Abstract

Fundo

cânceres colorretais (CRCs) com instabilidade de microssatélites (MSI) estão associados com um bom prognóstico e uma alta densidade de linfócitos que se infiltram no tumor (TIL). Temos realizado para determinar a relação entre a densidade Til e características histológicas MSI CRC.

Pacientes e Métodos

Usando microarrays de tecidos, de células T infiltração sub-população, incluindo as células T (CD3), células T citotóxicas (CD8) e células T reguladoras (FoxP3) foram estudados em 86 MSI CRCs. Foram analisados ​​separadamente TIL do estroma e compartimentos epiteliais no centro do tumor, a margem de invasão tumoral e tecido normal associado.

Resultados

Para densidade FoxP3 + TIL no compartimento do centro de tumor estromal, encontramos uma forte correlação negativa com o estágio T4 (p = 0,01), invasão nó (p 0,001). e VELIPI (embolia vascular, invasão linfática e invasão perinervous) critérios (p = 0,002)

Conclusão

a forte correlação entre a densidade de células T reguladoras ea ausência de critérios VELIPI sugere que este sub-grupo de células T é preferencialmente associado com tumores menos invasivos

Citation:. Tougeron D, Maby P, Elie N, Fauquembergue E, Le Pessot F, Cornic M, et al. (2013) Regulatory Linfócitos T está relacionado com características histológicas menos agressivo nos cancros colo de microssatélites-instáveis. PLoS ONE 8 (4): e61001. doi: 10.1371 /journal.pone.0061001

editor: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, República da Coreia

Recebido: 19 de dezembro de 2012; Aceito: 05 de março de 2013; Publicação: 15 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Tougeron et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O apoio financeiro foi recebido do Inserm – Haute-Normandie (salário de P. Maby) e Ligue Contre le Cancer de Seine-Maritime (reagentes). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

recentemente, a resposta imune do hospedeiro tem sido demonstrado que desempenham um papel importante na determinação do resultado de pacientes com cancro colo-rectal (CRC). Páginas

et ai demonstraram que uma alta densidade do infiltrado de células T de memória dentro do tumor está associada com a ausência de marcadores histológicos de invasão em curso, também chamado VELIPI (embolia vascular, invasão linfática e invasão perinervous) e critérios com uma melhor sobrevivência global [1], [2]. Além disso, de linfócitos que se infiltram no tumor (TIL) a densidade parece ter um valor prognóstico melhor do que a fase de TNM [3], e alguns sub-populações de células T têm sido mostrados para ser associada com um melhor resultado clínico CRC, tais como as células T citotóxicas (CD8 +) , as células T helper Th17 e, mais controversa, as células T reguladoras (Foxp3 +) [3] – [5].

Curiosamente, os tumores que apresentam uma instabilidade de microssatélites (MSI) ou fenótipo erro de replicação são histopatologia caracterizada por alta TIL densidade [6] – [8]. Estes tumores têm um melhor prognóstico em geral com menos recorrência da doença e melhor sobrevida do que o outro homólogo CRC, com microssatélites fenótipo estável [9], [10]. MSI fenótipo, observada em cerca de 12% dos cancros colorrectais, é devido à inactivação do sistema de reparação de emparelhamentos incorrectos do ADN (MMR)

11 que resulta, quer de uma alteração epigenética somáticas, ou a partir de uma alteração da linha germinativa (síndrome de Lynch) [11 ]. MMR inactivação afecta a replicação de repetição de nucleótidos e pode conduzir à geração de neo-proteínas degradadas em neo-péptidos apresentados em moléculas HLA. Portanto, o melhor prognóstico para câncer colorretal instáveis ​​microssatélites poderia ser pelo menos parcialmente explicada pela presença de TIL que poderiam ser específicos para determinados peptídeos tumorais resultantes da instabilidade de microssatélites [12], [13]. tumores MSI têm maiores taxas de CD8 + e FoxP3 + TIL que os tumores MSS, mas os poucos estudos publicados sobre MSI CRCs relatar resultados contraditórios em relação a esses valores prognóstico TIL [4], [8], [14] – [18]. Além disso, em MSI CRCs, única CD8 + densidade de linfócitos intra-epitelial foi totalmente estudada, excluindo linfócitos estromais e outras células T sub-populações [14], [19].

