Abstract

fator de choque de calor 1 (HSF1) é um regulador mestre que coordena a expressão da proteína acompanhante para aumentar a sobrevivência celular em face do estresse térmico. Em células cancerosas, HSF1 dirige um programa transcripcional distinta de choque de calor para promover metástases e sobrevivência celular. Sua forte associação com o fenótipo maligno implica que os antagonistas HSF1 pode ter utilidades gerais e eficazes na terapia do câncer. Para este efeito, tínhamos identificado um aptâmero RNA ávido por HSF1 que é portátil entre diferentes organismos modelo. Estendendo nosso trabalho anterior em levedura e Drosophila, aqui vamos relatar a actividade deste aptâmero em linhas celulares de cancro humano. Quando entregue nas células utilizando um gene sintético e promotor forte, neste aptâmero era capaz de prevenir HSF1 de se ligarem aos seus elementos de regulação de ADN. Ao nível celular, a expressão de apoptose induzida por este aptâmero e aboliram a capacidade de formação de colónias de células cancerosas. Ao nível molecular, reduziu chaperonas e atenuou a activação da via de sinalização MAPK. Colectivamente, estes dados demonstram a vantagem de aptâmeros na validação alvo da droga e apoiar a hipótese de que a actividade de ligação DNA HSF1 é um alvo potencial para controlar a transformação oncogénica e crescimento neoplásico

Citation:. Salamanca HH, Antonyak MA, Cerione RA , Shi H, Lis JT (2014) inibir calor fator de choque 1 em células cancerosas humanas com um potente RNA Aptamer. PLoS ONE 9 (5): e96330. doi: 10.1371 /journal.pone.0096330

editor: Sandy D. Westerheide, University of South Florida, Estados Unidos da América

Recebido: 18 Janeiro, 2014; Aceito: 04 de abril de 2014; Publicado em: 06 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Salamanca et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) concede (GM25232 a JT Lis; CA140730 a JT Lis e H. Shi; Minority Suplemento # 25.232-2.351 a JT Lis e HH Salamanca), e da Universidade de Cornell (Provost Diversidade Fellowship para HH Salamanca). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o choque térmico fator 1 (HSF1) é um fator de transcrição que responde a uma variedade de estressores ambientais para ativar a resposta ao choque térmico em eucariotos, um mecanismo de proteção conservadas entre os diferentes reinos [1]. insultos fatigantes, tais como a exposição térmica, estimular HSF1 para actuar como um activador do mestre de um conjunto de genes alvo. Em particular, ele faz com que a acumulação de proteínas com actividades chaperoning, tais como proteínas de choque térmico (HSP), HSP70 e HSP90, que ajudam a manter a homeostase intracelular protegendo o proteoma contra os efeitos tóxicos do enrolamento incorrecto da proteína e a agregação de [2]. Enquanto há apenas um HSF em

Saccharomyces cerevisiae

e

Drosophila melanogaster

, existem múltiplas isoformas em mamíferos e plantas, que parecem ter funções especializadas [3] – [5]. HSF1 função é essencial para a resposta ao stress e viabilidade em levedura [6], e importante para a oogénese e desenvolvimento precoce em Drosophila [7]. HSF1 também está envolvido no processo de envelhecimento em

C. elegans

[8], bem como no desenvolvimento embrionário e extra-várias doenças importantes em mamíferos [9].

Paradoxalmente, sob certas circunstâncias, a capacidade da HSF1 para promover a sobrevivência de células pode pôr em risco o bem-estar global ser de um organismo multicelular. Um exemplo comovente é a função do HSF1 no câncer. Há muito que se observou que as células cancerosas pode continuar a proliferar em microambientes hipóxicas e hostis que são de outro modo inibidor de crescimento para as células normais. Portanto, não é surpreendente que as células cancerosas apresentam níveis elevados de proteínas de choque térmico (HSPs) para facilitar a dobragem de proteínas danificadas e a solubilização de agregados de proteína [10]. Embora esta observação sugere um papel indireto de HSF1 na progressão do cancro, um impacto direto de HSF1 na malignidade foi descoberto recentemente [11]. Com efeito, HSF1 é encontrado para ser activado em uma ampla variedade de células malignas, e o padrão de ADN de ocupação por HSF1 em tais células cancerosas é diferente da das células normais expostas a choque térmico. Assim, HSF1 dirige um programa transcripcional distinta que promove a transformação celular e mantém o crescimento maligno. Além de muitos genes de choque térmico clássico, genes específicos do cancro neste regulação do ciclo celular de apoio ao programa, sinalização, metabolismo, adesão e tradução. Porque esta assinatura HSF1 está associada com os resultados dos pacientes pobres de diferentes tipos de cânceres humanos, incluindo os de mama, pulmão e cólon, HSF1 pode ser um alvo para terapias de câncer gerais e eficazes [11].

