Abstract

O

SEMA3B

gene está localizado na região 3p21.3 LUCA, que é freqüentemente afetada em diferentes tipos de câncer. O objetivo do nosso estudo foi a expandir nosso conhecimento do

SEMA3B

gene como um supressor de tumor e os mecanismos de sua inativação. Neste estudo, foram utilizadas diversas abordagens experimentais: analisa o crescimento do tumor e ensaios de apoptose

in vitro Comprar e em ratinhos SCID, ensaios de expressão e de metilação e outras. Com a utilização do pulmão de pequenas células linha celular de cancro U2020 confirmou-se a função de

SEMA3B

como um supressor de tumor, e mostrou que a supressão pode ser realizada através da indução da apoptose e, possivelmente, associados com a inibição da angiogénese. Além disso, pela primeira vez, as frequências altas de metilação têm sido observadas em ambos intrónica (32-39%) e o promotor de (44-52%) CpG-ilhas em 38 carcinomas de pulmão de células não-pequenas, incluindo 16 carcinomas de células escamosas (SCC ) e 22 adenocarcinomas (ADC), e em 83 carcinomas de células renais claras celulares (ccRCC). As correlações entre as frequências de metilação do promotor e as intr�icas CpG-ilhas de

SEMA3B

com o estágio do tumor e grau foram revelados para SCC, ADC e ccRCC. A associação entre a diminuição da

SEMA3B

nível de mRNA e hipermetilação do promotor e as intr�icas CpG-ilhas foi estimado em tumores primários renais (

P Art 0,01). Usando qPCR, observou-se na redução média de 10 e 14 vezes o número de

SEMA3B

nível de ARNm em SCC e ADC, respectivamente, e uma diminuição de 4 vezes na ccRCC. A frequência deste efeito foi alta em ambos os pulmões (92-95%) e (84%) amostras de tumores renais. Além disso, mostrou uma clara diferença (

P Art 0,05) do

SEMA3B

níveis de mRNA relativas na ADC com e sem metástases linfáticas. Conclui-se que a expressão aberrante e metilação de

SEMA3B

poderiam ser sugeridos como marcadores de pulmão e progressão do câncer renal

Citation:. Loginov VI, Dmitriev AA, Senchenko VN, Pronina IV, Khodyrev DS, Kudryavtseva AV, et ai. Função supressora (2015) Tumor do

SEMA3B

Gene no Pulmão humano e câncer renal. PLoS ONE 10 (5): e0123369. doi: 10.1371 /journal.pone.0123369

Editor do Academic: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPÃO

Recebido: 16 de julho de 2014; Aceito: 05 de fevereiro de 2015; Publicado: 11 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Loginov et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios 13-04-00828a, 13-04-02072a e 14-04-32084 mol_a da Fundação Russa de Pesquisa básica ; conceder 28.12.07-6888 do Instituto Toscano Tumori; uma concessão do CNR-RAS projectos conjuntos 2008-2010; a concessão de RAS Presidium Programa “Biologia Molecular e Celular”; contrai 14.604.21.0117 (RFMEFI60414X0117 do projecto único identificador) e 14.621.21.0001 (RFMEFI62114X0001 identificador exclusivo do projeto) do Ministério da Educação e Ciência da Federação Russa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores confirmam a ausência de interesses concorrentes, mas declaram afiliação com affina Biotechnologies. Isto não altera a adesão dos autores para as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Semaforinas são mediadores negativos da orientação axonal no sistema nervoso central [1]. Semaforinas compreendem uma grande família de glicoproteínas (8 classes, incluindo 5 classes de vertebrados, de mais de 30 membros), mas apenas a classe 3 (SEMA3) representa secretado moléculas solúveis. Os membros da família SEMA são expressos diferencialmente no cancro, e promover ou suprimir a proliferação celular, a migração e a angiogénese, e a indução de resistência à droga. Assim, as funções dos elementos separados de família semaforina podem ser bastante diferentes [2-9].

