Abstract

Vacinas contra o câncer são projetados para expandir células T específicas de antigénio de tumor com função efetora. No entanto, eles também podem inadvertidamente expandir células T reguladoras (Tregs), o que poderia dificultar seriamente a eficácia clínica. Para abordar esta possibilidade, foi desenvolvido um ensaio de novo para detectar Treg específicas do antigénio com base na sub-regulação de CD3 da superfície seguinte engate TCR, e utilizada esta abordagem para o rastreio de Treg específicas para o antigénio tumoral NY-ESO-1 em pacientes com melanoma tratados com o /ISCOMATRIX

vacina contra o câncer TM NY-ESO-1. Todos os pacientes testados tinham Treg (CD25

brilhante neg FoxP3

+ CD127

) específico para pelo menos uma NY-ESO-1 epitopo no sangue. Surpreendentemente, a comparação com amostras pré-tratamento revelaram que muitas destas respostas foram induzida ou aumentada por meio de vacinação. A resposta mais frequentemente detectada estava para o HLA-DP4-restrito NY-ESO-1

epitopo 157-170, que também é reconhecido por células T efectoras. Notavelmente, Treg funcional específica para um epítopo de HLA-DR-restrito dentro do NY-ESO-1

115-132 péptido foram também identificados com elevada frequência no tecido tumoral, sugerindo que o NY-ESO-1-específica Treg podem suprimir locais anti-tumorais respostas imunes. Em conjunto, os nossos dados proporcionam evidências convincentes para a capacidade de uma vacina contra o cancro para expandir específica do antigénio tumoral Treg no ambiente de cancro avançado, e que tal facto deve ser dada consideração séria na concepção de ensaios clínicos futuros vacina para o cancro.

Citation: Ebert LM, MacRaild SE, Zanker D, Davis ID, Cebon J, Chen W (2012) um cancro vacina induz Expansão do NY-ESO-1-Specific células T reguladoras em doentes com doença avançada melanoma. PLoS ONE 7 (10): e48424. doi: 10.1371 /journal.pone.0048424

editor: Derya Unutmaz, Universidade de Nova Iorque, Estados Unidos da América

Recebido: 25 de junho de 2012; Aceito: 25 de setembro de 2012; Publicação: 26 de outubro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Ebert et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações Cancer Council Victoria para LE (603103, 433626), um Nacional de Saúde e Pesquisa médica do Conselho (NHMRC) concessão do projeto para WC (433608) e Suporte infra-estrutura operacional do Governo do Estado de Victoria. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

vacinas do cancro uma grande promessa no tratamento de tumores sólidos, tais como o melanoma, e têm sido o foco de extensos testes pré-clínicos e clínicos nos últimos anos. Devido à sua imunogenicidade excepcional, NY-ESO-1 tem emergido como um dos alvos mais promissores em tais abordagens [1]. Ao longo dos últimos anos, temos realizado uma série de ensaios clínicos em pacientes com melanoma, utilizando uma vacina contra o câncer consiste em full-length recombinante NY-ESO-1 proteína formulado com ISCOMATRIX

TM adjuvante (CSL Limited, Austrália). Embora esta vacina tem efeitos anti-tumorais potentes em estudos com animais pré-clínicos [2] e mostrou resultados promissores na fase inicial I estudo [3], ele não conseguiu melhorar significativamente o resultado clínico em pacientes com melanoma em ensaios subsequentes [4] e manuscrito em preparação). Além disso, enquanto os pacientes com totalmente ressecada (early-stage) doença se desenvolveu respostas fortes de células efetoras T (Teff) para NY-ESO-1 após a vacinação [3], [5], os pacientes com melanoma avançado tiveram respostas muito menos robustos [4] .

Semelhante a nossa experiência com o antígeno específico-NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM vacina, muitas outras vacinas contra o câncer também falharam em induzir benefício clínico significativo, muitas vezes, apesar da indução de tumor aparentemente potente respostas teff [6], [7]. Há muitas explicações possíveis para isso, mas que tem recebido especial atenção nos últimos anos gira em torno do papel do CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ células T reguladoras (Treg). Treg são essenciais para prevenir a auto-imunidade [8]. No entanto, um conjunto crescente de evidências suportam o conceito de que Treg também pode bloquear a geração de imunidade eficaz anti-tumor [9]. Portanto, é imperativo que as abordagens vacina contra o câncer evitar a expansão dessas células.

