Abstract

O carcinoma hepatocelular (HCC) é uma das principais doenças malignas em todo o mundo e está associada com mau prognóstico, devido aos altos índices de metástases e recidiva do tumor. O nosso estudo anterior demonstrou que a sobre-expressão da proteína-quinase activada por p21 1 (PAK1) é frequentemente observada no carcinoma hepatocelular e está associada com um comportamento mais agressivo do tumor, o que sugere que PAK1 é um potencial alvo terapêutico no carcinoma hepatocelular. No estudo atual, uma pequena inibidor PAK1 molécula alostérico, IPA-3, foi avaliada para o potencial em suprimir hepatocarcinogênese. Consistente com outros relatórios, foi observada inibição da actividade de PAK1 em várias linhas celulares de carcinoma hepatocelular humanas tratadas com várias dosagens de IPA-3. Usando a proliferação celular, a formação de colónias e os ensaios de incorporação de BrdU, foi demonstrado que o tratamento com IPA-3 inibiu significativamente o crescimento de células de carcinoma hepatocelular. Os mecanismos através dos quais o tratamento IPA-3 suprime o crescimento de células CHC são aumento da apoptose e bloqueio da activação de NF-kB. Além disso, os nossos dados sugerem que o IPA-3 não só inibe o crescimento celular HCC, mas também suprime o potencial metastático de células CHC. Ensaio de xenoenxerto de ratinho nu demonstrado que o tratamento com IPA-3 reduziu significativamente a taxa de crescimento do tumor e o volume do tumor diminuiu, indicando que o IPA-3 podem suprimir o

In vivo

o crescimento do tumor de células de carcinoma hepatocelular. Tomados em conjunto, a nossa demonstração do potencial de eficácia pré-clínica do IPA-3 em HCC fornece a base racional para a terapia do cancro

Citation:. Wong LL-Y, Lam IP-Y, Wong TY-N, Lai WL, Liu HF, Yeung LL, et al. (2013) IPA-3 inibe o crescimento de células de cancro do fígado e por supressão PAK1 A activação de NF-kB. PLoS ONE 8 (7): e68843. doi: 10.1371 /journal.pone.0068843

editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de fevereiro de 2013; Aceito: 03 de junho de 2013; Publicação: 19 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Hong Kong Research para o Controle de Doenças Infecciosas (No. 09.080.782) e do Conselho de Pesquisa Grant Hong Kong (HKU 7 /CRF /09), The University of Hong Kong (Small Projeto Financiamento 201.109.176.021 para LLY Wong e YP Ching). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Dr. Yick-Pang Ching é membro do Conselho Editorial PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Como o sexto tumor maligno mais comum ea terceira principal causa de mortalidade por cancro em todo o mundo, carcinoma hepatocelular (HCC) é responsável por mais de um milhão de mortes por ano [1]. HCC está associada com mau prognóstico, devido à alta incidência de recorrência de tumores e metástases [2]. ressecção hepática é uma das principais terapias no presente, mas continua a ser insatisfatória por causa das altas taxas de recorrência [3]. Por conseguinte, o desenvolvimento de novos regimes de tratamento para o HCC é necessária.

A sobre-expressão de p21 activada por cinase 1 (PAK1) é frequente no carcinoma hepatocelular [4]. É um efector a jusante de Rho GTPase pequena, incluindo Rac1 e Cdc42, que regula diversos processos celulares, incluindo a progressão do ciclo celular, motilidade celular, polaridade celular e apoptose [5]. Activado Rho GTPase se liga a PAKs no domínio Cdc42 /Rac interativa ligação (CRIB), fazendo com que o alívio de domínio autoinhibitory (AID), subsequente autofosforilação do catalítica de ativação do domínio e quinase [6]. Entre os vários locais de autofosforilação, treonina-423 (T423) é particularmente importante para contrariar autoinibição e manter o estado activado completa [7].

3-IPA (2,2′-di-hidroxi-1,1′- dinaphthyldisuifide) é um inibidor alostérico altamente selectivos, não-competitivo do ATP-de PAK1 cuja hiperactividade tem sido mostrado para ser estreitamente relacionada com tumorigénese [8]. Estudos anteriores demonstraram que o IPA-3 impedido autofosforilação PAK1 induzida Cdc42 na T423 e actividade catalítica PAK1 significativamente inibida [8], [9]. A acção inibidora de IPA-3 é obtida, em parte, por ligação covalente ao domínio de regulação de PAK1 que por sua vez impediu a interacção física com outros activadores ou Cdc42 GTPase [9]. IPA-3-alvo domínio regulador é menos conservadas dentro quinases, confere, assim, um notavelmente elevada selectividade para este inibidor [8].

