Abstract
Os dados recentes fornecem evidência para um papel importante de trombócitos em lymphangiogenesis dentro doença maligna humana. O objetivo deste estudo foi investigar o papel de trombócitos em lymphangiogenesis em câncer de esôfago humano. Perioperatórios contagem de plaquetas do sangue periférico (CPSP), foram avaliadas retrospectivamente em 320 pacientes com câncer de esôfago, que compreende 184 adenocarcinomas (AC), e 136 carcinomas de células escamosas (SCC). Os dados sobre a linfangiogénese avaliadas por imunocoloração anti-podoplanina estavam disponíveis a partir de estudos anteriores, as plaquetas dentro do tecido de tumor foram avaliadas por CD61 imunocoloração. Para
in vitro
estudos, as células endoteliais linfáticos humanos (LECs) foram isolados e co-cultivadas com as plaquetas do sangue periférico. Estromais aglomerados trombótica (STC) eram evidentes em 82 amostras (25,6%), e os clusters vascular trombótica (VTC), em 56 (17,5%). STC e VTC foram associados com uma CPSP significativamente maior a investigação de todos os casos. A presença de STC foi associada a uma maior densidade de microvasos linfático (P 0,001), e CPSP STC foram associadas com a invasão de células tumorais linfática em um modelo de regressão. A presença de CCT foi associado com menor DFS de todos os pacientes (p = 0,036, teste de Breslow), e VTC com DFS mais curtos em no CEC (p = 0,025, teste de Breslow). Em cultura de células, proliferação LEC foi aumentada por co-cultura com plaquetas humanas em uma dose e modo dependente do tempo mediada pela libertação de PDGF-BB e o VEGF-C. As plaquetas desempenham um papel importante na linfangiogênese ea invasão linfática em câncer de esôfago, influenciando o prognóstico. Portanto, a interrupção das vias de sinalização entre as plaquetas, as células tumorais e endotélio linfático pode ser benéfico para pacientes
Citation:. Schoppmann SF, Alidzanovic L, Schultheis A, Perkmann T, Brostjan C, Birner P (2013) Trombócitos correlacionam com Linfangiogênese no cancro esofágico crescimento humano e Mediate de células linfáticas endoteliais
In Vitro
. PLoS ONE 8 (6): e66941. doi: 10.1371 /journal.pone.0066941
editor: Claudia Daniela ANDL, da Universidade Vanderbilt, Estados Unidos da América
Recebido: 08 de abril de 2013; Aceito: 13 de maio de 2013; Publicação: 26 de junho de 2013
Direitos de autor: © 2013 Schoppmann et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
adenocarcinomas de esôfago (AC) da junção gastro-esofágico são. acredita-se ser induzida principalmente por refluxo gastroesofágico, enquanto carcinomas de células escamosas (SCC) são atribuídas principalmente ao álcool e tabaco [1], [2]. Nas últimas décadas, a incidência de AC elevou dramaticamente nos países Ocidentais [3]. Apesar de estratégias terapêuticas multimodais, resultado global para pacientes com câncer gastroesofágico permanece pobre. Assim, novos conceitos terapêuticos são urgentemente necessários e insights sobre a fisiopatologia da doença são um pré-requisito para o seu desenvolvimento. Como muitos outros carcinomas, cânceres de esôfago espalhado principalmente através do sistema linfático e invasão linfática de células tumorais está associada com prognóstico diminuída de pacientes [4].
Hoje evidência marcante existe que os tumores podem estabelecer, não só o seu próprio sangue abastecimento de embarcações, mas também pode induzir a formação de novos vasos linfáticos (linfangiogênese) e migrar ativamente para este vasos recém-formados para promover a sua propagação [5].
Assim possível inibição desse processo pode ser benéfica para pacientes, especialmente como dados recentes sugerem que o processo de linfangiogênese ea invasão de vasos linfáticos (LVI) não se limita apenas a tumores primários, mas também é evidente em metástases linfáticas, resultando em uma maior propagação das células tumorais [6].
A formação de vasos linfáticos associados ao tumor é um processo complexo e atualmente apenas parcialmente compreendida. Durante a angiogénese embriónica, plaquetas parecem desempenhar um papel chave na separação de sangue e vasculatura linfática [7]. Mas há cada vez mais evidências de que as plaquetas podem interagir com o sistema linfático humano também na doença maligna, e pode facilitar lymphangiogenesis e tumor metástase [8], [9].