Até recentemente, a evidência para o reconhecimento de antígenos tumorais por Treg tinha sido escassos, e não estava claro se ou não Treg seria ativado e expandir em resposta para vacinação contra antigénios tumorais. Nos últimos anos, no entanto, um certo número de relatórios têm identificado Treg específicas para uma gama de antigénios tumorais no cancro humano, incluindo o NY-ESO-1, a survivina, TRP-1, gp100, MAGE-A3, Melan-A, carcinoembrionário Ag ( CEA), a telomerase, HER2 /neu, WT-1, MUC-1 e o vírus do papiloma antigénios E6 e E7 [10] – [16]. A presença destas células em pacientes com câncer levanta sérias preocupações sobre o potencial das vacinas contra o câncer de expandir não só Teff, mas também Treg. A medida em que isso realmente ocorre, no entanto, é mal compreendida.

No presente estudo, nós avaliamos o efeito da vacinação com NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM sobre a freqüência de NY- -ESO-1 específico Treg em pacientes com melanoma de fase tardia. Como a maioria Treg não produzem citocinas no momento da activação [17] – [19], não existe actualmente nenhum disponível de ensaio adequado para o rastreio de Treg específica de antigénio. Por conseguinte, temos desenvolvido um romance, a abordagem sistemática em que específica do antigénio Treg são detectados por sub-regulação do receptor de superfície da célula T (TCR) /CD3 complexos seguinte

In vitro

estimulação com uma biblioteca de péptidos antigénicos curtos. A optimização deste método foi recentemente descrito [20]. Aqui, temos usado essa abordagem para triagem de NY-1-específica ESO Treg em pacientes com melanoma, antes e após a vacinação com o /ISCOMATRIX

TM vacina NY-ESO-1. Este estudo permitiu-nos obter uma compreensão sem precedentes de Treg antígeno-específica tumor no cenário de câncer avançado, incluindo a sua função, a localização, a gama de epitopos reconhecidos e como a sua frequência é afetada pela vacinação.

Resultados

uma nova abordagem baseada na infra-regulação de CD3 de superfície detecta Teff e Treg específicas para NY-ESO-1 peptídeos

para o rastreio de Treg específica NY-ESO-1-in um forma imparcial, desenvolveu-se um ensaio com base no princípio de que as células T para baixo-modular o número de complexos CD3 /RCT sobre a superfície da célula após a ligação do antigénio cognato [21], [22]. Isto pode ser detectado como uma redução do nível de coloração de CD3 na superfície celular por citometria de fluxo. Devido à sua escassez,-NY-ESO-1 específica Teff pode quase nunca ser detectada diretamente

ex vivo

em amostras de sangue usando o padrão metodologia (intracelular de citocinas coloração IFN-γ), mas em vez disso requerem expansão antes

em vitro

. Estudos preliminares revelaram que este foi também o caso para o NY-ESO-1-específica Treg detectada utilizando o CD3 down-regulation método (observações não publicadas). Por conseguinte, o paciente PBMC foram cultivadas com um painel de 28 péptidos de 18 aminoácidos que se sobrepõem parcialmente, que colectivamente abrangem toda a sequência de NY-ESO-1 [23], para permitir a expansão de NY-ESO-1-específica Tef e Treg para frequências detectáveis . Condições, incluindo o tempo de cultura, concentração de IL-2 e a fonte de soro, foram optimizadas para a expansão Treg [20]. Após 21d expansão, as culturas foram re-estimuladas com péptidos 18mer individuais e o nível de superfície CD3 determinada por citometria de fluxo, em conjunção com a coloração para marcadores de Treg.

