Abstract

O

MDM2

proto-oncogene desempenha um papel fundamental nos processos celulares centrais como o controle de crescimento e apoptose, e o local do gene é frequentemente amplificada em sarcomas. Dois polimorfismos localizados no promotor P2 MDM2 foram mostrados para afectar o risco de cancro. Um destes polimorfismos (SNP309T G; rs2279744) facilita Sp1 factor de transcrição de ligação ao promotor e está associada com risco aumentado de cancro. Em contraste, SNP285G C (rs117039649), localizada 24 pb a montante do rs2279744, e em desequilíbrio de ligação completa com o alelo SNP309G, reduz o recrutamento SP1 e reduz o risco de câncer. Assim, a sintonia fina de expressão MDM2 provou ser de importância significativa em relação à tumorigênese. Foram avaliados os potenciais efeitos funcionais de um terço

MDM2

polimorfismo do promotor P2 (SNP344T A; rs1196333) localizados no alelo SNP309T. Enquanto

in silico

analisa SNP344A indicada para modular TFAP2A, SPIB e fator de transcrição AP1 ligação, temos não encontrou nenhum efeito do status SNP344 em níveis de expressão de MDM2. Avaliando a frequência de SNP344A em caucasianos saudáveis ​​(n = 2.954) e os pacientes que sofrem de ovário (n = 1.927), mama (n = 1.271), endometrial (n = 895) ou o cancro da próstata (n = 641), detectamos nenhuma significativa diferença na distribuição desse polimorfismo entre qualquer dessas formas de câncer e controles saudáveis ​​(6,1% em controles saudáveis, e de 4,9%, 5,0%, 5,4% e 7,2% nos grupos do cancro, respectivamente). Em conclusão, nossos resultados fornecem nenhuma evidência indicando que SNP344A pode afetar a transcrição MDM2 ou risco de câncer

Citation:. Knappskog S, Gansmo LB, Romundstad P, Bjørnslett M, Trovik J, Sommerfelt-Pettersen J, et al. (2012)

MDM2

Promotor SNP344T A (rs1196333) Estado não afeta o risco de câncer. PLoS ONE 7 (4): e36263. doi: 10.1371 /journal.pone.0036263

editor: Klaus Roemer, Universidade de Saarland, Alemanha |

Recebido: 20 de fevereiro de 2012; Aceito: 04 de abril de 2012; Publicado: 30 Abril 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Knappskog et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado por subsídios da sociedade contra o cancro da Noruega e da Noruega Região de Saúde Oeste. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O rato Duplo Minuto 2 homólogo (MDM2) é um regulador chave da p53, assim como a função da proteína do retinoblastoma [1], [2], [3]. Assim, os níveis de proteína MDM2 elevados devido à

MDM2

amplificação do gene ou outros mecanismos têm sido considerados como uma alternativa ao

TP53

mutações decrescentes função de p53 em muitos cancros humanos [2], [4], . [5], [6], [7]

em 2004, o grupo de A. Levine descobriu um polimorfismo SNP309T G (rs2279744) no

MDM2

promotor P2 intrônica [8] . Melhora SNP309G

MDM2

níveis de expressão, aumentando fator de transcrição Sp1 vinculativo e posteriormente foi demonstrado estar associado com um risco aumentado e uma idade precoce no diagnóstico de várias doenças malignas [8], [9], [10].