In vitro

estudos mostraram que o tratamento IPA-3 levou a resultados semelhantes como siRNA silenciamento de PAK1, no qual IPA-3 especificamente bloqueados o transporte de membrana de WAVE2 e formação de lamellipodia em células de câncer de mama humano [10], e inibida a captação endocítica do serotipo de adenovírus humano 35 em várias linhas de células [11]. No entanto, o efeito de IPA-3 no tratamento terapêutico de carcinoma hepatocelular humano é ainda mal compreendido. Neste estudo, objetivou investigar o potencial do IPA-3 na supressão da proliferação e metástase de células de carcinoma hepatocelular humanos através de uma série de

in vitro Comprar e

In vivo

experimentos. Nós mostramos que o tratamento de 3-IPA teve um impacto significativo na apoptose, proliferação e a motilidade das células de carcinoma hepatocelular. Além disso, o IPA-3 foi capaz de suprimir o

in vivo

o crescimento do tumor em xenoenxertos nu do rato. Portanto, nossos dados fornece evidências de suporte para o potencial de aplicação do IPA-3 na gestão tumorigênese e metástases de HCC.

Materiais e Métodos

Chemicals

2,2′- di-hidroxi-1,1′-dinaphthyldisuifide (IPA-3) foi sintetizado e fornecido pela Dra LL Yeung em Hong Kong University of Science and Technology. A estrutura de IPA-3 foi confirmada por análise de espectrometria de massa. Uma solução de estoque de IPA-3 (100 mM) foi preparada de fresco em DMSO. Outros produtos químicos, salvo se especificamente indicados foram da Sigma-Aldrich na mais alta qualidade.

Cultura celular

células de carcinoma hepatocelular humano H2M, H2P e, imortalizado linha de fígado não-tumorigénico humana MIHA eram de Dr. XY Guan, do Departamento de Oncologia Clínica, Universidade de Hong Kong, Pokfulam, Hong Kong [12]. células MHCC97L e MHCC97H eram do Instituto do cancro do fígado, Fudan University, Shanghai, China [13]. As células HepG2 e Hep3B foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC). SMMC-7721 e Bel-7402 foram presentes de Xangai Instituto de Bioquímica e Biologia Celular, da Academia Chinesa de Ciências. Todas as células foram cultivadas em Eagle mínimo de meio essencial modificado de Dulbecco (DMEM) com glucose elevada suplementado com soro a 10% inactivado pelo calor bovino fetal (SBF), piruvato de sódio 1 mM e 100 U de penicilina /estreptomicina, a 37 ° C em 5% humidificada CO

2 incubadora.

Ensaio MTT

Quatro mil células H2M por poço foram semeadas em placas de 96 poços e incubou-se em condições normais durante 24 horas. As células foram tratadas com diferentes concentrações de IPA-3 para 1, e 2 dias. As células foram tratadas com 100 ul de 5 mg /ml de (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) () Invitrogen solução durante 4 horas a 37 ° C até que os cristais eram -2,5-(MTT) formado. solução de MTT foi removida de cada poço e 100 ul de DMSO foi adicionado a cada poço para dissolver os cristais. a intensidade da cor foi medida por Microplate Reader (Bio-Rad) a 570 nm. cada experiência consistiu em quatro repetições e, pelo menos, três experiências independentes foram realizados.

ensaio de proliferação celular

O método para o ensaio de proliferação foi descrito anteriormente [4]. A melhor curva de ajuste de crescimento e tempo de duplicação foram calculados utilizando o GraphPad Prism 5 (GraphPad Software , Inc., San Diego, CA). Em resumo, H2M (1 × 10

4), H2P (1 × 10

4), HepG2 (2 × 10

4), MHCC97L (1 × 10

4) ou MIHA (2 × 10

4) As células foram plaqueadas em placas de 6 poços contendo meio completo no dia 0. qualquer das controlo de veículo (DMSO) ou IPA-3 (5 ou 10 uM) foi adicionado a o meio no dia 1. Meios com ou sem IPA-3 foram funciona no Dia 3 e 5. em triplicado, e as células foram contadas utilizando trypsinzed contador de células no dia 3, 4, 6 e 7 para a construção de curvas de crescimento.

ensaio de Formação de Colónias

O ensaio foi realizado como descrito anteriormente [14]. Resumidamente, as células foram semeadas a 200 células por poço em placas de 6 poços contendo DMEM completo no dia 0. DMSO ou IPA-3 (5 ou 10 uM) foi administrado aos meios de comunicação, o qual foi trocado duas vezes por semana. No Dia 14, as colónias foram fixadas com formaldeído a 3,7% durante 15 minutos e coradas com violeta de cristal a 1% antes da quantificação.