Um exemplo dos resultados obtidos é mostrado na Figura 1. estes dados demonstram que uma população clara de Treg putativo poderia ser detectado dentro do CD4

+ população de células T por co-coloração para CD25 e FoxP3 (figura 1A, esquerda). Dentro deste subconjunto de Treg, uma sub-população distinta de células CD3-baixo (específicas para o antigénio) era aparente após a re-estimulação com peptídeo NY-ESO-1

157-174 mas não o NY-ESO-1

127 -144 ou na ausência de re-estimulação (figura 1A, painéis superiores). Por outro lado, uma sub-população de células CD3-baixo pode ser detectado dentro do subconjunto Tef seguinte re-estimulação com peptídeo NY-ESO-1

127-144 mas não o NY-ESO-1

157-174 (Fig 1A, painéis inferiores). Um resumo dos resultados para este paciente, usando todos os 28 peptídeos demonstra duas respostas distintas Treg, em regiões de NY-ESO-1

37-60 e NY-ESO-1

157-180 (Fig 1B), e um grande resposta teff, na região NY-ESO-1

127-144 (Fig 1C).

CD3

. PBMC de paciente 113 foram cultivadas com péptidos 18mer NY-ESO-1 agrupados como descrito em

Métodos

, seguido de re-estimulação com os péptidos individuais indicados durante a cultura durante a noite para permitir que a sub-regulação de CD3. As células foram coradas com anticorpos para CD4, CD25, FoxP3 e CD3 e analisados ​​por citometria de fluxo. (

A

): um exemplo dos padrões de coloração observada, ilustrando a propagação de Treg e Teff (em células fechadas viáveis ​​CD4

+ T) e a infra-regulação de CD3 dentro de cada população. (

B Restaurant –

C

): Um resumo das respostas detectadas no Treg (B) e as populações Teff (C). As linhas pontilhadas indicam o nível basal de células CD3-baixo (condição peptídeo nil).

Nós também procurou analisar o perfil de produção de citocinas de-NY-ESO-1 específica Treg em quatro pacientes cujos Treg para baixo CD3 -regulated em resposta aos péptidos de NY-ESO-1, utilizando a coloração de citocinas intracelulares. -CD3 baixo Treg produzidos níveis baixos a não detectáveis ​​de IL-4, IL-10 e IL-17 em todos os pacientes. No entanto, a produção de IFN-γ e TNF-α foi variável, com os dois doentes que mostra a produção insignificante pela Treg CD3-baixo, e dois pacientes, mostrando níveis elevados de produção (Figura S1). A secreção de citoquinas pró-inflamatórias, tais como IFN-γ por Treg tem sido descrito anteriormente [16], [24] – [26], e parece ser uma característica única de Treg identificados em doentes com cancro. No entanto, nossos resultados mostram que essa característica é esporádica, e não pode ser invocado para identificação Treg.

As células identificadas pelo CD25

+ FoxP3

+ fenótipo tem fenotípicas e funcionais características de Treg

Ambos CD25 e FoxP3 são conhecidos por ser transitoriamente induzida em Teff após a ativação, o que significa que ativou Teff pode, potencialmente, ser confundido com Treg [27] – [30]. Dado o período de cultura estendida utilizada (21d), é improvável que as células identificadas como CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ no nosso sistema de cultura representam activado Tef, uma vez que a expressão de Foxp3, e, em menor medida CD25, retorna à linha de base após ~ 10 dias [12], [27], [28], [30]. No entanto, para demonstrar adicionalmente que estas células são, de facto Treg, as culturas foram co-corados com um anticorpo contra CD127, que é expresso em níveis muito reduzidos em comparação com Tef Treg [31], [32]. Figura 2A demonstra que as células identificadas como Treg (CD4

+ CD25

+ FoxP3

+) expressaram níveis quase indetectáveis ​​de CD127, enquanto que as células identificadas como Teff (CD4

+ FoxP3

-) expressaram níveis uniformemente elevados. Além disso, quando Treg granel foram FACS classificados de 21D culturas (de acordo com um CD4

+ CD25

+ CD127

– /baixo fenótipo), essas células induziram uma diminuição dependente da dose na proliferação de CD8

+ células T (Fig 2B)

paciente PBMC foram cultivadas durante 21D com-1 NY-ESO 18mer péptido (s) conhecida a partir de estudos preliminares para induzir uma resposta Treg e, em seguida:. (

a

) analisados ​​para a expressão CD127 por citometria de fluxo, gating em Treg (CD4