O objetivo deste estudo foi investigar o papel de plaquetas no que respeita à linfangiogênese em câncer de esôfago humano.
Materiais e Métodos
os pacientes
Todos os pacientes submetidos à ressecção cirúrgica de carcinomas de esôfago ou a junção gastroesofágico entre 1992 e 2011 no Departamento de Cirurgia da Universidade médica de Viena, foram incluídos neste estudo se o tecido suficiente e contagem trombótica pré-operatório estavam disponíveis. Os tumores de todos os pacientes foram reavaliados de acordo com a 7ª edição UICC TNM.
Ética Declaração
revisão institucional aprovação do conselho foi obtido (Institutional Review Board da Universidade Médica de Viena, na Áustria, EK 1122/2009). Devido à natureza retrospectiva deste estudo, utilizando apenas o tecido arquivado, sem o consentimento informado dos pacientes foi requerido e obtido, conforme aprovado pelo conselho de revisão. As amostras específicos utilizados neste estudo já foram utilizados em publicações anteriores [4], [10] – [15].
Análise da contagem de plaquetas do sangue periférico (CPSP)
CPSP de pacientes foi determinada rotineiramente antes da cirurgia e também antes do início da quimioterapia neoadjuvante, se administrado.
Análise de CPSP foram realizadas rotineiramente em analisadores de hematologia automatizados padrão do Departamento de Medicina laboratorial da Universidade médica de Viena. Durante o período de observação 1992-2011 foram aplicados os seguintes analisadores de hematologia: até 1995 Coulter STKS (Coulter, Hialeah, FL), de 1995 a 2001 Sysmex NE-8000 (TOA Medical Electronics, Kobe, Japão), desde 2001 Sysmex XE- 2100 (Sysmex Corporation, Kobe, Japão).
imunomarcação
a imuno-histoquímica (IHQ) foi realizada em espécimes embebidos em parafina fixados em 4% de formalina tamponada, utilizando três mm cortes histológicos de espessura.
os dados sobre os vasos linfáticos avaliadas pelo mouse monoclonal D2-40 anticorpo anti-podoplanina (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona) estavam disponíveis a partir de estudos anteriores [4], [15].
Para a detecção de trombócitos imunocoloração foi realizada usando um anticorpo monoclonal anti-CD61 (NCL-CD61-308, Leica Biosystems, Newcastle, UK) a uma diluição de 1:1600. A imunohistoquímica Ultra Referencial (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona) foi utilizado para imuno-histoquímica
Análise de imunomarcação anti-podoplanina foi realizada como descrito anteriormente [16]:.
Em resumo, para a determinação de LMVD, a área dentro ou diretamente adjacente a formações tumorais com o maior número de microvasos distintamente destacados ( “hot spot”) foi selecionado em baixa ampliação. LMVD foi então determinada por contagem de todos os vasos imunocoradas com uma ampliação total de 200x numa área de exame de 0,25 mm
2. Um caso foi considerado como positivo no que respeita à LVI quando a digitalização de toda imunocoradas deslizar um grupo de células de tumor era visível dentro de um podoplanina decorado espaço vascular.
Para a análise de CD61-anti imunocoloração, superficial, exulcerada ou sangramento áreas tumorais foram excluídos da análise. Um tumor foi classificado como positivo para clusters trombótica em vasos (VTC), se pelo menos em duas embarcações, tais agrupamentos foram observados (Fig. 1A)
A:. Vascular conjunto trombótica (VTC) em uma amostra de câncer de esôfago (x400 aumento original). B: Estromal conjunto trombótica (STC) em uma amostra de câncer de esôfago avaliadas pelos anti – imunocoloração CD61 (original x400 ampliação). C: espécime câncer de esôfago com alta densidade microvascular linfática (LMVD) avaliada por imuno podoplanina anti- (original x200 ampliação). D: invasão linfática de células tumorais avaliados por imuno anti-podoplanina (original x200 ampliação). E: coloração dupla para vasos linfáticos utilizando (vermelho, anti-podoplanina) e trombócitos (marrom, anti-CD61) (original x400 ampliação). F-H: As barras de erro mostram valores médios ± 2 × erro padrão. Periféricos contagens de plaquetas de sangue (CPSP) foram significativamente superiores em amostras com VTC (F). CPSP (G) e LMVD (H) foram significativamente maiores em amostras de câncer de esôfago com STC.