Ensaio de Incorporação de BrdU

O ensaio foi realizado como descrito anteriormente [15]. A proliferação celular foi quantificada pela medição da incorporação de BrdU durante a síntese de DNA, com a proliferação celular ELISA, BrdU kit colorimétrico (Roche Diagnostics). O ensaio foi realizado de acordo com o manual do fabricante. Em resumo número idêntico de células H2M, H2P, Miha, HepG2 ou MHCC97L foi colocadas em placas de 96 poços e privadas de soro durante a noite. privação de soro de sincronização do ciclo celular induzida por isso que a maioria das células permanecem na transição G1 /S um pouco antes da entrada da fase S. As células foram então tratadas com DMSO ou várias concentrações de IPA-3 (10 e 20? M) durante 15 minutos, seguido por reconstituição e rotulagem BrdU FBS durante 2, 4 ou 8 horas. O sinal de marcação com BrdU foi quantificada pela medição da absorvância relativa (Abs

370 nm-Abs

492 nm). Cada ensaio foi feito em triplicado. Os experimentos foram realizados pelo menos três vezes de forma independente.

anexina V-7ADD Coloração Ensaio

A detecção de morte celular por apoptose foi realizada utilizando o PE anexina V Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen). Em triplicado, as células foram plaqueadas em H2M mm de prato 60, durante a noite e, em seguida, tratada com DMSO ou IPA-3 (10 ou 20 fiM) em meio contendo soro durante 24 horas privadas de soro. células flutuantes foram lavados, enquanto as células ligadas foram tratadas com tripsina, lavadas e ressuspensas em tampão de ligação. Após a coloração com anexina V-PE e 7-AAD, as amostras foram imediatamente analisadas por citometria de fluxo. Excitação: 488 nm (anexina V-PE e 7-AAD). Emissão: 578 nm (anexina V-PE), 675 nm (7-AAD). As células foram contadas por amostra e os dados foram analisados ​​com WinMDI (Versão 2.8, Joe Trotter).

microscopia confocal

Depois de tratamento da toxicodependência, células H2M ou H2P foram fixados em paraformaldeído a 4% para 15 minutos, lavadas e permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 15 minutos, [4], [15]. As lâminas foram coradas com TRITC-faloidina (Invitrogen) por 10 minutos e imagem imunofluorescência foi capturado em uma Carl Zeiss LSM700 microscópio de varredura confocal laser.

Transwell Migration Assay

ensaio de migração Transwell foi realizada como descrito anteriormente [4]. Resumidamente, H2M (1 × 10

5) as células foram plaqueadas em DMEM isento de soro no compartimento superior e meio complementado com soro foi adicionado ao compartimento inferior da câmara de Transwell (Corning). Na presença ou ausência de IPA-3 (10 uM), as células privadas de soro foram deixadas migrar durante 24 horas. As células foram então fixadas com formaldeído a 3,7%, corado com 1% de violeta de cristal e contadas sob um campo microscópico com a ampliação de 40X. Três campos diferentes foram escolhidos aleatoriamente para cada inserção.

quantitativa transcrição reversa-PCR (qRT-PCR)

células H2M

privadas de soro foram tratadas com ou sem IPA-3 pré-tratamento (10 ou 20 ? M, 15 minutos) seguido por TNF-α (10 ou 20 ng /mL, 24 horas), o reabastecimento de FBS e cultura durante a noite. qRT-PCR foi realizada como descrito anteriormente [4]. Resumidamente, ARN total foi extraído utilizando Trizol (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. O ARN total foi transcrito de forma inversa em ADNc de primeira cadeia, utilizando RT PrimeScript kit de reagente (Takara, Japão). -QPCR em tempo real foi realizado utilizando o sistema de SYBR® verde Tempo Real (Takara, Japão) numa Meu IQTM2 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). β-actina foi utilizado como um controlo interno e permitiu a normalização das amostras. As sequências de ADN dos iniciadores de PCR estão listadas na Tabela S1. qRT-PCR foi realizado em triplicado e repetidas três vezes.