+ CD25

+ FoxP3

+) ou Teff (CD4

+ FoxP3

-), como indicado. Os resultados apresentados são representativos de três experiências com resultados semelhantes; ou (

B

): Treg foram purificados por classificação CD4

+ CD25

+ CD127

células de baixa e testados quanto à sua capacidade de suprimir a proliferação de CD8 CFSE marcado

+ As células T pré-estimulados durante 16 horas com ligado a placa de anti-CD3. O gráfico mostra a% de supressão relativamente a culturas realizadas na ausência de Tregs, enquanto os histogramas de citometria de fluxo abaixo ilustram perfis CFSE obtidos para células de resposta T sozinho (esquerda) ou em proporção 01:02 com Treg (à direita). Os dados são representativos de três experiências independentes utilizando amostras a partir de três indivíduos diferentes. Em (C), em cultura de PBMC foram re-estimuladas com o péptido e a expressão de LAP relevante sobre a superfície de Tregs ou Teffs foi determinada por citometria de fluxo dentro da população de células CD3-baixo (péptido-responsivos) para três pacientes.

Finalmente, procurou-se determinar se a activação específica de antigénio de Treg conduziu a expressão induzida do péptido associado à latência TGF-β (LAP) na superfície da célula. A indução da expressão após activação LAP é uma característica única de Treg, e esta molécula não é expresso em células Teff, mesmo após activação [18], [33]. A fim de comparar directamente a expressão induzida por activação LAP sobre Treg e Tef, foram identificados três pacientes em que as populações Treg e Teff ambos regulados negativamente CD3 em resposta ao mesmo péptido. PBMC de esses pacientes foram cultivadas por 21d com o peptídeo, re-estimuladas durante a noite e avaliados para CD3 down-regulação e LAP superfície expressão. Tal como mostrado na Figura 2C, LAP foi claramente induzida sobre uma sub-população de Treg responder a NY-ESO-1 de péptido, tal como identificadas pelo fenótipo CD3-baixo. Em contraste, CD3 de baixa Teff respondendo ao mesmo péptido falhou para regular LAP.

Em conjunto, a expressão de um CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ CD127

-. fenótipo juntamente com

in vitro

capacidade supressiva e a capacidade de induzir a expressão de LAP sugerem fortemente que as células analisadas aqui são funcionais Treg em vez de Teff ativado que tem temporariamente up-regulada expressão FoxP3

a regulação negativa de CD3 por Treg é dependente da concentração de péptido

neste estudo, a regulação negativa de CD3 de superfície é utilizada como um marcador da activação específica de antigénio de Tregs via TCR. Assim, a extensão do sub-regulação de CD3 seria esperado para ser estritamente dependente da concentração de péptido. Para confirmar isto, os estudos de titulação de péptidos foram realizados utilizando PBMC de 4 doentes diferentes. Para cada paciente, foram testados dois péptidos, que foram seleccionados com base em experiências preliminares de rastreio como sendo capaz de induzir uma resposta sub-regulação de CD3 em 1 × 10

-4M. Como mostrado na Figura 3, houve uma relação dependente da dose clara entre a proporção de células CD3-baixo Treg e a concentração de péptido utilizado para a re-estimulação. Um número de tais respostas poderiam ser titulada para baixo para 1 × 10

-7M péptido, o que é comparável com vários CD4 anteriormente descrito

+ respostas Teff para o NY-ESO-1 peptídeos [5], [34]. É também importante notar que os péptidos 18mer utilizados aqui provavelmente não constituem o epítopo óptimo para o reconhecimento de células T, no caso em que a resposta detectada quando a concentração de péptido se torna limitante pode ser uma subestimativa considerável.

PBMC de quatro pacientes foram cultivadas durante 21D com NY-ESO-1, em seguida, péptidos 18mer e re-estimuladas durante a noite com péptidos individuais nas concentrações indicadas. A proporção de Treg regulação negativa de CD3 em resposta ao péptido foi determinada por citometria de fluxo.

