente de ciclina-cinase (CKI) de ciclina-CDK2, -CDK1, e. – CDK4 /6 complexos cuja expressão é classicamente regulada por p53 [5]. No entanto, ao longo dos anos, tem sido demonstrado que têm pleiotrópico, e, por vezes, aparentemente contraditório, efeitos sobre a proliferação celular, a apoptose, senescência e no cancro e na doença vascular independente de p53 [5], [6]. Em geral, quando a p21 está localizada dentro do núcleo, que se liga aos complexos de ciclina-CDK inibindo desse modo a sua função na progressão do ciclo celular, resultando na paragem do ciclo celular [5]. No entanto, quando a p21 está localizada dentro do compartimento citosólico, que inibe a apoptose por complexação com proteínas pró-apoptóticos tais como pró-caspase-3 ou ASK [7], [8]. Consistente com esses mecanismos putativos, trabalho anterior no nosso laboratório demonstrou que o aumento da p21 citosólica é um indicador de mau prognóstico em pacientes com CCR [9], um achado também observado em outros tipos de câncer [10], [11].
o exportador nuclear, exportin11 (XPO1; CRM1), controla a localização nucleo-citoplasmático de mais de 200 nuclear Export sinal (NES) proteínas molecular contendo, muitas das quais são proteínas supressoras de tumor (PAT), incluindo p21 [12]. Foi anteriormente demonstrado que os inibidores XPO1 ter um efeito terapêutico em carcinoma de células renais [13]. Neste estudo, testou-se a eficácia de KPT-330, o inibidor oralmente disponível XPO1 que é correntemente na fase I /II de ensaios clínicos para avaliar o seu potencial clínico, quer isoladamente ou como tratamento de combinação, no CCR avançado. Vamos agora mostrar que, provavelmente através de um mecanismo relacionado a localização subcelular de p21, este inibidor XPO1 oralmente disponíveis representa uma nova atuação terapêutica viável em um alvo não foi testado até agora em RCC.
Materiais e Métodos
cultura celular
as linhas de células RCC e ACHN 786-o foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e regularmente avaliados quanto à presença de Mycoplasma. As células normais de rim humano proximal epitelial (NHK) foram obtidos a partir de Lonza (Allendale, NJ). Todas as células foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 unidades /mL de estreptomicina, e 100 mg /mL de penicilina em 5% de CO
2 a 37 ° C. Estas duas linhas celulares foram escolhidas para examinar a eficácia de KPT-330 em ambas as células de tumor primárias derivadas (786-O, o que pode ser considerado “precoces” tumores)., Bem como células metastáticas (ACHN)
Materiais
Lipofectamine RNAiMAX reagente de transfecção, Furtivo RNAi controle negativo siRNA, eo discrição RNAi XPO1 siRNA foram obtidos em Life Technologies (Grand Island, NY). KPT-330 foi sintetizado por Karyopharm Therapeutics (Natick, MA). Sunitinib e sorafenib base livre foram obtidos a partir LC Laboratories (Worburn, MA). Everolimus e temsirolimus foram presentes de Dr. Prasit em Ciências Inception (San Diego, CA). Dimetil sulfóxido (DMSO) e o anticorpo monoclonal de ratinho anti-β-actina foram obtidos a partir de Sigma (St. Louis, MO). anticorpo anti-XPO1 policlonal de coelho e o anticorpo anti-p53 monoclonal de ratinho foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). anticorpo anti-p21WAF1 /Cip monoclonal de ratinho foi obtido a partir da Millipore (Billerica, MA). Coelho anticorpo monoclonal anti-p21WAF1 /Cip e IgG anti-coelho (H + L), F (ab ‘) 2 (Alexa Fluor 488 conjugado) foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). De cabra anti-ratinho e de cabra HRP anti-coelho conjugado de IgG foram obtidos a partir de Bio-Rad (Hercules, CA). Vectashield HardSet Meio de montagem com DAPI foi obtido a partir de Vector Laboratories (Burlingame, CA).