Embora estudos subsequentes confirmaram uma associação entre SNP309G eo risco de múltiplas formas de câncer, o efeito deste SNP parece diferir entre grupos étnicos: Assim, enquanto a maioria dos estudos realizados em populações judaicas asiáticos ou Ashkenazi relata a variante SNP309G para . melhorar risco de câncer de muitos estudos realizados em populações caucasianas não conseguiram reproduzir um efeito semelhante [11], [12]

recentemente, nós relatamos um segundo polimorfismo, SNP285G C (rs117039649), localizado 24 pares de bases de SNP309 no

MDM2

promotor P2. O alelo variante SNP285C é observada entre os caucasianos apenas, em quem ele forma uma SNP285C /309G haplótipo distinta respondendo por cerca de 12% dos alelos SNP309G [13]. SNP285C antagoniza o efeito de SNP309G reduzindo Sp1 factor de transcrição força de ligação para o

MDM2

promotor e está associada com um risco reduzido de cancro da mama, do ovário e cancro do endométrio [13], [14].

em conjunto, os dados dos estudos sobre SNP309 e SNP285 indicam fortemente a afinação do

MDM2

atividade do promotor P2 ser de importância para o risco de câncer. É, portanto, de interesse para procurar variantes adicionais no

MDM2

promotor que pode contribuir para o risco de câncer alterada

SNP344T . A (rs1196333), localizado a 35 pares de bases a jusante do SNP309, foi inicialmente identificado por bond et [8] al em 4 dos 50 indivíduos saudáveis. Aqui, apresentamos o primeiro relatório de avaliação do impacto do estado SNP344 na expressão MDM2, bem como o risco de câncer em grandes populações. Assim, examinamos seu impacto sobre o risco de ovário, mama, endométrio e câncer de próstata, e estudou as mesmas coortes de pacientes para os quais os perfis de risco ligados ao SNP309T G e SNP285G C tenham sido previamente analisados ​​em detalhe [13], [14].

Materiais e Métodos

MDM2

promotor SNP344 status de triagem

a região do

MDM2

P2 promotor contendo SNP344 (bem como SNP285 e SNP309) foi previamente amplificada por PCR, sequenciadas e analisadas para SNP285 e estado SNP309 [13], [14]. Aqui, esses traços de sequência foram analisados ​​para o status SNP344.

In silico

previsões

As previsões de potenciais locais de ligação de transcrição no

MDM2

promotor afetada pela estatuto SNP344 foram realizados utilizando o banco de dados Jaspar em https://jaspar.genereg.net [15]. seqüências de entrada para as previsões eram

tgcctgtcgggtca

para o SNP344T-alelo e

tgcctgacgggtca

para o SNP344A-alelo. Perfil limiar de pontuação foram definidos para 80% (configurações padrão).

análise de expressão MDM2

O RNA total foi extraído de células brancas do sangue extraídas de 215 jovens do sexo masculino, como parte de um teste de rotina durante o serviço militar obrigatório na a marinha [13] utilizando o reagente Trizol (Life Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante, e dissolvido em ddH tratada com DEPC

2O.

a síntese de cDNA de cadeia simples foi realizada utilizando 500 ng de ARN total, de oligo-dT – e iniciadores aleatórios de hexâmero (Sigma) com transcriptor transcriptase reversa (Roche) de acordo com as instruções do fabricante. Após RT-PCR, o ADNc foi diluído 1:10 em DDH

2O.

PCRs quantitativos para os níveis de expressão de MDM2 no total, 2 promotor MDM2 expressão e RPLP2 (referência interna) específicos foram realizados usando sondas de hidrólise ( TIB MOLBIOL) num instrumento Ligthcycler 480 (Roche). Foram utilizados os seguintes iniciadores: MDM2_F; aacatgtacctactgatggtgc, MDM2_R; cagggtctcttgttccgaagc, MDM2_TM; 6FAM-aaccacctcacagattcc-BBQ, MDM2P2_S; gcgattggagggtagacctgt, MDM2P2_R: ggtattgcacatttgcctggat, MDM2P2_TM; 6FAM-agtggcgtgcgtccgtgcc-BBQ, RPLP2_F; gaccggctcaacaaggttat, RPLP2_A; ccccaccagcaggtacac e RPLP2_TM; 6FAM-agctgaatggaaaaaacattgaagacgtc-BBQ. As amplificações foram realizadas num volume de reacção de 10 uL usando o kit de Sondas LigthCycler® 480 mestre (Roche) com 0,5? M de iniciador para a frente e, 0.125 uM de cada sonda de hidrólise e de cDNA 3 ul reversa. As condições de ciclos térmicos foram os seguintes: 5 minutos de desnaturação inicial a 95 ° C, antes de 45 ciclos a 95 ° C durante 10 s e a 55 ° C durante 20 s, e uma etapa de arrefecimento final a 40 ° C durante 10 s. concentrações relativas de ARNm de MDM2 foram calculados com base na in-executar curvas padrão e normalização de níveis de mRNA RPLP2 nas mesmas amostras. Água foi incluído em cada controlo executado como negativo e todas as análises foram realizadas em corridas em triplicado.