NY-ESO-1-Treg específica são frequentemente detectada no sangue de doentes com melanoma de fase tardia e pode ser expandida pelo NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM vacina

Um grupo de foi examinado para Treg específica NY-ESO-1 e nove pacientes com melanoma avançado, antes e 42 dias após a vacinação com NY -ESO-1 /ISCOMATRIX

TM. Os resultados estão resumidos na Figura 4A. Após a vacinação, todos os doentes tiveram respostas Treg específicos para, pelo menos, uma região da proteína NY-ESO-1; alguns apresentavam respostas a dois ou três regiões distintas. Surpreendentemente, uma comparação com amostras pré-vacinação revelou que muitas destas respostas foram induzidos pela vacina, uma vez que não foram detectáveis ​​antes da vacinação. Um exemplo de uma tal resposta é mostrada na Figura 4B. Além disso, algumas respostas que eram detectáveis ​​antes da vacinação pareceu ser potenciado pela vacina (como definido a aumento de 2 vezes em células que respondem após a vacinação, quando as duas amostras foram comparadas em paralelo, sob condições idênticas). Por exemplo, na Paciente 120, a frequência de Treg específica para o péptido NY-ESO-1

37-54 foi de 4,4% antes da vacinação, mas 18,3% após a vacinação, bem como a frequência de Treg específica para o péptido NY-ESO-1

79-96 foi de 3,3% antes da vacinação e 16,3% após a vacinação

(

a

):. para cada paciente dentro da coorte, cada resposta Treg validada é resumida com uma caixa. Respostas são considerados validados se eles foram observadas em pelo menos duas culturas independentes, utilizando dois lotes sintetizadas independentemente do péptido. A posição da caixa indica que a sequência do péptido no NY-ESO-1, a resposta foi localizada. No caso em que as respostas foram detectados a dois péptidos adjacentes em sequência, este é mostrado como uma única resposta que mede os dois péptidos. As caixas sombreadas indicam que a magnitude da resposta foi aumentada, pelo menos, duas vezes em amostras de pós-vacinação, em comparação com amostras pré-vacinação, quando ambas as amostras foram testadas em paralelo em condições idênticas. caixas a cheio indicam que a resposta foi apenas detectável em amostras recolhidas após a vacinação. As caixas abertas indicam que a magnitude da resposta era semelhante pré- e pós-vacinação. (

B

): Um exemplo de uma resposta que foi induzida por vacinação (paciente 124) é mostrado. Treg foram fechado com base na expressão de CD25 e FoxP3, e CD3-regulação para baixo foi avaliada após re-estimulação com qualquer um dos péptidos de controlo ou o mesmo péptido utilizado para a expansão (NY-ESO-1

85-102).

Treg e Tef responder a um epitopo idêntico na região NY-ESO-1

157-170

a Figura 4A demonstra que as respostas foram Treg mais comumente visto para o péptido NY- ESO-1

157-174, com Tregs específico para este péptido 18mer detectável em 5/9 pacientes testados. Esta região contém um epítopo (NY-ESO-1

157-170) que foi previamente caracterizado por Tef [35], levantando a possibilidade de que poderia ser Treg de responder ao mesmo epitopo. Para abordar esta possibilidade, dois pacientes (102 e 103) foram identificados que apresentaram respostas ao NY-ESO-1

157-174 péptido em ambos os subconjuntos e Treg Teff, e a capacidade destas células para responder à publicada epitopo (NY-ESO-1

157-170) ou várias variantes de truncagem ou de extensão, foi avaliada. Como mostrado na Figura 5, tanto Treg (painéis da esquerda) e Tef (painéis da direita) responderam ao NY-ESO-1

157-170 péptido. A truncagem de 1 ou 2 aa a partir do N-terminal, ou um AA a partir do terminal C, teve pouco efeito sobre essas respostas. No entanto, ambas as populações apresentaram grandemente reduzida a capacidade de resposta seguinte truncamento de 2 aa a partir da extremidade C-terminal (péptido de NY-ESO-1

157-168). Do mesmo modo, a extensão da sequência de núcleo por uma AA quer no terminal C ou N também reduziu a capacidade de resposta no prazo de ambas as populações.

de PBMC de doentes foram cultivadas durante 21D com o ptido 18mer NY-ESO-1

157- 174 e, em seguida, re-estimulados com os péptidos purificados por HPLC curtas mostradas quer por adição directa à cultura, como de costume (

a-D

) ou pulsando sobre BCL seguido de lavagem (

e-F

). Após incubação durante a noite, as células foram coradas e analisadas por citometria de fluxo, gating em Treg (CD4