KPT-330, sunitinib, sorafenib, everolimus, e temsirolímus foram dissolvidos em DMSO para estudos in vitro. KPT-330 foi combinado com veículos Poloxamer 188 (Pluronic F68; obtido a partir de Spectrum Laboratory Products, Inc.) e PVP K-29/32 (Plasdone K-29/32; obtido a partir de tecnologias ISP, Inc.) em solução e foi sunitnib Dissolveu-se em óleo vegetal para o estudo in vivo.
imunotransferência
imunotransferência foi como descrito anteriormente [14]. Em resumo, após os tratamentos apropriados, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS), lisadas em tampão de lise, e os lisados celulares foram coradas imunologicamente. As membranas foram bloqueadas em 5% de leite em pó desnatado durante uma hora à temperatura ambiente e sondadas com anticorpos apropriados. As membranas foram então sondadas com HRP com etiquetas anti-rato ou IgG anti-coelho. O sinal foi detectado utilizando soluções de quimioluminescência aumentada (ECL). análise de densitometria foi realizada utilizando o software ImageJ 1,440 (https://imagej.nih.gov/ij) e, após a normalização para o controlo de carga (β-actina) é indicado por cima de cada imunotransferência.
Imunofluorescência
Após tratamento indicado em oito lâminas de câmara bem, imunofluorescência foi realizada como descrito anteriormente [14]. Resumidamente, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% e colocado em tampão de bloqueio. Subsequentemente, as células foram incubadas com o anticorpo indicado, incubadas com IgG anti-coelho (H + L), F (ab ‘)
Fragmento 2 (Alexa Fluor 488 conjugado), e lamínulas com Vectashield com DAPI. As amostras foram examinadas por microscopia confocal.
ensaio MTT
ensaio de viabilidade celular foi realizada como descrito anteriormente [14]. Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços, e após os tratamentos apropriados, as células foram incubadas numa solução de MTT mistura /meios. Em seguida, a solução de MTT foi removida e o precipitado cristalino azul em cada cavidade foi dissolvido em DMSO. absorção visível de cada poço a 540 nm foi quantificada utilizando um leitor de microplacas.
análise do ciclo celular
análise do ciclo celular foi realizada utilizando o celular MUSE Analyzer (Millipore, Billerica, MA) seguinte do fabricante instrução. Em resumo, após os tratamentos indicados, as células foram lavadas com PBS e coradas com iodeto de propídio (PI). Após a coloração, as células foram processadas para análise do ciclo celular
anexina V ensaio
anexina V Ensaio celular mortos foi realizada utilizando o celular Analyzer MUSE seguindo as instruções do fabricante. Em resumo, após os tratamentos apropriados, as células foram incubadas com Anexina V e inoperante Reagente celular (7-AAD) e os eventos de células mortas, tarde apoptóticas, apoptóticas cedo, e vivos foram contados.
A imuno-histoquímica
imunohistoquímica
Biogenex i6000 automatizado foi usada para realizar IHC em xenoenxertos embebidos em parafina fixadas em formalina. Antígeno foi recuperado por vaporização com Cell Marque Declere reagente. Background foi bloqueada com bloco Fonte Biogenex. O anticorpo primário foi aplicado durante 1 hora à temperatura ambiente, seguido por detecção com o de duas etapas, kit de Hi-Def Detecção de polímero celular Marque, seguido pela Cell Marque DAB cromagénio. As amostras foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas, clareou e lamínulas. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: p21 (Abcam) e Ki67 (Cell Marque). O kit Millipore apoptose foi usado acordo com o protocolo dos fabricantes.
siRNA transfecção
Lipofectamine RNAiMAX reagente de transfecção foi misturado com discrição RNAi siRNA seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, as células foram incubadas com a mistura de meio de crescimento sem penicilina /estreptomicina por tempo adequado para transfecção de siRNAs e knockdown foi confirmada por imunotransferência.