Western Blotting Análise

Extracção de proteínas e Western blot foram realizados tal como descrito anteriormente [4], [15]. Immunoblotting foi feito para PAK1, P-PAK1 (T423), PARP1, Paxillin, P-Paxillin (S178), SAPK /JNK, P-SAPK /JNK (T183 /Y185), caspase 3 (Cell Signaling Technology), NF- kB (Santa Cruz Biotechnology) e β-actina (Sigma-Aldrich) seguido por peroxidase de rábano (HRP) anticorpos secundários conjugados (GE Healthcare) correspondente. Sinais de proteínas alvo foram detectados por Chemiluminsence avançado (GE Healthcare). Intensidades de bandas de proteínas foram analisadas usando o Adobe Photoshop CS4.

Nude mouse Xenoenxerto

células MHCC97L (1 × 10

6) foram injectados subcutaneamente no flanco direito, de 4 semanas de idade ratinho nu masculino. O tamanho do tumor foi calculado como descrito previamente [4]. Os murganhos com tumores de tamanho médio de 100 mm

3 foram agrupados em coortes de tratamento. Um total de 15 ratinhos foram usados ​​e divididas em três grupos (5 ratos por grupo): controlo (DMSO), IPA-3 (2 mg /kg) e IPA-3 (4 mg /kg). IPA-3 foi formulada em DMSO e administrado três vezes por semana (TIW) (2 mg /kg ou 4 mg /kg) por injecção intraperitoneal (i.p.) durante o estudo e o tamanho do tumor foi registado duas vezes por semana. Os estudos em animais tinham sido especificamente aprovadas pela Animal (Controle de Experimentos) Portaria Capítulo 340, o Departamento de Saúde, Hong Kong Região Administrativa Especial (Ref .: (11-786) em DH /HA P /8/2/3 Pt. 33).

Análise estatística

As experiências foram feitas em triplicado e os dados foram apresentados como média ± SD. Estudante de

t

-test foi usado para análise estatística e dados de mais de dois grupos foram analisados ​​por análise de uma via de variância (ANOVA) em GraphPad Prism 6 seguido pelo teste de Dunnett. Os resultados foram considerados significativos quando

P

. 0,05

resultados

IPA-3 inibe a atividade de PAK1

células de carcinoma hepatocelular foram mostrados para ter um elevado nível endógeno PAK1, particularmente nas linhas celulares altamente metastáticas HCC [4], como H2M, mas não no não-tumorigénico, imortalizadas, células do fígado MIHA (Fig. 1A). Para investigar o efeito de IPA-3 sobre o crescimento de células H2M, foi realizado um ensaio MTT. ensaio MTT demonstrado que o IPA-3 suprimiram a proliferação de células de modos H2M tempo e dependente da dose (Fig. 1B). A metade da concentração máxima inibitória (IC

50) de IPA-3 em células de H2M foi de cerca de 28 uM e 21 uM no dia 1 e 2, respectivamente. Para confirmar o efeito inibitório de IPA-3 sobre a actividade PAK1, células H2M foram privadas de soro e depois tratou-se com IPA-3 em meio completo durante a noite. A análise de transferência de Western mostrou que o IPA-3 dependente da dose, reduziu o nível de fosforilação de PAK1 (Fig. 1C). Consistentemente, os resultados mostraram IPA-3 provoca uma diminuição da fosforilação PAK1 em associação com uma diminuição na viabilidade celular H2M. Além disso, a fosforilação do substrato a jusante de PAK1, c-Jun N-terminal kinase (JNK), foi também reduzida, apoiando ainda mais a redução da actividade da quinase por PAK1 IPA-3 (Fig. 1C). Luz exame microscópico das células tratadas com IPA-3 revelou alterações morfológicas acentuadas. FIG. 1D mostram as alterações morfológicas nas células H2M depois de ser tratado com IPA-3. Em doses elevadas de IPA-3 (20 e 40? M), uma população significativa de células tornou-se H2M rodada-se e destacada do prato.