controles caucasianos saudáveis ​​

A distribuição de

MDM2

SNP344 entre pacientes com câncer foi comparado com 2.954 controles saudáveis ​​norueguês. Os controles foram descritos em detalhes anteriormente [13], [14].

indivíduos afro-americanos

DNA de indivíduos afro-americano (n = 50) foi adquirida pelo Instituto Coriell de Investigação Médica ( Cat # HD50AA).

Os pacientes com câncer

ovário (n = 1.927), mama (n = 1.271), endometrial (n = 895) e pacientes com câncer de próstata (n = 641) eram de coortes de pacientes que foram previamente analisados ​​para

MDM2

SNP285 e SNP309 [13], [14].

Considerações

Ética

Obtenção e utilização de amostras de pacientes com câncer e controles saudáveis , bem como controles para a expressão de análises, foi aprovado pelos Comitês de Ética Regional do Oeste da Noruega (Hospital Universitário Haukeland), Central Norway (Universidade norueguesa de Ciência e Tecnologia) e do Sudeste Noruega (Oslo University Hospital Radiumhospitalet; amostras norueguesas) e os médicos Comitês de Ética do Centro Universitário de Leiden Medical, Leiden, Holanda, eo Erasmus MC-Daniel den Hoed Cancer Center Rotterdam, Países Baixos (amostras holandeses). Todos os participantes assinaram termo de consentimento.

A análise estatística

Os níveis de expressão de MDM2 entre indivíduos com diferentes genótipos de SNP344 foram comparadas pelo teste de classificação Mann-Whitney. Entre os indivíduos para os quais foi analisada a expressão de MDM2 (n = 215), um abrigou o genótipo SNP344AA. Para cálculos estatísticos, este indivíduo foi incluído no grupo SNP344TA e em comparação com o grupo SNP344TT.

As diferenças de potencial na distribuição de SNP344 entre doentes com cancro e controlos saudáveis, bem como entre os subgrupos de cada forma foram avaliadas por cancro odds Ratio (OR) e pelo teste exato de Fischer. RUP são dadas com intervalos de confiança de 95% (IC).

As diferenças de potencial em idade de início da doença entre os pacientes foram avaliados por meio de testes de classificação de Kruskal-Wallis.

A sobrevivência foi avaliada por Kaplan analisa Meier onde os diferentes grupos de pacientes foram comparadas pelo teste de log rank; mortes para além do câncer de mama foram censurados razões.

Todos os valores-p são frente e verso, e p-valores estimados pelo teste exato de Fischer são cumulativos. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o SPSS /PASW (versão 15.0.1 e 17) pacote de software

Resultados

SNP344:. Status de haplótipos e distribuição étnica

SNP344 (rs1196333 ) situa-se dentro de

MDM2

promotor P2, 344 pb a jusante do exão 1 (Figura 1). Entre 2.954 controles saudáveis ​​norueguesa, observamos a SNP344A variante em 181 indivíduos (6,1%). Um indivíduo abrigava o genótipo homozigoto SNP344AA, enquanto 180 eram heterozigotos (SNP344TA; Tabela 1). Assim, a freqüência do alelo menor foi de 3,1%, e a distribuição de genótipos estava de acordo com Hardy-Weinberg.