Classe 3 semaforinas (SEMA3s, também conhecidos como collapsins) compreendem uma de cinco famílias de vertebrados de semaforinas e desempenham um papel importante na biologia do tumor, incluindo a regulação de processos celulares, tais como a proliferação de células endoteliais, a apoptose, a migração e a angiogénese [10]. Recentemente, o envolvimento desta classe de proteínas na carcinogênese tem sido intensamente estudada. SEMA3s são secretadas por células de várias linhagens, incluindo células epiteliais, neurónios e células tumorais específicas [10]. Neuropilinas (PNR) representam os receptores primários de SEMA3s. A ligação de SEMA3s para NRP1 /2 inicia a sua sinalização a jusante, mas impede a interacção entre NRP1 /2 e factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e da indução subsequente de um programa transcricional pró-angiogénico. No entanto, não é claro se SEMA3s inibir o crescimento tumoral por competir com o VEGF para Neuropilinas locais de ligação ao ligando, actuando independentemente do VEGF, ou por uma combinação destes efeitos [10-13].

Estudos anteriores, incluindo o nosso, do cromossoma humano 3 em renal, pulmão, mama e carcinomas cervicais revelou perdas alélicas frequentes (até 40%) na região de LUCA (3p21.3), que abriga dois Semaforinas-SEMA3B e SEMA3F. Esta região (hg38 /CHR3: 50.0-50.5Mb) composta por 445 Kb contém cerca de 20 supressores de tumor (ETG) e TSG-candidatos:

RASSF1

,

NPRL2

,

TUSC2

,

CACNA2D2

e outros. Surpreendentemente, estes genes que desempenham um papel em processos celulares e exercendo supressão do tumor por várias maneiras diferentes (bloqueio do ciclo celular, inibição da angiogénese, indução de apoptose, etc.) estão localizados na região compacto [14-18].

prova importante da actividade supressora de tumor inclui a identificação das vias celulares de regulamentação e outros mecanismos que são afetados por SEMA3B. Usando MDA-MB435 (carcinoma da mama) e A549 (adenocarcinoma do pulmão), as células que foi previamente demonstrado que SEMA3B suprimiu o crescimento de tumor mas provocaram uma programa de pró-metastática, liberando interleucina 8 [19, 20]. Além disso, verificou-se que a indução de apoptose por SEMA3B em células tumorais foi mediada por inactivação da via de sinalização de Akt [21]. Por isso, foi importante para elucidar aspectos particulares da supressão do tumor SEMA3B.

A metilação é um importante mecanismo de

SEMA3B

inativação gênica [17, 22]. No entanto, a maioria das pesquisas anteriores focada em estudos de metilação do intrônica CpG-ilha, que foi considerado incorretamente como localizado na região promotora.

O objetivo do nosso estudo foi elucidar os papéis distintos do SEMA3B em tumor supressão, especialmente em apoptose e angiogese. Além disso, nós teve como objetivo avaliar as frequências de promotor (hg38 /CHR3: 50,267,308-50,267,797) e intrônica (CHR3 hg38 /: 50,268,972-50,269,271) correlações CpG-island hipermetilação com

expressão SEMA3B

e progressão do tumor no pulmão e renal cancros

Materiais e Métodos

As linhas celulares

O DNA genômico foi isolado a partir de linhas de células de câncer de 14: 3. cancros escamosas de pulmão de células (CPPC: ACC-LC5, NCI-N417 , U2020), 2 cancros do pulmão de células não pequenas (NSCLC: NCI-H157, NCI-H647) e 9 cancros das células renais (RCC: A498, ACHN, Caki-1, Caki-2, HN-51, KH-39, KRC /Y, TK-10, TK-164). A U2020 linha celular foi descrito anteriormente [23]. A linha celular de ACC-LC5 que transporta uma delecção em 3p21.3 [24] foi gentilmente cedido pelo Dr. Nakamura Yusuke (Universidade de Tóquio, Tóquio, Japão). A498 renal, linhas celulares Caki1, e Caki2 e pulmão NCI-N417, NCI-H157, e NCI-H647 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). As linhas celulares KRC /Y, ACHN, TK-164, CP-51, TK-10 e KH-39 foram obtidos do Instituto Karolinska (Estocolmo, Suécia) coleção linha de células [25]. Todas as linhas de células humanas foram cultivadas como culturas em monocamada em IMDM /RPMI ou DMEM (com 4,5 g /l de glucose) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS).