Um tumor foi considerado como mostrando aglomerados trombótica dentro do estroma tumoral (STC), se mais de um CD61 inequívoca aglomerado imunologicamente era visível dentro do estroma tumoral (Fig. 1B).
Análise da imuno-histoquímica foi realizada por dois investigadores independentes (SFS, PB) cegos aos dados clínicos. Casos com resultados divergentes foram avaliadas em conjunto, utilizando um microscópio com várias cabeças.
Análise Estatística
T-test, teste de Mann-Whitney, testes de qui-quadrado e regressão linear foram utilizados como apropriado. Todos os dados apresentados são valores médios ± desvio padrão, se não for indicado de outra forma.
A sobrevivência global (OS) foi definido como o tempo entre a cirurgia primária e a morte do paciente, a sobrevivência até ao final do período de observação foi considerada observação censurada. sobrevida livre de doença (DFS) foi definido como o tempo desde o dia da cirurgia até a primeira evidência de doença de progressão. A análise univariada de sobrevida foi realizada pelo teste de Breslow, a análise multivariada pelo modelo de risco proporcionalidade Cox. A idade dos pacientes, radicalidade da ressecção, tumor e estágio linfonodo (de acordo com a classificação atual da UICC), o grau do tumor e estado dos linfonodos foram incluídos na regressão de Cox. Um valor de p bicaudal de ≤0.05 foi considerada significativa, SPSS 19.0 foi utilizado para todos os cálculos.
endotelial e isolamento das células
células endoteliais primárias Cultura
foram isolados a partir de prepúcio humano amostras por Digest proteolica, e purificado utilizando o anticorpo anti-CD31 acoplado esferas magnéticas (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Os isolados foram cultivados em meio de crescimento endotelial microvascular EGM2-MV (Clonetics®, Lonza, Walkersville, MD) contendo 1 ug /ml de fibronectina, 5% de FCS e factores de crescimento humanos sem a suplementação de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). Para uma separação adicional das células endoteliais linfáticas e do sangue (LECs e CEBs), anticorpo anti-podoplanina foram aplicados esferas magnéticas acopladas. Todos os isolados mostraram ≥98% de pureza e viabilidade.
As células foram semeadas a uma densidade de 1 × 10
5 em 30 poços mm por 24 h. Após lavagem extensiva com tampão fosfato salino, as células foram incubadas com 10
5-10
7 plaquetas filtradas em gel em EBM-2 meio básico (Lonza) contendo 0,5% de FCS. Para as experiências de bloqueio, os seguintes reagentes foram adicionados a co-culturas: anticorpo de cabra anti-humano PDGFR-β neutralizantes IgG a 1 ug /mL (R D Systems, Minneapolis, MN), de ratinho anti-humano de VEGFR-2 neutralizantes IgG
1 a 50 ng /mL (R D Systems) e competidor solúvel VEGFR-3 /Fc humana a 1 ug /ml (Cell Sciences, Canton, MA). Para controlo negativo, IgG de cabra não específico, IgG de ratinho
1 e IgG humana foram aplicados às mesmas concentrações.
análise celular foi realizado depois de 24 a 72 horas. As imagens digitais de células foram tiradas com um microscópio Axiovert 40CFL (Zeiss, Oberkochen, Alemanha). As células foram posteriormente liberados a partir de placas de cultura por tripsinização e a contagem de células foi avaliada usando a coloração azul de tripano. Os dados apresentados representam média e desvio padrão de amostras em triplicado. Cada experimento foi conduzido ≥ 3 vezes com LEC isolados de diferentes doadores.
plaquetas Isolamento
O sangue venoso foi retirada de voluntários saudáveis em tubos de citrato de sódio e submetido a centrifugação a 85 × g e RT para 20 min. O sobrenadante de plasma rico em plaquetas, obtido foi purificado por filtração em gel, utilizando Sepharose 2B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). activação de plaquetas durante a purificação foi inibida com 100 uM prostaglandina E1. Após centrifugação das plaquetas filtradas em gel a 3000 x g e RT durante 1,5 min, as plaquetas foram ressuspensas em meio EBM-2 contendo 0,5% de FCS e a concentração de plaquetas foi determinada com um contador Sysmex (Kobe, Japão).
celular formazano Baseado ensaio de proliferação
o não radioactivo de proliferação celular e ensaio de citotoxicidade (EZ4U®, Biomedica, Viena, Áustria) foi utilizado para determinar a actividade metabólica de LECs por redução de tetrazólio. 100? L de substrato cromogénico dissolvidos foram adicionados a cada poço de 30 mm e incubadas a 37 ° C durante 2 h. Em seguida, o sobrenadante de cultura foi recuperado e a absorvância a 450 nm foi medida com um leitor de placas Varioskan flash (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA).