+ CD25

+ FoxP3

+;

A, C e E

) ou Teff (CD4

+ FoxP3

-;

B, D e F

). Os péptidos utilizados para a re-estimulação foram baseados no epitopo publicada NY-ESO-1

157-170, com qualquer truncagem (

A-B

) ou extensão (

C-D

) em cada terminal. Gráficos em

A-D

mostram os resultados obtidos para o Paciente 102; Resultados semelhantes também foram obtidos para Paciente 103. Os gráficos em

E-F

show de média + SEM de pacientes 102 e 113; um asterisco indica um valor de p . 0,05 (teste t)

O anteriormente descrito NY-ESO-1 foi mostrado

157-170 epitopo para ser restringido por HLA de classe-de DP4 II alelo [35], e a tipagem molecular revelaram que os pacientes testados na Figura 5 expressa o alelo HLA-DPB1 * 0401 molécula. Para confirmar que as Tregs também respondeu a esta epítopo quando foi apresentado em HLA-DP4, um painel de linhas de células B transformadas por EBV (BCL) foi pulsada com o NY-ESO-1

157-170 péptido, lavadas e testadas para a capacidade de induzir CD3 infra-regulação em células Treg e Teff (Fig 5E-F). Uma expressão de falta DP4 BCL (9902) não conseguiu induzir CD3 infra-regulação em qualquer população, enquanto a BCL expressando HLA-DPB1 * 0401 (linha 9004) induziu uma resposta significativa em ambas as populações. Assim, o NY-ESO-1

157-170 péptido é apresentado tanto Treg e Tef em HLA-DP4.

Em conjunto, estes resultados sugerem que a sequência mínima do anteriormente descrito NY-eso 1

157-170 epitopo [35] poderia ser revista para NY-ESO-1

159-170, ou possivelmente até mesmo para NY-ESO-1

159-169, embora esse peptídeo exata não foi testado em nossos ensaios. Mais importante, no entanto, os dados demonstram que Treg e Tef responder aos exactamente o mesmo epitopo, e em ambos os casos, esta resposta é restrito por HLA-DP4.

NY-ESO-1-específica Treg são predominantes dentro tecido tumoral

Para determinar se o NY-ESO-1-Treg específica pode ser detectado no interior do tumor, assim como o sangue, tecido de tumor fresco foi obtido a partir do paciente 126 depois de três rondas de vacinação com NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM e uma suspensão única célula gerada. A mistura resultante de células tumorais e células estromais, incluindo til, foi cultivado na presença de doses elevadas de IL-2, mas sem a adição de qualquer péptido exógeno, antigénio ou mitogénio. Expanded TIL foram estimuladas durante a noite com péptidos NY-ESO-1

85-102 e NY-ESO-1

115-132 (ambas as quais induziram respostas no sangue periférico Treg deste paciente) e avaliada para CD3 jusante regulamento. Além disso, uma amostra do tumor digestão foi analisada por citometria de fluxo antes da cultura, que revelou que 41,1% de células T CD4

+ T células dentro do tumor tinha um fenótipo Treg, que representa um enriquecimento de 10 vezes aproximada para frequências na sangue (não representada).

Péptido NY-ESO-1

85-102 não conseguiu estimular quaisquer respostas reprodutíveis por qualquer Treg ou Tef dentro TIL. Por outro lado, o peptídeo NY-ESO-1

115-132 induziu uma resposta prontamente detectável por células Teff dentro da TIL expandido (Fig 6A). Surpreendentemente, a magnitude da resposta ao mesmo péptido foi ~ 4 vezes mais elevada na população Treg, com 40% de Treg regulação negativa de CD3 em resposta a este péptido. Para demonstrar a reprodutibilidade desta diferença, três linhas de TIL independentes foram gerados a partir de alíquotas congeladas do mesmo espécime de tumor, e cada linha testados 1-3 vezes. Em cada análise, a proporção de células que respondem ao NY-ESO-1