Para efeitos de estudar e controlar a função de HSF1 em células e organismos, que anteriormente identificado um aptâmero de ARN, AptHSF-RA1 [12]. O aptâmero foi inicialmente isolado em um

in vitro

experimento de seleção usando Drosophila HSF1 como o alvo, e mais tarde demonstrou ser capaz de reconhecer HSF1 em leveduras, Drosophila e humanos. A análise de deleção definiram um motivo de ligação mínima do aptâmero composta por duas hastes e uma haste-laçada ligados por uma junção de três vias [12]. Este aptâmero interage com o domínio de ligação ao ADN e uma região de ligação adjacente de HSF1, e compete com os elementos de ADN de choque térmico (HSES) para a ligação a HSF1. Em extractos de células de levedura, o aptâmero inibe a transcrição a partir de promotores de choque térmico, e quando expresso em células de levedura viva, que produz um fenótipo sensível à temperatura e atraso de crescimento específico diminuição da expressão de genes de choque térmico [13]. Em Drosophila, este aptâmero reduz os níveis de Hsp83 e provoca anomalias do desenvolvimento que imitam os fenótipos de redução Hsp83. O aptâmero também suprime eficazmente os fenótipos induzidas por formas constitutivamente activa do receptor EGF e oncoproteínas Raf, que são regulados proteínas “cliente” da Hsp83 [14].

Aqui no presente estudo, relatamos o anti- actividade câncer desta aptâmero HSF1 em células humanas em cultura. Adotamos a configuração dimérica de AptHSF-RA1 usado em Drosophila [14], que foi nomeado iarna

HSF1 ( “ia” significa “aptâmero inibidor”), e entregue-a em células de carcinoma cervical HeLa na forma de um sintético por transfecção do gene. A actividade anti-cancro do aptâmero foi então investigada por meio de três linhas de estudos. Primeiro, confirmou o mecanismo molecular da ação aptâmero determinando a interrupção da interação de HSF1 com os seus elementos de ADN cognato

in vitro

e

in vivo

. Em segundo lugar, foi demonstrada a capacidade do aptâmero, quando expressa em células cancerosas, para promover a apoptose e inibir a formação de colónias em agar mole. Finalmente, resolver o problema de especificidade em células mostrando: (1) os fenótipos de aptâmeros são suprimida por sobre-expressão de HSF1 ou HSPs, (2) expressão aptâmero reduz a expressão do gene alvo HSF1, e (3) expressão aptâmero reduz o HSF1 modulada, via de sinalização MAPK. Colectivamente, os nossos resultados estão de acordo com relatórios anteriores que mostram que HSF1 é crítica para a manutenção da transformação celular. Além disso, nossos resultados levantam a possibilidade interessante que um aptâmero que funcionalmente inactiva HSF1 pode ser usado para bloquear a progressão do cancro humano.

métodos e materiais

Expression constrói

A seqüência de a construção aptâmero dimérica, iarna

HSF1 é o seguinte (as letras minúsculas representam a ribozima): 5′GUCGAGUGACGUUGGCAUCGCGAUACAAAAUUAAGUUGAACGCGAGUUCUUCGGAAUUCAACUGCCUUCGUCAUACUCCUUGAAUUCAACUGCCUUCGGGCAUCGCGAUACAAAAUUAAGUUGAACGCGAGUUCUUGGAGGCUCGACguc uagcgaugugguuucgcuacugaugaguccgugaggacgaaac 3 ‘. No processo de construção do vector de expressão para o aptâmero dimérica, uma construção anti-sentido de controlo, RevRA1, foi gerado, utilizando conjuntos de iniciadores que trocou a cadeias parentais e de retardamento da região de codificação, mantendo a unidade de cabeça de martelo intacta aptâmero. Ambos sentido e anti-unidades foram clonados em vectores de gateway [14] e mudou-se para pDest51 (Invitogen) para a expressão do aptâmero e o controle em células de mamífero. A sequência de codificação de “resgate” de proteínas e os seus controlos, incluindo HSF1, HSP90, HSP70, LacZ e GFP, foi clonado cada jusante do promotor de CMV num vector diferente com G418 como o marcador selectivo.