Medições Factor de Crescimento
Co os sobrenadantes de cultura foram analisados para o conteúdo do VEGF-a, -C, -D e PDGF-BB por ensaio imunossorvente ligado a enzima (Quantikine, R D Systems) de acordo com as instruções do fabricante
resultados
.
espécimes cirúrgicos
No total, 320 cânceres de esôfago invasoras eram incluídos neste estudo: 184 adenocarcinomas (AC), e 136 carcinomas de células escamosas (SCC)
dados clínicos dos pacientes são. compilados na tabela 1, a quimioterapia neoadjuvante, antes da cirurgia foi administrado em 98 pacientes. Para os cálculos, nestes pacientes geralmente CPSP antes do início da quimioterapia neoadjuvante foram usadas. Em 11 pacientes, não existem dados sobre CPSP antes da quimioterapia neoadjuvante estavam disponíveis. Dado que não houve diferença significativa na CPSP antes e após a quimioterapia neoadjuvante foi encontrado nos restantes 87 pacientes (p 0,05, teste t), CPSP, após quimioterapia neoadjuvante (imediatamente antes da cirurgia) foram usadas nestes pacientes para análise. STC estavam presentes em 82 amostras (25,6%; 36 AC, 46 SCC), VTC em 56 (17,5%, 22 AC, 34 SCC). A Figura 1 dá exemplos de imunocoloração. Geralmente, STC (p = 0,004, teste de Chi Square) e VTC (p = 0,002, teste de Qui-quadrado) foram mais comuns em SCC em relação ao AC. A associação significativa entre os VTCs presença e STCs foi visto na investigação de todos os casos e em investigação de AC e SCC separadamente. (P 0,001, respectivamente, o teste do qui-quadrado)
Enquanto nenhuma associação do presença de STC com o estadiamento do tumor e graduação histológica foi observada em todos os casos e AC, no SCC mais avançado estado linfonodal foi observado em tumores com STC (mediana de pN1 em ambos os casos, p = 0,024, teste de Mann Whitney).
A presença de VTC foi associada com tumor estádio mais avançado em todos os casos (mediana de pT3 em ambos os casos, com uma tendência de maior preparo em pacientes com VTC, p = 0,036, teste de Mann Whitney), mas essa associação não foi visto quando se investiga AC e SCC separadamente.
CPSP foram superiores nos casos com VTC em investigação de todos os casos (275 ± 83 vs 250 ± 79 g /l, p = 0,001, t-teste) (Fig. 1F ), mas esta associação foi visto em investigação separada de tipos de tumor SCC apenas em (282 ± 75 vs 243 ± 81 g /L; p = 0,007, t-teste), mas não em AC (p = 0,077, t-teste) . Nenhuma associação de VTC com LMVD foi observada em todos os casos e AC e SCC separadamente. (P 0,05, teste t).
A presença de STC foi associada a uma maior CPSP na investigação de todos os casos em comparação com pacientes sem STC (279 ± 88 g /l vs. 246 ± 76 g /l; p = 0,001, teste t) (Figura 1G).. Na investigação de tipos de tumor separadamente, tal associação foi encontrada apenas em SCC (282 ± 75 g /l vs. 243 ± 82 g /l, p = 0,007, teste t), mas perdeu importância na AC (274 ± 101 G /l vs. 247 ± 73 g /l, p = 0,077, t-teste). A presença de STC foi associada a uma maior LMVD em todos os casos (16 ± 7 vs 12 ± 5 microvasos /campo; p 0,001, teste-t) (Fig. 1H) e também em CA (16 ± 6 vs 12 ± 5 microvasos /campo, P 0,001, teste t) e SCC (17 ± 7 vs 13 ± 6, p = 0,002, teste t) separadamente
Nenhuma associação direta da STC ou VTC com LVI. foi visto (p 0,05, Chi quadrado)., mas em um modelo de regressão linear com LVI como variável e incluindo CPSP, STC e VTC dependente mostrou que CPSP (p = 0,035, coeficiente de regressão 0,001), e VTC (p = 0.018, coeficiente de regressão de 0,175) foram associados com LVI.