115-132 péptido foi sempre mais elevada no interior da população Treg do que a população Tef, com uma média de 3,1 vezes diferença (Fig 6B). Pré-incubação com um anticorpo bloqueador a HLA-DR quase completamente inibida tanto as respostas Treg e Teff para este péptido, enquanto que anticorpos bloqueadores de HLA-DP ou HLA-DQ não teve nenhum efeito, indicando que a resposta dentro de ambas as populações foi restrito por HLA -DR (Fig 6C).

tecido

tumor foi obtido a partir do paciente 126 e linhas TIL gerados como descrito no

Métodos

. (

A-B

): As células foram tratadas durante a noite com peptídeo NY-ESO-1

peptídeo 115-132 ou controlo, e em seguida, coradas e analisadas por citometria de fluxo, gating em Treg (CD4

+ CD25

+ FoxP3

+) ou Teff (CD4

+ FoxP3

-), como indicado. fluxo representativas citometria de gráficos de pontos (A) mostra a propagação de Treg e Tef, e a resposta CD3 sub-regulação observado em cada população após re-estimulação, enquanto que (B) mostra um resumo dos resultados obtidos em cinco ensaios, cada um utilizando um de as três linhas de TIL diferentes gerado. (

C

): O efeito do bloqueio de anticorpos contra HLA-DR, HLA-DP ou HLA-DQ na resposta ao péptido NY-ESO-1

115-132 dentro Treg (esquerda) e Tef (direita) populações. Resultados semelhantes foram obtidos numa segunda experiência. (

C

): TIL foram estimuladas durante a noite com NY-ESO-1

115-132 peptídeo e depois peptídeo específico (CD3

lo) e não-específica (CD3

oi) Treg (CD4

+ CD127

lo CD25

oi) foram purificados por separação de células e testados quanto à sua capacidade de suprimir a proliferação de CFSE marcado CD8

células + T pré-estimuladas durante 4 horas com anti- CD3 na Treg indicados: índices de resposta. Como termo de comparação, também foram classificados Treg a partir de PBMC congelados previamente obtido a partir de um dador saudável. Resultados similares foram observados em um segundo experimento, embora Treg superiores:. rácios de resposta foram obrigados a ver a supressão

Na Figura 2, demonstramos que Treg granel isolado a partir de culturas de 21 dias suprimiu a proliferação de CD8

células + T. No entanto, é também de interesse para confirmar que era específico Treg NY-ESO-1-tinha uma actividade semelhante. Expandida TIL do Paciente 126 foram estimuladas com NY-ESO-1

115-132 peptídeo durante a noite para induzir CD3 para baixo-regulação eo Treg específicos de péptidos foram posteriormente classificadas com base em um CD4

+ CD25

+ CD127

– CD3

baixo fenótipo e testado em um ensaio de supressão. Estas células suprimiu a proliferação de CD8 anti-CD3 estimulou

+ células T de um dador saudável para um grau semelhante como grandes quantidades de Treg isolado de um dador saudável (Figura 6D). Curiosamente, CD3

oi Tregs classificadas a partir da linha TIL (ie, Treg que não responderam ao péptido estimulação) proliferação

+ células T CD8 também suprimiu, sugerindo que a estimulação antigênica recente não era essencial para a aquisição de supressor função por estas células. Possivelmente, a presença de células tumorais durante o estabelecimento da linha de TIL activado Tregs específico para uma vasta variedade de epitopos antigénicos tumorais, e este estado activado foi mantida durante a expansão, permitindo assim Treg com uma variedade de especificidades de antigénio para exercer a actividade supressora.

Juntos, estes resultados demonstram que o tecido do tumor a partir do paciente 126 contém uma população proeminente de Treg específico para um epítopo de HLA-DR-restrito dentro do NY-ESO-1

115-132 péptido. Além disso, Treg específica para este epitopo pode suprimir a proliferação de células CD8

+ T e são, portanto, totalmente funcional. coloração imunohistoquímica de tecido do tumor revelou que as células tumorais ainda expressa níveis elevados de NY-ESO-1 no momento (dados não mostrados), sugerindo que o tecido residente NY-ESO-1-específica Treg podem ser activados localmente.