densidade celular imune pode ter um valor prognóstico e portanto, ser clinicamente relevante, especialmente para a prescrição da quimioterapia adjuvante no MSI CRCs. Mas, para o nosso conhecimento, até agora nenhum estudo investigou, em uma grande série de pacientes, a ligação entre os diferentes sub-populações TIL no estroma e compartimentos epiteliais e prognóstico ou histológicas tumor características, em MSI CRCs. Neste estudo, analisamos célula T total de células T citotóxicas e infiltração tumoral das células T reguladoras no MSI CRCs e tentou estabelecer esta ligação para estas populações de células imunes.

Materiais e Métodos

Seleção dos pacientes e Avaliação de instabilidade de microssatélites

em nossa instituição, instabilidade de microssatélites foi analisada em todas as CRCs desde 2003. Para cada paciente, DNA genômico foi extraído de tumor emparelhados e tecidos colorretais normais. avaliação de instabilidade de microssatélites foi realizada por uma análise comparativa destas amostras de DNA usando os cinco repetições de consenso mononucleotídicos (

BAT25

,

BAT26

,

NR21

,

NR22

e

NR24

) [20]. instabilidade microssatélite (MSI) foi definida pela presença de instabilidade que afecta, pelo menos, dois marcadores (que corresponde, de facto, apenas tumores elevados MSI). Comissão de Ética da nossa instituição (Comité de protection des personnes Nord-Ouest I) aprovou o estudo e dispensou a necessidade de consentimento informado por causa da natureza retrospectiva do estudo. De acordo com a regulamentação francesa, o consentimento escrito tinha sido sistematicamente obtido para a mutação germinativa sistema de reparo incompatível DNA análises que foram realizadas para fins médicos.

paciente e tumor Características, e o resultado clínico

Paciente e características de linha de base de tumor foram recolhidas. Além disso, para cada tumor, marcadores histológicos de invasão em curso correspondentes aos critérios VELIPI foram determinadas pelo exame de um patologista [1].

Todos os pacientes com menos de sessenta anos de idade e /ou com história familiar de Lynch espectro tumor síndrome foram dirigidas a consulta oncogenetic. Nesses pacientes, a presença de uma mutação germinativa deletéria gene do sistema de reparo incompatível DNA foi procurado.

Doença recorrência foi avaliada a cada 3 meses nos dois primeiros anos e de seis em seis meses nos próximos três anos. dados de acompanhamento foram atualizados em dezembro de 2011.

Tissue microarrays e imunohistoquímica

Tissue microarrays (TMA) consistem em blocos de parafina em que até 1000 núcleos de tecido separados são reunidos em uma forma de matriz para permitir várias análises histológicas após imunocoloração. Para cada tumor, quatro núcleos de 0,6 mm de diâmetro foram tomadas no centro do tumor, na margem invasão, e quatro núcleos adicionais foram tomadas a partir de mucosa do cólon distante histologicamente normal (Tissue Arrayer, Alphelys, França). Todas as análises foram realizadas em surgicaly ressecado CRC primária antes do tratamento de quimioterapia. Área com resposta linfóide como de Crohn foram excluídos da construção TMA e análises. Os oito TMA utilizados neste estudo continham mais do que 1000 núcleos de CRCs instáveis ​​microssatélites. Quatro secções de um de espessura foram cortadas a partir dos blocos de TMA e utilizado para imuno-histoquímica com base no CD3 (célula T), CD8 (célula T citotóxica) e FoxP3 (células T reguladoras) coloração. tecidos fixados em formalina foram desparafinadas e recuperação de epítopo induzida pelo calor foi realizada usando um vaporizador. As lâminas foram incubadas com anticorpos monoclonais de ratinho, anti-CD3 (DAKO, Carpentria, CA) diluído a 1/50 durante 32 min, anti-CD8 (DAKO, Carpentria, CA) diluído a 1/50 durante 32 min, e anti-FoxP3 (Abcam , Cambridge, MA) diluído a 1/50 durante 32 min, de acordo com as instruções dos fabricantes. Para cada secção, um anticorpo primário do rato e um anticorpo anti-ratinho secundário para a revelação foram usadas. O anticorpo secundário foi directamente acoplado a enzima HRPO (Horse-Radish-peroxidase, DAKO) e aplicado durante 15 min. A cor foi revelada utilizando DAB cromogénio (Diaminobenzine) e aplicação H2O2 (peróxido de hidrogênio).