Em um segundo modelo de regressão linear usando LMVD como variável dependente, incluindo as mesmas variáveis independentes, novamente CPSP (p = 0,034, coeficiente de regressão -0,009) e STC. (p 0,001, coeficiente de regressão de 5,415) influenciou LMVD
Análise de Sobrevivência
O tempo médio de observação foi de 50 ± 3 (erro padrão) meses, durante este período de observação, 154 pacientes (48,1 %) desenvolveram a doença recorrente, e 131 (40,9%) morreram.
A presença de STC foi associado com menor DFS de todos os casos em análise univariada (p = 0,036, teste de Breslow, Fig. 2A). Na investigação de tipos de tumor separadamente, sem que tal influência foi encontrada em AC, mas a análise de SCC (p = 0,037, teste de Breslow, Fig. 2B). STC foram associados com DFS mais curtas na análise multivariada de AC (p = 0,022, regressão de Cox, a tabela 2, Fig 2C.)
Fig.2a:. Presença de aglomerados trombótica do estroma (STC) foi associado com menor DFS Em todos os casos. Na investigação de tipos de tumor separadamente, STC foi associada com o DFS mais curtos em cancro de células escamosas (SCC) (Fig. 2B), bem como no adenocarcinoma (AC) (Fig. 2C). FIG. 2D: Presença de clusters trombótica vasculares (VTC) foi associado com DFS mais curtos em SCC. FIG. 2E: Surpreendentemente, VTC foi associada com significativamente maior DFS no AC na análise multivariada. No entanto, note que apenas relativamente poucos eventos são vistos na curva VTC +, e as curvas estão cruzando uns aos outros ao longo, qualificando este achado. FIG. 2F: VTC foi associado com menor OS em SCC
Sem influência da STC foi detectada no OS na investigação de todos os casos, bem na investigação da AC e SCC separadamente (p 0,05. , teste de Breslow ou regressão Cox, respectivamente;. tabela 2)
no relevância da VTC no DFS foi visto na investigação de todos os casos. Na investigação da AC e SCC separadamente, VTC foi associada com DFS mais curtas na análise univariada no CEC (p = 0,025, Breslow teste, mediana DFS 506 ± 82 vs. 794 ± 139 dias; A Fig. 2D), mas associado com mais DFS em análise multivariada de AC (p = 0,008, regressão de Cox, a mediana DFS 2928 ± 990 vs. 700 ± 141 dias; Figura 2E). Presença de VTC também foi associado com significativamente menor OS no CEC (p = 0,049, teste de Breslow, Fig 2F.)
CPSP não foi associada a DFS ou OS em uni-ou análise multivariada (p . 0,05, regressão de Cox uni ou multivariada, respectivamente).
Cultura celular
LECs foram semeadas a 1 × 10∧5 por 30 milímetros bem, e depois de 24 horas isoladas plaquetas foram adicionados a 3 × 10 ∧7, 10∧6 ou 10∧5 por poço e as células foram cultivadas durante mais 48 h. Como mostrado na Figura 3A-E, de células LEC aumento da contagem com o número de plaquetas isoladas adicionado, indicando que a proliferação LEC é aumentada por co-cultura com plaquetas humanas de um modo dependente da dose
A:. Proliferação LEC é aumentada por co-cultura com plaquetas humanas de um modo dependente da dose. LECs foram semeadas a 1 × 10∧5 por 30 milímetros bem. Após 24 horas isoladas plaquetas foram adicionados a 3 × 10∧7, 10∧6 ou 10∧5 por poço e as células foram cultivadas durante mais 48 h. Para a quantificação da proliferação celular, a contagem foi determinada LEC (barras pretas, escala da direita) e actividade metabólica foi medida por ensaio de redução de tetrazólio (barras brancas, escala da esquerda). B-E: Correspondente imagens microscópicas de A: B: Controle; C: EC + Px10∧7, D: CE + Px10∧6, E: CE + Px10∧5. F: proliferação LEC é aumentada por co-cultura com plaquetas humanas de um modo dependente do tempo. LECs foram semeadas a 1 × 10∧5 por 30 milímetros bem. 24 horas depois plaquetas isoladas foram adicionados a 1 × 10∧7 por poço e as células foram cultivadas durante mais 24, 48 e 72 horas. As contagens celulares foram determinadas para co-culturas de LEC-plaquetas (linha a cheio) em comparação com LECs sem adição de plaquetas (linha a tracejado). G + H: liberação do fator de crescimento durante a co-cultura de LECs e plaquetas humanas. LECs foram semeadas a 1 × 10∧5 por 30 milímetros bem. Após 24 horas plaquetas isoladas foram adicionados em 7 × 10∧7, 10∧6 ou 10∧5 por poço e as células foram cultivadas durante mais 48 h. sobrenadante de cultura foi colhido, centrifugado (para remover componentes celulares) e, em seguida, ensaiadas para a concentração de PDGF-BB (G) e de VEGF-C (H) pelo ensaio imunossorvente ligado a enzima. I: a proliferação LEC induzida plaquetas é mediada por PDGFRβ, VEGFR-2 e -3. LECs foram semeadas a 1 × 10∧5 por 30 milímetros bem. Após 24 horas plaquetas isoladas foram adicionados em 7 × 10∧7 por poço com ou sem reagentes de bloqueio contra PDGFRß, VEGFR-2 e /ou VEGFR-3. As células foram cultivadas por mais 48 h antes de a determinação das contagens LEC.