(A) O promotor está localizado entre o exão 1 e 2 do

MDM2

gene e abriga SNP285 (rs117039649), SNP309 (rs2279744) e SNP344 (1.196.333). (B) cromatograma sequenciamento Representante de um heterozigoto individual para SNP344 (sequência mostrou como complementares à cadeia de sentido inverso).

Em particular, observou-se a SNP344A-variante apenas entre os indivíduos portadores do SNP309TT ou TG genótipo, indicando fortemente SNP344A para ser localizado no SNP309T-alelo, fazendo uma distinta SNP309T /344a haplótipo (p 1 × 10

-10). Além disso, como SNP285C está localizado na SNP309G-alelo, pode-se deduzir que SNP344A só existem no haplótipo SNP285G /309T /344a.

Em uma coorte de afro-americanos (n = 50) encontramos 17 (34 %) indivíduos para abrigar SNP344A (um homozigoto e 16 heterozigotos). Esta freqüência foi significativamente maior em comparação com a frequência observada entre os caucasianos (p 0,001). Notavelmente, a distribuição de SNP344 entre afro-americanos estava de acordo com os dados limitados sobre este SNP apresentada no banco de dados Ensembl. Quanto aos caucasianos, encontramos o SNP344A de alelo apenas entre os afro-americanos portadores do SNP309T-alelo.

Efeito do estado SNP344 no fator de transcrição de ligação

A fim de avaliar o impacto potencial do estado SNP344 no fator de transcrição de ligação, foi realizada

in silico

análises usando o banco de dados Jaspar [15], prevendo fator de transcrição de ligação ao SNP344T e-alelos a. Usando o “tipo selvagem” sequência SNP344T-alelo e um limiar de pontuação perfil de 80% (configurações padrão) na busca de banco de dados, dois fatores de transcrição locais de ligação foram identificados, incluindo a posição de SNP344: um sítio de ligação para TFAP2A e um para SPIB (Mesa 2). Quando se substitui o SNP344T com o A-variante, a força de ligação previsto de TFAP2A foi ligeiramente aumentada embora o local para SPIB foi interrompido. Além disso, a introdução de uma gerado um novo local de ligação para o AP1. Assim, a eficácia de transcrição do A-alelo, em comparação com o alelo T, ou poderia ser reduzida devido a um local SPIB perturbada ou aumentada devido ao aumento da ligação de TFAP2A e um local de AP1 romance.

níveis de status SNP344 e MDM2 expressão

Para avaliar o impacto potencial de SNP344 genótipo sobre expressão de MDM2, foram analisados ​​os níveis de mRNA MDM2 em leucócitos de um subgrupo de 215 jovens do sexo masculino saudáveis ​​por qPCR. Nenhuma diferença no nível de expressão de MDM2 entre os indivíduos portadores do SNP344AA (n = 1), 344TA (n = 10) ou 344TT (n = 204) genótipos foi gravado (p 0,5 Figura 2A)

Box-plots. representando log transformado níveis relativos de mRNA total de MDM2 (a) e mRNA específico promotor P2 (B) em indivíduos portadores do genótipo SNP344TT contra os genótipos TA e AA.

Uma vez que o SNP344A variante reside no as análises SNP309T alelo, foi realizada sub-grupo separado restrita a indivíduos portadores do SNP309TG (n = 101) ou 309TT (n = 75) dos genótipos. Não houve diferença no nível de expressão de MDM2 relacionadas com o estado SNP344 foi gravado em qualquer destes subgrupos (p 0,4)

Uma vez que pode-se supor que o estado SNP344 só afecta a expressão de MDM2 de P2 promotor, em que o SNP é localizada, e que o efeito do presente SNP podem ser mascarados em ensaios que analisam os níveis de expressão de MDM2 total, foram realizadas experiências semelhantes qPCR como descrito acima, mas específica para o ARNm proveniente de promotor P2. Não foi observada associação entre o estado SNP344 e expressão específica promotor P2 (p 0,5).