(A), os níveis relativos de proteína PAK1 em várias linhas celulares. As intensidades do sinal das bandas foram quantificados e normalizado, tendo que nível de MIHA como 1. ensaio de MTT (B) no dia 1 e 2. células H2M (4 × 10

3) foram semeadas em placas de 96 poços e tratadas com diferentes doses de IPA-3. As células foram colhidas após a incubação e o ensaio de MTT foi realizado como mencionado em Materiais e Métodos. O gráfico mostram a percentagem de células viáveis ​​representada graficamente contra a dose de IPA-3 (C), análise de Western blot da P-PAK1, PAK1 total, a P-JNK e JNK total. H2M células privadas de soro foram tratadas com DMSO ou IPA-3 na concentração indicada durante 15 minutos e seguida de reabastecimento de FBS e cultura durante a noite. (D) As células foram H2M e tratou-se com IPA-3 (10, 20 ou 40 uM) em meio completo e deixadas a crescer durante a noite privadas de soro. As imagens morfologia celular foram capturados em uma ampliação de 40X. barra de escala, 0,4 mm.

IPA-3 suprime a proliferação de células de carcinoma hepatocelular

Para avaliar o efeito do IPA-3 sobre a proliferação celular HCC, duas linhas de células de carcinoma hepatocelular primário, HepG2 e H2P, duas linhas de células metástase HCC ,. H2M e MHCC97L, e a, linha celular imortalizada fígado não tumorigénica, MIHA, foram tratadas separadamente com diferentes dosagens de IPA-3. No ensaio de proliferação celular, o tratamento de IPA-3 reduziu significativamente o número de células de carcinoma hepatocelular metastáticas (H2M e MHCC97L) e em menor medida para as células de carcinoma hepatocelular primário (HepG2 e H2P), marcado de uma forma dependente da dose (Fig. 2A ). Em contraste, MIHA teve a maior quimiorresistência de IPA-3, sugerindo que o IPA-3 pode inibir a proliferação de células de hepatoma com um pouco efeito sobre os hepatócitos normais. Para confirmar o efeito de IPA-3, os lisados ​​celulares totais de células H2M foram colhidas no dia 7 e testados para a inibição PAK1 por análise de transferência de Western. O resultado mostrou que o tratamento com IPA-3 inibiu marcadamente a fosforilação de activação de PAK1, sugerindo que o IPA-3 inibe a proliferação celular através da redução da actividade de PAK1 (Recurso Fig. S1). Consistentemente, concomitante redução da fosforilação de JNK, os alvos a jusante de PAK1, foi também observada (Fig. S1). Para elucidar se o mecanismo anti-proliferativo de IPA-3 em células HepG2, H2P, H2M e MHCC97L era devido a uma diminuição da entrada do ciclo celular, foi realizado ensaio de marcação com BrdU. A fim de conseguir um efeito proeminente do IPA-3, 10 ^ m e uma dosagem mais elevada (20 pM) foram usadas para a investigação. Os nossos dados mostram que o IPA-3 nas células de tratamento e H2M MHCC97L sincronizados resultou numa redução significativa na taxa de incorporação de BrdU, em comparação com o controlo de DMSO em modos tempo e dependente da dose (Fig. 2B). No entanto, o IPA-3 teve apenas um efeito marginal sobre a taxa de incorporação de BrdU de células HepG2 e H2P, implicando que o IPA-3 é altamente específica para as linhagens de células metastáticas de HCC. Para confirmar ainda mais o efeito de IPA-3 sobre a supressão do crescimento celular HCC, ensaio de formação de colónias foi realizada utilizando (MIHA), principal (HepG2) e células (H2M) HCC metastático não tumorigénicas. O resultado mostrou que o IPA-3 inibiu significativamente o crescimento de células HepG2 e H2M, mas apenas teve um efeito muito marginal em células MIHA (Fig. 2C). , células MIHA notáveis, que têm um nível muito baixo de PAK1 endógena, não mostrou nenhuma diferença na proliferação celular após tratamento IPA-3. Tomados em conjunto, estes resultados indicaram que o tratamento com IPA-3 suprimiu a proliferação celular HCC em ordem decrescente de preferência, metastático HCC HCC primária . Não transformada hepatócitos, e de um modo dependente-PAK1

(A ) O efeito do IPA-3 sobre as taxas de proliferação celular de MIHA (, painel superior esquerdo), HepG2 (, painel central superior) H2P (, painel superior direito), H2M (inferior, painel esquerdo) e MHCC97L (, painel inferior direito ) células. A análise estatística foi efectuada por comparação com o valor do controlo de DMSO. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 (ANOVA). (B) ensaios de rotulagem BrdU de MIHA (, painel superior esquerdo), HepG2 (, painel central superior), H2P (, painel superior direito), H2M (inferior, painel esquerdo) e MHCC97L (inferior, painel da direita) células. *

P

0,05 (ANOVA) em comparação com o controlo de DMSO. As barras de erro, significa ± desvio padrão de amostras em triplicado. (C) placas representativos de ensaio de formação de colónia de MIHA (painel esquerdo), HepG2 (painel do meio) e as células H2M (painel direito). Gráfico de barras de ensaio de formação de colónias (painel inferior). *

P Art 0,001, **

P Art 0,01 (ANOVA), em comparação com o controlo de DMSO. As barras de erro, significa ± desvio padrão de amostras em triplicado.