As amostras de tecido

No total , 70 emparelhado tumor amostras /normais de NSCLC (29 ADC e 41 SCC) e 133 células claras RCC (ccRCC) foram obtidos a partir da NN Blokhin Cancer Research Center, Academia Russa de Ciências Médicas (Moscou, Rússia). O conjunto de 38 NSCLC (16 e ADC 22 SCC) e 83 ccRCC foi utilizada nos estudos de metilação e os estudos de expressão ou número de cópias por semi-quantitativa por RT-PCR. O conjunto adicional de 32 NSCLC (13 ADC e 19 SCC) e 50 ccRCC foi usado para validação por estudos de expressão qPCR. A informação da amostra é apresentado na Tabela 1 e Tabela S1. As amostras foram coletadas em conformidade com as orientações emitidas pelo Comitê de Ética da N.N. Blokhin Cancer Research Center, Academia Russa de Ciências Médicas (Moscou, Rússia). Todos os pacientes assinaram consentimento informado (disponível mediante solicitação). A Comissão de Ética da N.N. Blokhin Cancer Research Center, Academia Russa de Ciências Médicas, aprovado especificamente neste estudo. O estudo foi realizado de acordo com os princípios enunciados na Declaração de Helsinki. Os tecidos tumorais e tecidos emparelhados morfologicamente normais foram obtidas a partir de pacientes após ressecção cirúrgica antes da quimioterapia e da radioterapia ou foram armazenados em azoto líquido. O diagnóstico foi confirmado por histopatologia, e apenas as amostras com mais de 70-80% ou células tumorais foram utilizados no estudo. controles “normais” foram obtidos com um mínimo de 2 cm a partir do tumor e foram confirmados histologicamente como células epiteliais normais. amostras tumorais foram caracterizados de acordo com o Sistema Internacional de classificação dos tumores, com base no tumor-nódulo-metástase (TNM) e estadiamento de classificação da União de Controle do Câncer Internacional (UICC, versão 2002) [26] e da Organização Mundial da Saúde (OMS ) classificação critérios [27, 28]. Amostras de sangue de 15 doadores saudáveis ​​também foram utilizados no estudo.

SCID

ratos Doze SCID foram utilizados nos experimentos. Os ratos foram obtidos a partir de Scanbur (Sollentuna, Suécia). eutanásia dos animais foi realizada por CO

2 asfixia seguido por deslocamento cervical. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NRC 2011), a Convenção Europeia para a Protecção dos Animais Vertebrados utilizados para fins experimentais e outros fins científicos, Conselho da Europa (ETS 123 ), e as orientações do Comitê de Ética do Norte de Estocolmo para Cuidado e Uso de Animais de laboratório. Os experimentos com os ratos SCID foram aprovados pela Comissão de Ética do Norte Estocolmo.

transfecção e selecção de

SEMA3B

-U2020 clones celulares transfectadas de forma estável

O cDNA que codifica o

SEMA3B

gene foi clonado num vector epissomal regulada pela tetraciclina, Pete. O plasmídeo resultante foi sequenciado. Para obter clones de células estáveis ​​que expressam

SEMA3B

, U2020 células (SCLC) foram transfectadas com Pete vazio ou Pete /

SEMA3B

DNA de plasmídeo (0,5 mg de ADN por poço) em placas de 12 poços utilizando Lipofectamina e Plus Reagent (Invitrogen, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Transitoriamente transfectadas Pete /

SEMA3B

-U2020 e células pete-U2020 foram cultivadas durante 2-3 semanas em meio IMDM contendo Bsd (5 ug /ml) para seleccionar clones estáveis. A expressão de

SEMA3B

foi regulamentado pela doxiciclina.

Colony ensaio de formação de

células U2020 transfectadas transitoriamente (com Pete e Pete /

SEMA3B

) foram despojados 24-48 h após a transfecção e semeadas em placas de 100 mm

2 placas de cultura de células a uma densidade de 500-1000 células por placa. Após selecção com Bsd (5 ug /ml), as colónias coradas com Giemsa foram fotografadas e contadas utilizando Quantity One Software (versão 4.4.0; Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). viabilidades celulares foram estimados por análise de FACS com iodeto de propídio (PI-FACS), seguindo as orientações do fabricante (FACSCalibur, BD Bioscience).