estatuto SNP344 e câncer risco

A fim de avaliar o impacto potencial do estado SNP344 no risco de câncer, nós compararam a frequência de SNP344 variantes entre ovário (n = 1.927), mama (n = 1.271), endometrial (n = 895) e pacientes com câncer de próstata (n = 641) com controles saudáveis ​​(n = 2.954). Os resultados encontram-se resumidos na Tabela 1. Não foram encontradas diferenças significativas entre a frequência de SNP344A em qualquer dos grupos de cancro analisadas e os controlos saudáveis.

Dado que SNP344A foi ligado ao SNP309T-alelo, como acima descrito , indivíduos portadores do genótipo SNP309GG pode ser censurados como não informativa no que diz respeito ao efeito de SNP344. Por isso, avaliou o impacto do SNP344 no risco de câncer entre os indivíduos portadores SNP309T alelo-only (SNP309TG ou genótipo TT; Tabela 3). Nós não encontramos nenhuma associação entre o estado SNP344 e qualquer uma das formas de câncer que analisam os portadores SNP309TG e 309TT separadamente ou combinados (Figura 3).

plot Forrest mostrando o efeito do SNP344A em risco de ovário, mama, endométrio e câncer de próstata, em comparação com controles saudáveis, entre os indivíduos portadores do genótipo SNP309TG (a), o genótipo SNP309TT (B) e os genótipos TG e TT combinado (C).

SNP344 status e clínicos parâmetros

Nós avaliadas ainda mais o impacto potencial do estado SNP344 de vários parâmetros clínicos entre os pacientes incluídos nas comparações de caso-controle descritos acima.

os dados para a idade de início da doença foi disponível para todos endometrial (n = 895) e pacientes de cancro da próstata (n = 641), bem como grandes sub-coortes de mama (n = 1173) e pacientes de cancro do ovário (n = 761). Nós não encontrou nenhum efeito de SNP344-status na idade de início de uma das quatro formas de câncer quando se comparam grupos totais do paciente para cada forma de câncer ou subgrupos estratificados de acordo com SNP309-status (todos os valores de p 0,15).

Entre o cancro da mama pacientes analisados, muitos estavam matriculados em estudos prospectivos visando identificar mecanismos genéticos de resistência à quimioterapia; n = 106 a partir de dois estudos que avaliaram tanto monoterapia doxorrubicina ou um combinado de regimes 5-fluorouracil /mitomicina [16], [17], enquanto que n = 201 foram obtidos de um estudo de randomização entre epirubicina e paclitaxel em monoterapia [18], [19]. Assim, para esses pacientes, tivemos registros detalhados para resposta objetiva à terapia neoadjuvante no cenário. estado SNP344 não afectar a resposta a qualquer droga de ADN prejudiciais (doxorrubicina, mitomicina) ou veneno do fuso (paclitaxel; p 0,1 para todas as comparações) nestes estudos, embora a conclusão aqui pode ser incerto devido a um número limitado de SNP344A-alelos observados. O efeito potencial do estado SNP344 na sobrevida livre de recidiva ou global poderia ser avaliada nestes estudos, devido ao número limitado de indivíduos portadores da 344a-alelo.

Em um estudo anterior, encontramos o status MDM2 SNP285 correlacionar para encenar em carcinomas do endométrio [14]. Aqui, não há correlação entre estágio FIGO e estado SNP344 foi gravado. (Todos os valores de p 0,3).