A segunda experiência, investigou-se a proliferação LEC é reforçada por plaquetas humanas de um modo dependente do tempo. Para este fim, as plaquetas em 1 × 10∧7 por poço foram adicionados a LECs isoladas (1 × 30 mm 10∧5 por poço) e as células foram cultivadas durante mais 24, 48 e 72 horas. FIG. 3F mostra que a proliferação LEC é aumentada por co-cultura com plaquetas humanas de um modo dependente do tempo em comparação com LECs sem adição de plaquetas.
Como próximo passo, nós investigamos se factores pró-linfangiogênicas são libertados durante a co-cultura de LECs e plaquetas. Isolado plaquetas foram adicionados a 7 × 10∧7, 10∧6 ou 10∧5 por poço para LECs (1 × 30 mm 10∧5 por cavidade) após 24 horas, e as células foram cultivadas durante mais 48 h. O sobrenadante da cultura foi recolhido, centrifugado para remover os componentes celulares e, em seguida, ensaiadas para a concentração de PDGF-BB e o VEGF-C por ensaio imunossorvente ligado a enzima.
Figura 3G e 3H mostram que a uma concentração de plaquetas de 10∧ 6, PDGFR-β e VEGF-C foram libertados, e essa liberação de fatores de crescimento foi aumentado fortemente a uma concentração de plaquetas de 10∧7
Como último passo, experiências de bloqueio foram realizadas:.
LECs foram semeadas a 1 × 10∧5 por 30 milímetros bem. Após 24 horas plaquetas isoladas foram adicionados em 7 × 10∧7 por poço com ou sem reagentes de bloqueio contra PDGFRß, VEGFR-2 e /ou VEGFR-3. As células foram cultivadas por mais 48 h antes de a determinação das contagens LEC. FIG. 3I mostra que a proliferação de células LEC foi parcialmente reduzida pela adição dos compostos individuais em comparação com LEC /plaquetas co-cultura sem substâncias de bloqueio. A inibição de VEGFR-3 (bloqueando a sinalização de VEGF-C) foi mais potente e diminuiu a proliferação mediada por LEC-plaquetas em 90%. Este efeito não podia ser ainda melhorada pela combinação com o anti-PDGFRß e anticorpos anti-VEGFR-2
Discussão
As plaquetas desempenham um papel importante na doença maligna humana:. Por isso, tem sido demonstrado em muitos estudos que pré-operatório contagem de plaquetas do sangue periférico elevado prediz mau prognóstico em uma variedade de cancros humanos [17] entre elas câncer, também gástrica [18].
em câncer de esôfago (SCC e AC), um aumento na contagem de plaquetas após a ressecção em bloco tem sido relatada a ser associada com melhor prognóstico em um estudo [19], e em um estudo a partir do Paquistão, contagem de plaquetas pré-operatórios baixas foram associados com mau prognóstico [20]. Em contrapartida, outro estudo descobriu que trombocitose pré-operatório indicou mau prognóstico em SCC esofágico [20].
No entanto, não é totalmente claro se a contagem de plaquetas elevadas são induzidos por um fenótipo mais agressivo dos tumores, ou contribuir-se para comportamento clínico dos tumores. Muito provavelmente tumores pode induzir, por exemplo, directamente thrombopoesis via fator como IL-6 [21].
As plaquetas também parecem promover a metástase, mas os mecanismos exatos ainda não estão claros [22], [23].