O crescimento do tumor em ratinhos SCID

A tumorigenicidade de Pete /

SEMA3B

-transfected U2020 e células vazias Pete transfectadas U2020 (controle) foi avaliada por via subcutânea injetar as células em camundongos SCID 6-8 semanas de idade, como descrito anteriormente [29]. As células foram recolhidas por centrifugação a 800 rpm durante 2 min e ressuspensas em meio IMDM isento de soro a uma concentração de 2-3 x 10

6 células por 100 uL de injecção. As células foram embebidos numa matriz Matrigel (BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica), de acordo com o protocolo do fabricante. Os ratos foram observados para a formação de tumores duas vezes por semana, e o tamanho do tumor foi medido utilizando calibradores. Em seguida, foi utilizado o teste de inactivação multi-gene (MGIT) por três genes (

ZMYND10 /BLU

,

TUSC2 /FUS1

e

SEMA3B

) em ratinhos SCID. MGIT baseia-se no acompanhamento de supressor de tumor inativação do gene candidato em células e tumores. Foi realizado de acordo com um método publicado [29, 30]. Resumidamente, U2020 células foram transfectadas quer com Pete /

SEMA3B

, Pete /

ZMYND10

, Pete /

TUSC2

ou vazios Pete plasmídeos. Misturas de clones de células foram injectadas subcutaneamente em ratinhos SCID. Posteriormente, se um tumor é formado, a expressão de

SEMA3B

,

ZMYND10

e

TUSC2

é avaliada. O knock-down dos genes sugere sua importância para a supressão do tumor.

análise imuno-histoquímica de SCLC linha de células de tumor U2020 e angiogênese do tumor em ratinhos SCID

O plasmídeo Pete /

SEMA3B

foi introduzido na linha de células SCLC U2020, que produzida constitutivamente um transactivador de tetraciclina (tTA) [29]. A sub-linha resultante foi inoculada subcutaneamente em ratinhos SCID. Os ratos receberam água potável com doxiciclina (+ dox, gene é OFF) ou sem (-dox, gene é ON). Os ratinhos foram sacrificados após 1 mês. Os tumores ou locais de injecções de células foram excisadas e embebidos com parafina. As secções foram de 5 um de espessura. A parafina foi dissolvido em xileno (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), e as secções de tecido foram tratadas sequencialmente com 99, 95, 75 e 30% de etanol. Os epitopos foram recuperados por meio de aquecimento num forno de microondas durante 5 minutos em tampão de citrato. anticorpo de rato anti-CD31, em conjunto com de coelho anti-ratinho conjugado com FITC anticorpo secundário (Dako, Karlstrup, Dinamarca), foi utilizado para corar microvasos. O ensaio de TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Boehringer Mannheim, Alemanha) para a detecção de apoptose foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante.

ADN e o isolamento de ARN total, a transcrição reversa-PCR

tecidos de nitrogênio congelado foram interrompidas usando um Mikro-Dismembrator (Sartorius, Alemanha). O ADN a partir de tecidos humanos e culturas de células foi isolado por extracção com fenol de acordo com os protocolos convencionais. O ARN total foi isolado utilizando o RNeasy Mini Kit como recomendado pela Qiagen (Países Baixos). RNA purificado foi quantificado utilizando NanoDrop-1000 (NanoDrop Technologies Inc., DE, EUA). ARN qualidade foi avaliada através de 28S e 18S rRNA bandas após electroforese em 1% desnaturante em gel de agarose e analisadas utilizando um Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, CA, EUA). A falta de contaminação do DNA foi verificada por PCR semi-quantitativa com primers para o gene do complexo de histocompatibilidade principal (I

MHCI

, projetado usando Vector NTI, consulte S2 Tabela). Todas as amostras de RNA foram tratados com DNase isenta de RNase I (Fermentas, Lituânia). As amostras de ARN que contenham mais de 0,1% de ADN foram descartados. O ADNc foi sintetizado a partir de 1 ug de ARN total, utilizando M-MuLV da transcriptase reversa e hexâmeros aleatórios, de acordo com o protocolo do fabricante padrão (Fermentas, Litu�ia).

sequenciação Bissulfito do promotor CpG-ilha de

SEMA3B

gene

conversão Bissulfito ADN foi realizada como descrito em [31, 32] com a utilização de 1-2 ug de ADN (linhas de células renais e pulmonares e tumor /tecido normal). O ADN modificado foi purificado utilizando um Kit de Purificação de PCR JETquick rotação (Genomed, Suécia). DNA modificado foi mantida a -20 ° C e utilizada como um molde para PCR com os iniciadores concebidos (listados na Tabela S2), cujo produto foi sequenciado. A amplificação do