IPA-3 induz a apoptose de células de carcinoma hepatocelular

Para investigar se IPA-3 afeta a apoptose em células de carcinoma hepatocelular, um anexina V-7ADD ensaio de coloração foi realizada. Desde 10 uM IPA-3 inibe a taxa de proliferação e uma concentração mais elevada isto é, 20 uM provoca um resultado significativo no ensaio de incorporação de BrdU nas células H2M, 10 uM e 20 uM foram utilizados para investigar o efeito proeminente do IPA-3. O resultado mostrou que a incubação de células H2M com 20 uM IPA-3 conduziu a uma maior percentagem de células que exibem um sinal positivo de coloração de anexina V, como comparado com o controlo de DMSO, sugerindo que as células sofreram apoptose sob o tratamento com IPA-3 ( A Fig. 3A). Além disso, o potencial de actividade pró-apoptótica de IPA-3 foi ainda analisada pela clivagem de PARP1 e caspase 3. Tratamento de IPA-3 em células H2M resultou em um nível atenuado de PARP a 20 uM e a forma de PARP1 clivagem podia ser detectada em 40 uM (Fig. 3B). Esta foi acompanhada de uma redução dependente da dose dos níveis de fosforilação de PAK1 PAK1 (Fig. 3B). Além disso, o nível de caspase 3 clivada aumentou de uma forma dependente da dose. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o IPA-3 induz a apoptose através da inibição PAK1 numa concentração elevada.

Ensaio de coloração V-7ADD

(A) anexina. Os sinais de fluorescência de anexina V-PE e 7-AAD foram detectados com PE-A e Per-Cy5-5-A canais, respectivamente (painel superior). A percentagem de células coradas H2M com anexina V-PE apenas sob diferentes tratamentos foi mostrado num gráfico de barras (painel inferior). *

P

0,001 (ANOVA) em comparação com o controlo de DMSO. (B) As células H2M privadas de soro foram tratadas com doses crescentes de IPA-3 em conjunto com reposição de soro durante 24 horas. A análise Western blot de PARP1, P-PAK1 (T423), PAK1 total e caspase clivada 3 foi realizada.

IPA-3 Suprime HCC migração celular

PAK1 tem um papel de destaque na migração de células, particularmente na regulação do stress e a formação de fibras de rotatividade adesões focais. Assim, imunofluorescência foi realizada para investigar se o IPA-3 pode influenciar estes processos. IPA-3 foi encontrada para melhorar a formação de fibras de stress e adesões focais em ambas as células H2M e H2P, que foram visualizadas por os sinais de imuno-positivas faloidina e paxilina de fibras de stress e adesões focais, ao passo que o controlo de DMSO mostraram uma fraca e dispersa coloração. Além disso, os resultados mostraram que o tratamento de IPA-3 aumentou significativamente o número de complexos de adesão focais em células H2M e H2P como revelado pela coloração paxilina (Fig. 4A). A fosforilação de paxilina na serina-178 (S178) é importante para a migração mediada por PAK1 celular, que tem sido mostrada a ser fosforiladas por JNK, [4], [16]. Em células H2M, fosforilação de paxilina em S178 foi significativamente reduzida, juntamente com um tratamento durante a noite de IPA-3 (Fig. 4B). Assim, o IPA-3 inibe a sinalização do /JNK /via PAK1 paxilina. Além disso, um ensaio Transwell migração foi realizada para estudar o efeito de IPA-3 na

In vitro

capacidade de migração de células H2M. Encontramos que o IPA-3 suprimiu significativamente a migração de células H2M como o número de células que migraram foi notavelmente reduzido em 79%, em comparação com o controlo de DMSO (Fig. 4C). Tomados em conjunto, estes dados ilustrado que o IPA-3 reduz significativamente a mobilidade celular dependente de PAK1 de células CHC.