As plaquetas desempenham também um papel na angiogénese tumoral após activação, por exemplo, em resposta a lesão endotelial [24]. Este efeito parece ser induzida não só pela secreção do factor das plaquetas, mas também por estimulação directa da angiogénese [25].
é bem sabido que as plaquetas humanas periféricas são capazes de segregar factores pró-linfangiogênicas como VEGF-C e PDGFR-B, que são libertados durante a activação de plaquetas [26]. Além disso, as plaquetas desempenham um papel importante no desenvolvimento embrionário do sistema linfático [7]. Então, eles foram referidos como inibindo a proliferação e migração de células endoteliais linfáticas durante o desenvolvimento embrionário após activação por interacção de CLEC2 e podoplanina, que é expresso em células endoteliais linfáticas [27].
Na doença maligna, a interacção entre plaquetas e podoplanina via CLEC-2 induz uma série de vias envolvidas na migração de células tumorais e crescimento [28].
Surpreendentemente, ao nosso conhecimento que não existem dados sobre o papel das plaquetas no lymphangiogenesis na doença maligna humana, de modo longe.
em nosso estudo, nós investigamos em uma grande série de cânceres de esôfago a Associação de CPSP com plaquetas em vasos tumorais, dentro do estroma do tumor e com lymphangiogenesis.
perioperatória CPSP foram associados com a presença de plaquetas no tecido tumoral, e plaquetas no interior do tecido do tumor foi associado com o aumento da linfangiogénese. Enquanto nenhuma associação directa da STC ou VTC com LVI de células tumorais foi visto, CPSP e VTC influenciado LVI em analysis.This regressão indica que uma interação complexa entre CPSP, VTC e STC promove LVI das células tumorais.
Para investigar nossas descobertas em detalhe
in vitro
, realizamos ensaios de cultura de células, que mostra que as plaquetas para promover o crescimento de LECs de uma maneira dose e dependente do tempo. Esta indução de crescimento LEC parece ser induzida por secreção de factores pró-linfangiogênicas como o VEGF-C e PDGF-BB.
Assim os nossos resultados pode ser uma possível explicação para o aumento da pré-operatória de CPSP estão associados com o prognóstico diminuída numa variedade de cancros humanos, embora isto não era evidente em nosso estudo. Embora podoplanina interage com as plaquetas durante o desenvolvimento, uma interacção entre as células endoteliais linfáticas e plaquetas não foi descrita anteriormente. Isto pode ser explicado pelo facto de trombócitos não são encontrados dentro do sistema vascular linfático. No entanto, as plaquetas facilitar o extravasamento através da libertação de metaloproteinases da matriz e por estimulação das células endoteliais [28] e do tumor. Como é evidente em nosso estudo, os clusters de plaquetas pode ser também encontrada não só dentro dos vasos sanguíneos, mas também dentro do estroma do tumor, indicando vasos vazamento. Desde aglomerados vasculares e plaquetas estromal correlacionados, a migração de plaquetas nos vasos parece ser induzida por aglomerados vasculares. Os factores linfangiogênicas segregadas dentro do estroma por plaquetas extravasados pode induzir o crescimento do endotélio linfático, suportando, assim, a formação de vasos linfáticos recém-formados.
A mostrado nas nossas experiências de cultura de células, esta estimulação da proliferação de LECs pelas plaquetas parece para ser induzida em um tempo e modo dependente da dose, principalmente por VEGF-C e PDGF-BB, que são secretadas pelas plaquetas. experiências de bloqueio indicam um papel predominante do VEGF-C neste processo.
Como relatado em uma variedade de estudos, o aumento de vasos linfáticos correlaciona-se com a probabilidade de desenvolver LVI e subsequentes de metástases linfáticas. [29] -. [34] O facto de que as plaquetas promover o extravasamento de células tumorais é bem conhecido [17], mas com base nos nossos dados, parece muito provável que as plaquetas no estroma do tumor também promover a invasão de células tumorais no sistema linfovascular
em resumo, nós mostramos pela primeira vez em grande série de pacientes com câncer humanos e também
in vitro
que as plaquetas do sangue periférico desempenhar um papel importante na linfangiogênese câncer de esôfago e LVI, influenciando, assim, o prognóstico de pacientes. Assim, a disrupção das vias de sinalização entre as plaquetas, células tumorais e no endotélio linfático pode ser de benefício para o paciente.