Discussão

MDM2 é um fator importante que regula a homeostase celular através das suas interacções estreitas com proteínas como p53, pRB e E2F1. Assim, MDM2 controla processos como a paragem do crescimento, a apoptose e senescência, e a amplificação do gene MDM2 e tradução melhorada têm sido observados em muitas formas tumorais [2], [4], [5], [6], [7].

a importância da expressão de MDM2 em impedir o desenvolvimento do cancro é ainda sublinhada pela constatação de que o

MDM2

promotor P2 SNPs 285 e 309 ambos modular fator de transcrição de ligação e afetar o risco de várias formas de cancro [8], [11], [13], [14]. Embora o mecanismo exacto de iniciação da transcrição a partir do

MDM2

promotor P2 não é conhecido, este promotor é activado em resposta ao stress celular, e em adição a SP1, P2 abriga sítios de ligação para vários factores de transcrição, incluindo p53, o receptor de estrogénio, o AP1 [8], [14], bem como vários outros (predição por a base de dados Jaspar; dados não mostrados).

SNP344T a é o terceiro

MDM2

polimorfismo promotor P2 . SNP285C contrastantes, que está localizado sobre o alelo SNP309G, SNP344A reside no alelo SNP309T. Aqui, realizamos

in silico

força de ligação do factor de transcrição previsão avaliar e determinar o efeito do status SNP344 sobre os níveis de transcrição de MDM2 em linfócitos. Enquanto SNP344 foi encontrada para afetar a ligação de fatores de transcrição TFAP2A, SPIB e AP1, foi registrado nenhum efeito do status SNP344 em MDM2 transcrição. Importante, avaliar a distribuição de um SNP344 em um grande grupo de indivíduos saudáveis ​​e em pacientes que sofrem de ovário, da mama, do endométrio e cancro da próstata, que não detectou diferenças no que diz respeito à distribuição SNP344 entre indivíduos saudáveis ​​e pacientes com cancro. Embora nosso estudo incluiu um número limitado de formas de câncer, por três desses tipos de câncer (mama, ovário endométrio final) a variante SNP285C anteriormente foi mostrado para afetar o risco individual na mesma população étnica [13], [14]. Assim, estes tumores malignos representam formas de câncer adequados para detectar quaisquer efeitos potenciais do estado SNP344 sobre o risco de doença

Contrastando o SNP285G . C polimorfismo que é detectado entre os caucasianos apenas [13], SNP344A, semelhante ao SNP309G, parece ser um polimorfismo antiga que também está presente entre os africanos. Interessantemente, a distribuição do alelo variante SNP309G, mas também SNP344A, parece variar entre grupos étnicos diferentes. Embora a frequência do alelo SNP309G varia de ~ 10% no africanos para ~ 40% em caucasianos e ~ 50% em asiáticos [12], a frequência do alelo SNP344A é cerca de 18% de negros, mas apenas 3% em caucasianos. Esta diferença na distribuição étnica, juntamente com a rápida disseminação do polimorfismo SNP285C jovens entre os caucasianos [20], indica que todos os três

MDM2

polimorfismos promotor P2 pode estar sujeito a selecção evolutiva sob diferentes condições de vida. Assim, novas investigações elucidando potencial impacto da SNP344 sobre a função biológica diferente das formas de câncer relatados aqui pode ser justificado.

Reconhecimentos

A maioria do trabalho foi realizado no Laboratório de Pesquisa do Câncer Mohn. Agradecemos Beryl Leirvaag, Elise de Faveri, Gjertrud T. Iversen, Nhat Kim Duong e Hildegunn Helle para assistência técnica. Agradecemos também ao Serviço Médico, Marinha Real da Noruega e The Norwegian Defesa Serviço Médico para facilitar a coleta de amostras. Os investigadores clínicos no Cancer Group julgamento Norwegian mama NBCG VI são Gun Anker, Departamento de Oncologia do Hospital Universitário Haukeland; Bjorn Østenstad, Departamento de Oncologia do Hospital Universitário Ullevaal; Steinar Lundgren, Hospital Universitário de St.Olav; Terje Risberg, Departamento de Oncologia do Hospital Universitário do Norte da Noruega; e Ingvil Mjaaland, Divisão de Hematologia e Oncologia, Hospital Universitário de Stavanger.