(A), a expressão da proteína Paxillin foi detectada por análise de imunofluorescência sob tratamento IPA-3. células H2M e H2P (painel superior) estavam durante a noite e tratadas com controlo de DMSO ou IPA-3 (20 uM) durante 15 minutos, seguido por reconstituição de FBS durante 10 minutos, privadas de soro. sinais de imunofluorescência de phalloidin (vermelho), paxilina (Verde) e DAPI (azul) representam fibra de stress, de adesão focal e do núcleo, respectivamente (ampliação de 40X). O número de adesão focal (paxilina) foram contadas em H2M (inferior, painel esquerdo) e H2P (inferior, painel da direita), e representada no gráfico de barras. As barras de erro, significa ± desvio padrão de amostras em triplicado. *

P Art 0,01 (

t

-teste) em comparação com o controle de DMSO. (B) Análise de Western blot sobre os níveis de fosforilação de PAK1 e paxilina. células privadas de soro foram tratadas com várias concentrações de IPA-3, como indicado, durante 15 minutos, seguido por reconstituição de FBS durante 10 minutos. (C) Imagens representativas de ensaio de migração Transwell de células H2M. As células foram tratadas com DMSO ou 10 ^ M de IPA-3, e foram deixadas migrar durante 24 horas. Imagens mostram as células terem migrado para a câmara inferior (painel superior). O número de células que migraram foram contadas e representada no gráfico de barras (painel inferior). As barras de erro, significa ± desvio padrão de amostras em triplicado. *

P

. 0,01 (

t

-teste) em comparação com o controle DMSO

IPA-3 Suprime NF-kB Translocação Nuclear

relatórios anteriores demonstraram que PAK1 estimula a actividade de translocação e subcelular do factor nuclear potenciador da cadeia leve de células B activadas (NF-kB), e promove a sobrevivência de células [17], [18]. Assim, nós examinamos se IPA-3 é capaz de inibir a actividade de NF-kB. H2M com um elevado nível de expressão endógena de PAK1 hepatócitos e imortalizadas, células MIHA foram privadas de soro e depois tratou-se separadamente com IPA-3 seguido por factor de necrose tumoral-alfa (TNF-α). Como mostrado na Fig. 5A, a coloração positiva de NF-kB foi detectada predominantemente no citoplasma do controlo de DMSO, ao passo que a coloração de NF-kB foi acumulado no núcleo após a indução de TNF-α. Interessantemente, as células pré-tratadas com IPA H2M-3 resultou numa coloração citoplasmática de NF-kB, indicando que o IPA-3 suprimiu a segmentação nuclear TNF-induzido-α de NF-kB. Ao contrário das células H2M, IPA-3 não suprimiu induzida por TNF-α activação do NF-kB em células MIHA, às quais falta o PAK1 endógena. Este resultado sugeriu que a inibição da activação do NF-kB pelo IPA-3 é dependente de PAK1. Para investigar se a inactivação PAK1 está envolvida na supressão induzida por IPA-3 da translocação de NF-kB, a fosforilação de PAK1 foi determinada (Fig. 5B). Consistente com um estudo anterior que mostrou que PAK1 foi prontamente activadas por TNF-α em várias linhas de células [19], o nível de fosfo-PAK1 foi elevada em células estimuladas com TNF-α (20 ng /ml). O nível de fosforilação foi maior em 0,5 horas e, em seguida, gradualmente reduzida depois. Por outro lado, a fosforilação de PAK1 foi completamente suprimida em IPA-3 células pré-tratadas. Este resultado sugeriu que o IPA-3 é capaz de suprimir a activação PAK1 induzida pelo TNF-α, o que se correlacionou bem com a inibição de IPA em-3 induzida por TNF-α translocação de NF-kB. A indução de metaloproteinases (MMP) -9 por TNF-α mostrou ser mediada por PAK1 [19]. Para elucidar o efeito de IPA-3 sobre a actividade induzida por TNF-α de MMP-9 e COX-2, que são alvos a jusante de NF-kB [20], [21], foi realizada de qRT-PCR para quantificar mRNA produção de MMP-9 e COX-2. Após a normalização com β-actina, as células H2M responderam ao TNF-α com um aumento da produção de ARNm de MMP-9 e COX-2 (Fig. 5C). No entanto, os resultados mostraram que o tratamento de IPA-3 suprimiu significativamente a expressão de MMP-9 e transcritos de COX-2 de um modo dependente da dose.