Quantificação dos linfócitos infiltrantes

Cada lâmina foi digitalizado com Mirax Scan®. O programa de análise Chips’N baratos TMA, usando Aphelion 3,2 (ADCIS, Hérouville St Clair, França), tinha sido optimizada para identificar cada chip no slide virtual TMA e permitir-nos para delinear as áreas acelular, o estroma e os compartimentos epiteliais para cada núcleo. As regiões de interesse, ou seja, estroma e do epitélio, foram delineados manualmente dentro dos não-malignas (4 núcleos), centro de tumor (4 núcleos) e margem de invasão (4 núcleos) sites para cada paciente. Após a subtracção das áreas acelulares, as proporções entre as áreas imunocoradas e áreas totais região de tecido foram calculadas automaticamente (Figura 1).

Exemplos de fichas centro do tumor com CD3 (A), CD8 (B) e (C FoxP3 ) coloração. painéis esquerdos são exemplos de altas densidades Til e painéis direitos são exemplos de baixas densidades TIL. O estroma é circulado em vermelho, o epitélio em azul, e as áreas pretas são excluídos. As áreas marcadas que são levados em conta para calcular a densidade infiltrado de linfócitos estão circulados em amarelo. Todos os dados foram adquiridos com programa de análise de N baratos TMA do Chip.

TIL quantificações foram dadas pelas percentagens das superfícies totais marcados pelos anticorpos. A análise visual das amostras de 10 pacientes nos levou a estimar que um por cento de tumor-coloração de linfócitos infiltrando correspondeu a cerca de 350 TIL /mm

2. Nos tumores com diferenciação mucinoso, densidades TIL foram calculados fora das áreas de mucina.

Análise Estatística

T-teste foi utilizado para testar associação entre características do tumor e densidade TIL. sobrevida livre de doença (DFS) foi estimada a partir da data da cirurgia até a recorrência documentada ou a última data de acompanhamento. A curva de sobrevivência foi estabelecido pelo método de Kaplan-Meier. Todas as análises estatísticas foram realizadas com um valor de significância de dois lados de 0,05, utilizando o software Statview (Statview para Windows, SAS Institut Inc., versão 5.0).

Resultados

paciente e tumor Características

Um total de 106 CRCs com instabilidade de microssatélites (dois pacientes desenvolveram 2 tumores síncronos), que tinham sido submetidos a cirurgia entre janeiro de 2003 e dezembro de 2009, foram inicialmente incluídos. Alguns pacientes foram subsequentemente excluído da análise devido à ausência de amostra de tumor ou de dados clínicos. Oitenta e seis pacientes foram ainda incluído no final do estudo (Tabela 1). idade média dos pacientes foi de 68,6 ± 17,5 anos. Trinta e um pacientes foram testados quanto a mutações da linha germinativa do gene de MMR. Dezoito dos pacientes (24,4%) apresentaram uma síndrome de Lynch, como definido pela presença de uma mutação da linha germinativa deletério MMR (16 doentes) ou uma apresentação preenchendo os critérios Amsterdão nos pacientes sem a mutação da linha germinativa MMR (2 pacientes).

a maioria dos tumores foram TNM fase II ou III (74,4%) e no cólon direito (63,9%) (Tabela 1). Cerca de metade dos tumores tinham critérios VELIPI (45,3%) e 12,7% eram do tumor mucinoso, definidos como tumores com diferenciação mucinoso que representem pelo menos 50% do volume total do tumor; 25,3% de todos os tumores tinham alguma diferenciação mucinoso representando menos de 50% do volume total do tumor (menos de 20% para cerca de metade destes tumores, e entre 20 e 40% para os outros). Apenas 16 (18,6%) pacientes recaída depois de um período de acompanhamento médio de 25,0 ± 5,7 meses. Em seguida, a mediana DFS não foi atingido. Três anos de DFS foi 78,7%. sobrevida global (SG) mediana foi de 72,1 ± 11,3 meses e três anos OS foi de 60,2%.