cultura celular e transfecção

as células utilizadas neste estudo foram obtidas da ATCC e mantidas de acordo com as instruções do fabricante. HeLa (CCL-2), IMR-90 (CCL-196), 293T (CRL-3216), MCF7 (HTB-22), U87 MG (HTB-14) e BE (2) -M17 (CRL-2267) As células foram cultivadas em E-MEM glicose baixa (ATCC) suplementado com 10% de FBS, 1X Pen /Strep em 5% de CO

2. MDA-MB-231 (CRM-HTB-26) foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 10% de FBS, 1X Pen /Strep em 5% de CO

2. As células 293T foram cultivadas em meio DMEM rico em glicose (ATCC) suplementado com 10% de FBS, 1X Pen /Strep em 5% de CO

2. Após crescimento até à confluência, as células foram tripsinizadas e passadas para meio fresco de acordo com as instruções da ATCC. Estas células progenitoras foram transfectadas com iarna

HSF ou ARN RevRA1 vectores que expressam o controlo. As células não transfectadas foram subsequentemente eliminado da população por cultura das células em 6 ug /ml de blasticidina e lavagem das células 24 horas após a transfecção. Em seguida, as células foram mantidas e cultivadas em (1 ug /ml) blasticidina. Apenas foram utilizadas as células resistentes blasticidina-Através de testes subsequentes. Para as experiências de “salvamento”, as construções de expressão HSF1 humana (hHSF1), Hsp90 humana (hHSP90), Hsp70 humana (hHSP70), LacZ ou GFP foram misturados com os vectores de expressão para HSF aptâmero (ou ARN de controlo) a uma razão de 20:01 para assegurar a expressão apropriada e excesso dos alvos interessadas relativos aos aptâmeros. Depois os plasmídeos foram misturados, cada mistura foi transfectado em células HeLa em placas de 6 poços. As células não transfectadas foram lavados utilizando métodos descritos acima e as células restantes foram mantidas em meio de seleção.

EMSA

O regime geral de teste de desvio de mobilidade eletroforética (EMSA) foi adotada e modificada a partir de trabalho anterior [12]. As sondas de ARN foram internamente marcado com [a-

32P] UTP utilizando um T7

In vitro

kit de transcrição (MAXIscript, Ambion, Austin, TX). Os 10 ul de solução de ligação continha tampão 1X de ligação, 1 ug de ARN de levedura transportador, BSA transportador 4 ug, DTT 5 mM, glicerol a 10%, 6 unidades de SUPERase-Na (inibidor de ARNase), mais proteína e ARN marcado aptâmero. A concentração da sonda de ARN marcado está abaixo de 1 nM, na maioria dos experimentos. O gene HSF1 humana foi obtido a partir do laboratório de Thiele [15] e foi subclonado no sistema de expressão Gateway como uma sua fusão. A proteína marcada com His hHSF expressa em bactérias foi purificado por cromatograf ia Ni-NTA. Este purificado marcada com His hHSF1 proteína foi incubado com ARN aptâmero à temperatura ambiente durante 30 min e 10 min a 4 ° antes de carregar num gel de poliacrilamida nativo de 6-9%. Os géis continham 1/4 tampão TBE e MgCl 1 mM de

2 e foram corridos a 100-150 V a 4 ° C durante 1-2 h.

RT-PCR

RT -PCR foi realizada 24 horas após a transfecção de acordo com um protocolo descrito anteriormente utilizando os seguintes iniciadores

iarna

HSF1 F:.

5′-GTCGAGTGACGTTGGCATCG

iarna

HSF1 R:

5’GACGTCGAGCCTCCAAGAAC

iarna

Rev F:

5′-GTCGAGCCTCCAAGAACTCG

iarna

Rev R :

5’GACGTCGAGTGACGTTGGCA

Cromatina imunoprecipitação (CHIP)

ensaio ChIP foi realizada 36 horas após a transfecção de acordo com um protocolo descrito anteriormente [16], utilizando anticorpos contra HSF1 ou HSF2 gentilmente cedido pelo Dr. Richard Morimoto.