(A) Efeito de IPA-3 na localização subcelular de NF- kB foi avaliada por coloração de imunofluorescência. Após privação de soro durante a noite, as células H2M (painel da esquerda) e MIHA (painel direito) foram tratadas com DMSO ou IPA-3 (20 uM, 15 minutos) seguido por uma adição de TNF-α (20 ng /ml, 15 minutos) . NF-kB foi detectado com um anticorpo específico (verde) e no núcleo foi corado com DAPI (azul). (B) Análise de transferência de Western de P-PAK1 (T423) e PAK1 totais foram detectadas nas células H2M estimuladas por TNF-α (20 ng /ml) com ou sem pré-tratamento IPA-3 (20 uM, 15 minutos). TNF-α foi incluído no meio de cultura durante 0, 0,5, 1, 2 ou 4 horas. (C) A expressão do quantitativa PCR em tempo real foi realizado para analisar o nível de ARNm de MMP-9 (painel da esquerda) e COX-2 (painel direito). H2M células privadas de soro foram tratadas com ou sem pré-tratamento IPA-3 (10 ou 20? M, 15 minutos) seguido por TNF-α (10 ou 20 ng /mL, 24 horas). Os resultados quantitativos de níveis de MMP-9 e COX-2 de ARNm foram normalizados para a p-actina. Os valores representavam a média ± DP de três experiências independentes. *

P Art 0,001 (ANOVA), ***

P

. 0,05 (ANOVA), em comparação com o controlo de TNF-α

IPA 3 Suprime Tumorigênese em Nude mouse xenoenxerto modelo

A amplitude da atividade antitumoral IPA-3

in vivo

foi avaliada utilizando um modelo de rato de xenotransplante nu. Uma vez que a linha de células de H2M foi incapaz de desenvolver tumores sólidos em ratinhos nus, foi utilizada outra linha de carcinoma hepatocelular humano com nível MHCC97L PAK1 semelhante (Fig. 1A). Após o estabelecimento do tumor (100 mm

3), cinco ratinhos por grupo foram tratados com DMSO ou várias doses de IPA-3 (2 mg /kg e 4 mg /kg) por injecção i.p. TIW injecção. Enquanto o tratamento foi bem tolerado, conforme provado por nenhuma perda de peso significativa, IPA-3 suprimiu significativamente o crescimento do tumor (Fig. 6A) e resultou em pesos de tumor mais baixos (Fig. 6B). Além disso, a análise de transferência de Western mostrou que o IPA-3 reduziu a fosforilação de PAK1 e o seu alvo a jusante de JNK (Fig. 6C). Tomados em conjunto, estes resultados indicaram que o IPA-3 pode suprimir tumorigênese

in vivo

reduzindo a atividade PAK1.

foram usadas células MHCC97L (A) para o modelo de xenotransplante. Os ratinhos foram tratados três vezes por semana, quer com DMSO ou IPA-3 (2 mg /kg ou 4 mg /kg, i.p.). *

P Art 0,001 (ANOVA), em comparação com o grupo controle DMSO. (B) Os pesos dos tumores foram medidos no final do estudo. *

P Art 0,001, **

P Art 0,01, (ANOVA), em comparação com o grupo controle DMSO. (C) Os resultados representativos das análises de Western blotting. P-PAK1 (T423), PAK1 total, a P-JNK e JNK totais foram detectadas. ***

P

0,05 (ANOVA) em comparação com o controlo de DMSO. As barras de erro, significa ± SD de 5 animais por grupo.

Discussão

PAK1 está envolvido em uma rede de transdução de sinalização complexo, que está ligado a vários processos celulares, incluindo modelagem citoesqueleto, celular motilidade, sobrevivência e proliferação e progressão do ciclo celular [5]. Desregulado ou PAK1 hiper-ativado é comumente associado com HCC [19]. Assim, PAK1 tornou-se um alvo terapêutico potencial no controlo da tumorigénese e metástase de carcinoma hepatocelular [22]. IPA-3 foi identificado como sendo um inibidor de molécula pequena alostérico de PAK1 [8]. Com pouco ou menos relatos de IPA-3 no tratamento da HCC humana, foram empregados vários

in vitro

in vivo

experimentos para investigar a capacidade anti-tumorigénico do tratamento IPA-3 de

e linhas de células de carcinoma hepatocelular humanos.

neste estudo, demonstramos que o IPA-3 pode inibir a taxa de proliferação de HepG2, H2P, células H2M e MHCC97L de maneiras dose e tempo-dependente.