ACHN experimento rato xenoenxerto
O UC Davis Institucional Animal Care e Use Committee (IACUC) comité especificamente aprovou este estudo. Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com a Universidade da Califórnia IACUC. ratinhos nu /nu atímicos machos foram injectados com cada 5 × 10
5 células ACHN por via subcutânea na região do flanco. a progressão do tumor foi monitorizado semanalmente com um compasso de calibre (volume do tumor = comprimento x largura x largura /2). Quando os tamanhos de tumor atingiu cerca de 80-100 mm
3, os ratos foram divididos aleatoriamente em cinco grupos (veículo, sunitinib, KPT-330 dose baixa ou alta, ou KPT-330 baixa e sunitinib) para tratamentos de droga. Para o grupo de veículo, soluções de veículo (Pluronic F-68 e PVP K-29/32 e mistura de óleo vegetal) foram administrados por via oral (duas vezes por semana e cinco vezes por semana, respectivamente, n = 8). Para o grupo de sunitinib, a solução veículo para KPT-330, Pluronic F-68 e PVP K-29/32 mistura, e de sunitinib (40 mg /kg) foram administrados por via oral (duas vezes por semana e cinco vezes por semana, respectivamente, n = 8) [15]. Para o grupo de baixa KPT-330, óleo de baixa dose de KPT-330 (7,5 mg /kg) e vegetal foi administrado por via oral (duas vezes por semana e cinco vezes por semana, respectivamente, n = 8). Para o grupo de alta KPT-330, óleo de alta dose de KPT-330 (15 mg /kg) e vegetal foi administrado por via oral (duas vezes por semana e cinco vezes por semana, respectivamente, n = 8). Para o grupo baixo e sunitinib KPT-330, dose baixa de KPT-330 (7,5 mg /kg) e de sunitinib (40 mg /kg) foram administrados por via oral (duas vezes por semana e cinco vezes por semana, respectivamente, n = 8). Após 25 dias de tratamento, os animais foram sacrificados e os tecidos de tumor foram recolhidos em formalina a 10% para análise imuno-histoquímica.
Métodos estatísticos
Para estudos in vitro, foram realizadas comparações de valores médios utilizando o amostras independentes t-teste. Um valor de p 0,05 foi considerado significativo. Para o estudo in vivo, o crescimento do tumor foi comparado aos pares entre todos os tratamentos que utilizam o método de Tukey HSD.
Resultados
Atenuação de XPO1 por KPT-330 inibe a viabilidade RCC através de parada do ciclo celular e indução de apoptose
O primeiro confirmou que KPT-330 atenuada níveis de XPO1 em duas linhas de células RCC com uma grandeza semelhante (a partir de 0,1 ^ M) ao que foi observado com inibidores previamente desenvolvidas deste transportador nuclear (Fig. 1A) [13]. Para avaliar a eficácia da inibição XPO1 por KPT-330 para a sobrevivência celular, determinou-se que a viabilidade de células em resposta a este inibidor foi evidente numa concentração de 0,1 uM em linhas celulares de RCC mas numa ordem de grandeza dose mais elevada (10 pM) em condições normais células renais epiteliais tubulares (NHK) (Fig. 1B), um achado possivelmente devido ao aumento dos níveis nos tecidos XPO1 RCC, em comparação com tecidos normais renais que mostrámos previamente [13]. Para começar a investigar os mecanismos do KPT-330 induzida por diminuição da viabilidade celular em carcinoma de células renais, foram realizadas análises do ciclo celular e apoptose. Quando incubada com KPT-330, ambas as linhas de células RCC mostrou um aumento de células na fase G2 /M do ciclo celular de mais do que 10% (Fig. 1C), bem como uma fracção de células apoptóticas de cerca de 10% (Fig . 1D e a Fig. S1), o que sugere que uma redução da viabilidade de células RCC por KPT-330 ocorre através de ambos paragem do ciclo celular e a indução de apoptose.
O RCC células 786-S e ACHN foram cultivadas até -60% confluência e tratadas com KPT-330 em doses indicadas, durante 24 horas e imunotransferência foi realizada com anticorpos específicos (a). células RCC e NHK foram cultivadas até à confluência ~ 30%, tratou-se com KPT-330 em doses indicadas, durante 72 horas, e ensaios MTT foram realizadas (B). Análise do ciclo celular (C) e ensaio de Anexina V (D) foram realizadas após 24 horas de incubação com DMSO (Cont) ou KPT-330 (1