SEMA3B

fragmento promotor CpG-island foi realizada numa mistura reaccional de 50 ul contendo tampão de PCR (Tris-HCl 67 mM, pH 8,8, sulfato de amónio 16,6 mM, 0,01% de Tween 20); MgCl 2,0 mM

2; 0,25 mM de cada dNTP; 25 pM de cada iniciador; 1 unidade de polimerase Iniciar Taq DNA Hot (SibEnzyme, Rússia); e 5-20 ng de DNA modificado num motor de ADN Díade Cycler (Bio-Rad, EUA) utilizando o seguinte programa: 95 ° C, 5 min; 35 ciclos de 95 ° C, 15 s; 62 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s e 72 ° C, 7 min. O produto amplificado por PCR foi purificado utilizando electroforese em gel de 1,5% de agarose e o Kit de rotação JETquick Gel Extraction (Genomed, Suécia). Para a sequenciação, foram usadas 5-10 ng do fragmento de ADN purificado e 25 pM de um dos iniciadores. A sequenciação foi realizada usando uma máquina de sequenciação automática (Beckman-Coulter).

PCR específica de metilação (MSP)

O DNA tratado pelo bissulfito, dissolvido em água duplamente destilada, foi também usado como um modelo para MSP. As condições de PCR e os iniciadores para o alelo metilado e não metilado de intrónica [17] e o promotor (desenhado por DNASTAR Lasergene programa 2000) CpG-ilhas são dadas na Tabela S2. No caso de o promotor de CpG-island, 6 CpG-dinucleótidos foram analisados ​​(por 2 o iniciador de sentido directo e quatro por o inverso), e no caso de o intrónica-3 (uma por o iniciador de sentido directo e 2 por o inverso). A PCR foi realizada num amplificador de ADN Motor Díade Cycler (Bio-Rad, EUA) utilizando o seguinte programa: 95 ° C, 5 min; 35 ciclos de 95 ° C, 10 s; T

ann (ver Tabela S2), 20 s; 72 ° C, 30 s e 72 ° C, 3 min. A ausência de produto de PCR em ADN não convertido foi verificada para cada par de iniciadores. ADN da linha de células de fibroblasto humano G-68 serviu como um controlo alelo não metilado; G-68 SSSI ADN a partir de L-68 fibroblastos tratados com SSSI metiltransferase (SibEnzyme, Rússia) serviu como um controlo positivo para 100% de metilação.

semi-quantitativo de RT-PCR

Para controlar a transcrição reversa, iniciadores para a transcrição da beta2-microglobulina (

B2M

) gene foram utilizados [33]. Semi-quantitativo de RT-PCR foi realizada com quantidades iguais de ADNc, utilizando os iniciadores e as condições listadas na Tabela S2. Multiplex PCR com primers para a

SEMA3B

[17] e

B2M

genes foi realizada sob condições otimizadas para o

SEMA3B

primers, ea concentração de

B2M

iniciadores foi de 1,5 vezes inferior. Os produtos da RT-PCR foram separados em geles de agarose a 2%, e o padrão de bandas foi analisada utilizando software GelImager (DNA Technology, Rússia). Um ensaio do número de cópias semi-quantitativo para os marcadores da região luca foi usado como descrito noutro local [14].

qPCR

Quantitativo Realizou-se PCR com os iniciadores e sondas TaqMan listados na Tabela S2 usando um real-Time System 7500 PCR (Applied Biosystems, CA, EUA). Cada reacção foi repetida três vezes. As sequências de nucleótidos dos produtos de amplificação foram verificados por sequenciação num sequenciador 3730 DNA Analyzer automatizado (Applied Biosystems, CA, EUA). dados QPCR foram analisados ​​utilizando a referência de genes

GAPDH

,

GUSB

e

RPN1

[34] ea quantificação relativa ou ΔΔCt-método como descrito anteriormente [35]. Pelo menos 2 vezes mudanças de nível mRNA foram considerados significativos por causa do nível de mRNA variabilidade dos genes de referência.