Western blot

As amostras foram preparadas 72 horas após a transfecção para análises moleculares salvo indicação em contrário. Para o exame da caspase-3 foram preparadas amostras entre 72-96 horas. Em resumo, as células foram alimentadas a cada 48 horas, e as amostras foram coletadas por centrifugating a mídia, sedimentando as células. Além disso, as células aderentes foram desfeitos em PBS, sedimentadas e combinadas com as células nos meios de comunicação. Então, as amostras foram lisadas na presença de detergentes não-iónicos que contêm inibidores de protease, e as amostras foram fervidas na presença de SDS-6X. protocolos de transferência de Western convencionais foram usados ​​com os seguintes anticorpos. Anticorpos Primários: G6PDH foi adquirido da Sigma (A9521). Todos os outros anticorpos foram adquiridos da Cell Signaling Inc .: HSF1 (No. 4356), Hsp90 (No. 4875), Hsp70 (No. 4872), Hsp60 (No. 4870), Hsp40 (No. 4868), Calnexina (No. 2433), GRP78 (No. 3177), EGFR~p (No. 2234), ERK1 /2~p (No. 9146), o total de ERK1 /2 (No. 9102), caspase-3 (# 9662). O anticorpo PARP foi anti-PARP DBD, um presente do Dr. W. L. Kraus e transglulaminase (TGM2) foi um presente do laboratório do Dr. R. Cerione comprado de Thermo Scientific. Os anticorpos secundários foram utilizados de acordo com a imunorreactividade apropriada. As membranas de PVDF foram bloqueadas com BSA a 5% e foram incubadas membranas de anticorpos primários a noite a 4 ° C.

apoptótica ensaio

A apoptose foi observada por meio da quantificação do número de células HeLa contendo núcleos fragmentados como visualizado por a coloração DAPI sob o microscópio. Nestas experiências, iarna,

HSF ou ARN RevRA1 células de controlo parental foram observados durante 96 horas após a transfecção. Nestas experiências, não-transfectadas iarna

HSF foi removido por cultura das células em 6 ug /ml de blasticidina e lavagem das células 24 horas após a transfecção. Apenas foram utilizadas as células resistentes blasticidina-Através de testes subsequentes. Todas as análises estatísticas deste estudo foram calculados utilizando o teste t de estudante.

ensaio de crescimento independente Anchorage

6 × 10

3 células transfectadas semi-estáveis ​​foram semeadas em placas de 6 poços em meio apropriado suplementado com 3% de agarose (Tipo VII, Sigma A4018) sobre uma camada quente do meio de pré-solidificado contendo 6% de agarose (Tipo VII, Sigma A4018). Cinco dias após o plaqueamento das células de uma nova camada de 1 cm de meios foram plaqueadas sobre as células em crescimento. As células HeLa contendo 17-AGG tinha uma concentração final de 8,8 ug /dl mistura de ágar 17-AAG. A capacidade das células para crescer em agar macio foi avaliada após 14 dias. Colónias foram analisadas ao microscópio óptico.

Resultados

iarna

HSF1 impede HSF1 de se ligar aos seus elementos de ADN reguladores em células de carcinoma HeLa

Anteriormente, foi desenvolvido um método para a entrega de aptâmeros de RNA em núcleos de células como genes sintéticos [17] e é usado para expressar o aptâmero para HSF1, AptHSF-RA1, em Drosophila [14]. Esta construção de ARN, denominada iarna

HSF1, contém duas unidades aptameric para avidez melhorada e um ribozima no qual o 5 ‘e 3’ do ARN são protegidos para facilitar a dobragem e a estabilidade. Nós adaptada esta construção, colocando a sua sequência de codificação sob o controlo do promotor de EF-1a num vector de expressão de mamífero. Nós também uma construção de controlo, denominada RevRA1, em que a porção do aptâmero iarna

HSF1 foi substituído pela sua sequência anti-sentido. Antes de usá-lo em células, que produziu este RNA pelo

na transcrição vitro Comprar e determinou a sua avidez por HSF1 humana purificada num ensaio de desvio de mobilidade eletroforética (EMSA) (Figura 1A) utilizando proteína HSF1 humano purificado (Figura S1A) . Aqui, o iarna

HSF1 gerado um complexo deslocado com uma aparente K

d de 25 nM (Figura 1B). Em contraste, o controle RevRA1 não mostrou qualquer ligação. Além disso, quando quantidades limitantes de iarna

HSF1 foi incubada com quantidades elevadas de BSA purificado (1