Discussão

no presente estudo, nós utilizamos uma nova abordagem que permite a identificação imparcial de Treg específicas para qualquer epitopo dentro de um antigénio tumoral dada. Nós demonstramos que o NY-ESO-1-específica Treg são muito comuns no sangue de doentes com melanoma de fase final, como eles eram detectáveis ​​em 9/9 pacientes testados. Além disso, em seis desses nove pacientes, o NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM vacina seja induzida pelo menos uma nova resposta que não era detectável antes da vacinação ou a potencialização das respostas pré-existentes.

devido à escassez de células tumorais específicas para o antigénio T (incluindo Treg) no sangue, que era necessária para expandir essas células in vitro com antigénio. Este passo de cultura pode ter induzido uma temporária sobre-regulação de Foxp3 e CD25 em células Teff, como foi reportado anteriormente [27] – [30], e estas células poderiam teoricamente ter sido confundidos com Treg. No entanto, diversas linhas de evidência sugerem fortemente que este não é o caso. Em primeiro lugar, estas células suprimiu a proliferação de células T CD8

+ células T, quando avaliada como seja uma população a granel (Figura 2) ou isolado de acordo com o NY-ESO-1 especificidade (Fig 6). Em segundo lugar, eles expressaram baixa para níveis indetectáveis ​​de expressão CD127. Terceiro, eles LAP up-regulamentado após a ativação com o peptídeo cognato. Finalmente, as populações Treg e Teff em pacientes individuais, por vezes, reconhecer epítopos diferentes (tal como no exemplo mostrado na Figura 1), proporcionando evidência de que estes são populações discretas, e o Treg não foram simplesmente obtida por transformação de Tef reconhecendo o mesmo epitopo. Nossa conclusão de que CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ células presentes em culturas de 21 dias são Treg e não activado Teff está de acordo com estudos anteriores que mostram que a aquisição desses marcadores por Teff é temporária, e expressão é em grande parte perdido a dia 10 da cultura [12], [27], [28], [30]. De nota, dois estudos anteriores também identificaram Treg específica NY-ESO-1-no sangue de pacientes com melanoma usando abordagens alternativas, apoiando ainda mais nossos resultados [12], [24].

As respostas Treg detectado em nosso estudo abrangem uma grande porção da proteína NY-ESO-1. Embora a caracterização detalhada de cada um desses epitopos está além do escopo deste estudo, pudemos confirmar que a frequência detectada resposta Treg ao peptídeo 18mer NY-ESO-1

157-174 foi devido ao reconhecimento do descrito anteriormente DP4- imunodominante restrito NY-ESO-1

epitopo 157-170. Assim, temos mostrado de forma conclusiva que Treg e Teff pode reconhecer exatamente o mesmo epitopo mínimo apresentado no mesmo alelo HLA. Isto por sua vez sugere que Treg humana e Tef compartilhar repertórios de TCR, pelo menos, parcialmente sobrepostas, o que está de acordo com estudos anteriores em seres humanos [36] e ratinhos [37]. Por outro lado, uma das respostas Treg detectados aqui (dentro da região NY-ESO-1

49-72) não contém qualquer anteriormente descrito epitopos teff (ver https://www.cancerimmunity.org/peptidedatabase) e esta resposta não foi detectado na população Tef neste paciente (dados não mostrados). Assim, esta especificidade pode ser único para a população Treg.

É ainda uma questão em debate se Treg medeiam os seus efeitos supressores, principalmente, os órgãos linfóides secundários, em sítios locais na periferia (tais como tecido tumoral) ou, mais provavelmente, uma combinação de ambos. Por razões práticas, temos avaliaram as respostas Treg específicas NY-ESO-1-predominantemente no sangue, que devem reflectir as células circulantes através de órgãos linfóides secundários. No entanto, para o paciente 126, que pode, adicionalmente, obter tecido de tumor fresco e demonstram que Treg específico para um epítopo de HLA-DR-restrita dentro de peptídeo NY-ESO-1

115-132 não estavam presentes apenas no sangue mas também estavam presentes a alta frequência no interior do tumor. Estes NY-ESO-1

Treg específicas de 115-132 foram completamente funcional, uma vez que suprimiu CD8

+ proliferação de células T.