A análise estatística

O teste não paramétrico de Wilcoxon foi utilizado para comparar as diferenças de expressão de mRNA no alvo e genes de referência nas amostras ccRCC e NSCLC. testes de soma classificação Mann-Whitney Kruskal-Wallis e, exato de Fisher e χ

2 critérios foram utilizados para a análise de alterações de nível de mRNA e de estado de metilação em grupos ccRCC e NSCLC com diferentes características patológicas e histológicas. teste t de Student foi utilizado para comparar os dados obtidos para os grupos de repetições. Os valores de p ≤ 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. coeficiente de correlação de Spearman (

r

s

) foi usado para revelar correlações.

Resultados

In vitro

supressão do crescimento de células SCLC U2020 pelo

SEMA3B

a linha de células de carcinoma de pulmão de pequenas células U2020 foi transfectado com Pete

/SEMA3B

ou Pete como o controle. As células transfectadas foram cultivadas durante 15 dias. A taxa de crescimento das células que expressam U2020

SEMA3B

foi menor do que o controlo (

P

0,01, desde o dia 5, ver figura 1A). O ensaio de formação de colónias mostrou que o número de colónias de células U2020 contendo Pete /

SEMA3B

era menor após a re-expressão de

SEMA3B

gene de supressão de doxiciclina em comparação com as células de controlo (890 ± 60 vs 190 ± 40,

P Art 0,01, Fig 1B). Com base na análise PI-FACS, a abundância de células em apoptose e necróticas expressando

SEMA3B

(sem doxiciclina) foi significativamente maior em comparação com o

SEMA3B

-off células (com doxiciclina): a partir de (7 ± 2) × 10

2 a (49 ± 5) × 10

2,

P Art 0,01, ver Fig 1C. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que

SEMA3B

é o inibidor do crescimento de células SCLC humana através da indução de apoptose

in vitro

A-A taxa de crescimento do U2020 células.: linha pontilhada com o clone quadrados-U7111 com Pete /

SEMA3B

, linha sólida com células círculos-U2020 com Pete (controle); ensaio de formação de colónias de B; análise de C-PI-FACS de células com e sem expressão de

SEMA3B

. Valores médios ± desvios-padrão para 4 repetições são representados em cada caso.

teste de inactivação Multi-gene em camundongos SCID

Temos relatado anteriormente que a técnica GIT permite a eficiente e indução controlada de vários genes em células [29, 30]. Para o experimento MGIT, foi utilizado o U2020 linha de células SCLC para a expressão condicional de três TSG-candidatos localizado em 3p21.3:

ZMYND10

(

BLU

),

TUSC2

(

FUS1

) e

SEMA3B

. Misturas de diferentes clones de células que transportam genes foram inoculadas subcutaneamente em ratinhos SCID com seis semanas de idade utilizando um (matriz de membrana basal) técnica de implante de Matrigel na ausência de doxiciclina (os genes foram ON).

Uma base de PCR comparação de tumores SCID e clones de células primárias mostrou inequivocamente que

SEMA3B

foi seletivamente knocked-down em todos os três tumores cresceram

in vivo

(ver amostras 8-10 na Figura 2), enquanto que o expressão de

ZMYND10

e

TUSC2

genes não se alterou sob estas condições. Estes dois genes provavelmente não antagonizar o crescimento do tumor de U2020 células em ratinhos SCID (deixamos esta questão em aberto, porque a busca de mutação através de genes retidos não foi incluído no MGIT). Estes dados sugerem que SEMA3B é um inibidor do crescimento de células SCLC humanos

in vivo

.

eletroferograma de multiplex PCR a partir de plasmídeos, clones e tumores SCID de três genes. M-marcador, 1-PCR a partir do plasmídeo Pete /

SEMA3B

, 2-PCR a partir do plasmídeo Pete /

TUSC2

, 3-PCR a partir do plasmídeo Pete /

ZMYND10

, 4 -PCR a partir U7111 /

SEMA3B

clone de células 1, 5-PCR a partir U7111 /

TUSC2

clone de células 3, 6-PCR a partir U7111 /

ZMYND10

clone de células 4, clones de 7 mistos celulares, 8-PCR de tumor 1, 9-PCR de tumor 2, de 10 de PCR de tumor 3, controle de 11-negativos.

Efeito da

SEMA3B

transgenes no crescimento de tumores em ratinhos SCID e angiogênese

O sub-line U2020 com condicional

SEMA3B

expressão sob controle doxiciclina foi inoculado em camundongos SCID subcutaneamente. Quatro ratos receberam doxiciclina na água potável (+ camundongos dox, controle) e doxiciclina cinco não foram administrados (ratos -dox). O aparecimento de tumores sólidos expressar ativamente

SEMA3B

não foi observado em 4 dos 5 casos (Fig 3, linha vermelha). No crescimento do tumor do rato activo quinta-DOX (Figura 3, linha amarela) começou uma semana mais tarde, em comparação com o controlo (Figura 3, linha azul), apesar da presença de

SEMA3B

na construção. No entanto, a expressão de o

SEMA3B

gene não foi detectado neste tumor de acordo com a análise de transferência de Northern (dados não apresentados) o que sugere a perda de

SEMA3B

nestas células. Os tumores (observados em

SEMA3B

-OFF ratinhos) tinham áreas de proliferação celular activa, em contraste com os tecidos retirados de locais de injecções de células (em

SEMA3B

-ON ratinhos), na qual foram observadas áreas estroma celular e necróticas fibrosos e pouco diferenciados abundantes. Estes dados demonstram a possibilidade de

SEMA3B

atividade de supressão de tumores em ratinhos SCID

A taxa de crescimento do U2020 células (clone U7111) em ratinhos SCID:. Células line-U2020 azul sem

SEMA3B

expressão (+ doxiciclina, 4 ratos), as células line-U2020 vermelhas e amarelas com

SEMA3B

expressão (- doxiciclina, 4 ratos e um rato, respectivamente). * -no Expressão de

SEMA3B

genes de acordo com a transferência de Northern (dados não apresentados). camundongos One + dox e um-Dox foram retirados do estudo após um mês

Os tecidos de dois locais de U2020 células inoculação foram analisados ​​utilizando a coloração CD31 e ensaio de TUNEL: Um. SEMA3B-negativos (Fig 4A e 4B) e um SEMA3B-positiva (Fig 4C e 4D rato). Os anticorpos de ratinho anti-CD31 foram utilizados para corar os microvasos sanguíneos. Um número muito poucos de microvasos foi detectada em tecidos SEMA3B-positiva. Um fragmento contendo um dos objectos-microvasos como é mostrado na Figura 4C. sinal de microvasos (canal verde) foi co-localizada com sinal de eritrócitos (canal vermelho) resultante para as áreas amarelas na Fig 4A. No entanto, os tumores sólidos SEMA3B-negativos demonstrou abundância de alongados, condutas de sangue compactados com fluorescência típico para epitélios. Estas condutas de tumor foram também co-localizada com eritrócitos (Fig 4A). Isto pode suportar um papel de SEMA3B como inibidor da angiogénese. No entanto, novas experiências com a amostragem prolongado são necessários para provar esta sugestão

(A, B) -.

SEMA3B

é OFF (ratinho recebeu doxiciclina na água potável). (C, D) –

SEMA3B

é ON (mouse não foram administrados doxiciclina). (A, C) -staining com anti-CD31 para monitorar os vasos sanguíneos (sinal verde). Quando

SEMA3B

é OFF, as áreas preenchidas com eritrócitos (sinal vermelho) são vistos. sinal amarelo indica co-localização de sinais de verde e vermelho. Azul sinal corresponde ao ADN. ensaio -TUNEL (B, D). Observe a área com células em apoptose (sinal verde), onde o

SEMA3B

gene foi expresso.

A hipótese de que as células SEMA3B-positivas nas áreas sem vasos sanguíneos e eritrócitos foram submetidos morte celular. Para testar esta hipótese, as secções dos mesmos fragmentos de tecido foram analisadas por um ensaio de TUNEL, uma técnica que permite a detecção de células apoptóticas. (Figura 4B, 4D). A enorme área de células em apoptose foi observada em amostra de tecido SEMA3B-positiva, enquanto nenhuma área apoptótica foi observada em tumores SEMA3B-negativo. Neste caso, assumimos que a expressão de

SEMA3B

crescimento do tumor suprimido

in vivo

, provavelmente pela indução de apoptose. A inibição da angiogênese pode ser sugerido também.

A metilação do promotor e intrônica

SEMA3B

CPG-ilhas em linhas de pulmão e de células renais e tumores primários de sequenciamento bissulfito e metilação específicas de PCR

o

SEMA3B

gene é composto por 18 exons e contém dois CpG-ilhas: um está localizado na região promotora (1-st CpG-ilha, hg38 /CHR3: 50,267,308-50,267,797, 22 CpG- dinucle�idos) e o outro no primeiro intron (2-nd CpG-ilha, hg38 /CHR3: 50,268,972-50,269,271, 12 CpG-dinucle�idos). Analisamos o perfil de metilação de 16 CpG-dinucle�idos do promotor CpG-ilha em linhas celulares de cancro do pulmão 5 (3 SCLC e 2 NSCLC) e 12 tumores primários de NSCLC utilizando sequenciamento bissulfito (5 ADC e 7 SCC, ver figura 5A). metilação densa ( 40% dos CpG metilado foram analisadas) do promotor de CpG-island do

SEMA3B

gene foi observada em dois de três linhas de células de SCLC, mas em nenhuma das linhas celulares de NSCLC (NCI e -H157 NCI-H647). No entanto, em todos os 7 e os tumores primários SCC em 2 de 5 tumores primários ADC, metilação foi detectado em 12/02 dos CpGs. Além disso, examinou-se o perfil de metilação em 9 linhas de células de cancro renal e 25 tumores primários ccRCC (Fig 5B). Observou-se metilação densa do promotor CpG-ilha em 8 de 9 linhas celulares e 11 de 25 tumores primários ccRCC. Entre os tecidos normais histológicos correspondentes, CpGs metilados foram detectados apenas em 2 de 25 casos ccRCC e em nenhum dos 12 casos NSCLC (Fig 5A e 5B).

Os dados de seqüenciamento bissulfito, 16 CpG-dinucle�idos (2-17) da ilha CpG são dadas. Quadrados cinzas mostrar metilados CpG-dinucle�idos, praças-metiladas brancos. Números de tumores primários correspondem aos do quadro S1. Os números em negrito do CPG-dinucle�idos (3-4 e 9-12) indicam a localização dos primers que foram utilizados para o método de MSP.

Em seguida, foram avaliadas as freqüências de metilação de ambos os CpG-ilhas do

SEMA3B

gene pelo método MSP usando um conjunto representativo de tumores primários. A frequência de metilação do promotor CpG-ilha foi de 44% (7/16) em ADC, 45% (10/22) no CEC e 52% (43/83) em ccRCC. O intrónica CpG-metilado ilha foi ligeiramente menor do que o promotor de ilha em ambos os tipos histológicos de NSCLC (ADC -38%, 6/16; SCC -32%, 7/22) e em ccRCC (39%, 32/83; Tabela 2). As frequências de metilação de ambas as ilhas foram significativamente maiores em tecidos tumorais do que em tecidos histologicamente normais emparelhados (

P

≤ 0,04, ver Tabela 2). Assim, a metilação de ambos os CpG-ilhas do

SEMA3B

gene é uma marca do pulmão e câncer renal. Como esperado, a metilação de nem o 1-r nem o 2-ND

SEMA3B

CpG-island foi detectada em todas as amostras de DNA isoladas a partir de linfócitos de sangue de dadores saudáveis ​​(n = 15). Os dados MSP estavam de acordo com os resultados de sequenciamento bissulfito para cada tipo de câncer investigado.

O uso de um conjunto representativo de tumores primários nos permitiu revelar possíveis correlações entre a frequência de metilação do promotor e intr�icas CpG-ilhas com os parâmetros patológicos e histológicos dos tumores. tumores avançados ccRCC e NSCLC tinha uma maior frequência de metilação CpG-ilha em comparação com as fases iniciais (Tabelas 2 e 3). A correlação mais forte foi mostrado pela SCC (coeficientes de correlação de Spearman foram iguais 0,37,

P

= 0,09 e 0,60,

P Art 0,01, para o 1-st e para o 2- nd CpG-ilha, respectivamente). Observou-se uma correlação positiva entre o grau do tumor e a frequência de metilação CpG-ilha para NSCLC e ccRCC (Tabela 3). Essa correlação foi mais forte do que a correlação entre o estágio do tumor e a frequência de metilação CpG-ilha para ambos os tipos histológicos de NSCLC e quase igual ao das ccRCC (Tabela 3).