células

CD3 +, CD8 +, e FoxP3 + T Linfócitos

infiltrantes de tumor foram predominantemente localizada no estroma compartimento (Figura 2). A densidade celular total T significativamente mais elevado foi observado em tumores em comparação com tecidos de cólon normais (p 0,05, dados não apresentados)., Como já foi relatado

13 dentro dos tecidos tumorais e normais, CD3 +, CD8 + e FoxP3 + TIL densidades eram maior do que no estroma no epitélio (p 0,01 para todos os marcadores) (Figura 2). Além disso, houve uma forte correlação positiva entre células CD3 +, CD8 + e FoxP3 + TIL densidades observadas em ambos centro do tumor e da frente da invasão, independentemente de o compartimento (p 0,01, dados não apresentados). Moroever, havia mais elevados densitites CD8 + TIL na frente invasiva do que no centro do tumor (p 0,05), que não era o caso de densidades CD3 + e FoxP3 + TIL. Não houve diferença entre densitites TIL em pacientes com ou sem síndrome de Lynch.

A barra de gráficos representa as percentagens de superfícies marcadas por CD3, CD8 e FoxP3 imunomarcação no estroma (stro) e epiteliais compartimentos (PE), no centro do tumor (TC) e tecidos a frente de invasão (SE). Os erros padrão são indicados pelas barras. densidades CD3 + TIL foram, respectivamente, 2,2 ± 2,5% no compartimento epitélio centro do tumor, 6,4 ± 5,1% no compartimento estromal centro do tumor, 2,3 ± 2,5% no compartimento epitélio invasão frente, 7,2 ± 6,1% no compartimento estromal invasão da frente. densidades de células CD8 + TIL foram, respectivamente, 1,52 ± 2,0% no compartimento epitélio centro do tumor, de 2,9 ± 2,7% no compartimento estromal centro do tumor, de 1,8 ± 2,4% no compartimento epitélio invasão frente, de 3,3 ± 3,0% no compartimento estromal invasão frente. densidades FoxP3 + TIL foram, respectivamente, 0,13 ± 0,12% no compartimento centro epitélio tumor, 0,59 ± 0,53% no compartimento central do estroma tumoral, 0,14 ± 0,14% no compartimento dianteiro epitélio invasão, 0,63 ± 0,58% no compartimento invasão frente do estroma.

Associação entre TIL densidades e variáveis ​​clínicopatológicos

Nós procuramos uma correlação entre as densidades TIL nos diferentes compartimentos e um número de diferentes variáveis ​​clínico-patológicas ( 60 anos versus ≤ 60 anos, mal contra o bem /tumores moderadamente diferenciados, rectal cólon /esquerda versus localização cólon direito tumor, invasão da parede (T4 contra T1-3), invasão nó (N + contra N0), marcadores histológicos de invasão em curso (critérios VELIPI), as fases I-II contra III- IV). densidade de células CD3 + TIL no compartimento epitélio do centro do tumor foi associada com fraca diferenciação (p = 0,01, dados não apresentados). Para densidade CD3 + TIL nos outros compartimentos e densidade CD8 + TIL em todos os compartimentos, não houve correlação com os dados clínicos. Pelo contrário, a densidade FoxP3 + TIL no compartimento estromal do centro do tumor foi fortemente associado negativamente com a fase de T4 (P = 0,01), invasão nó (p 0,001), critérios VELIPI (p = 0,002) e as fases III-IV (p 0,001 ) (Mesa 2). Não houve correlação entre FoxP3 + TIL densidade em qualquer outro compartimento e dados clínicos.

Discussão

Neste estudo, inicialmente comprometeu-se a avaliar os valores prognósticos de diferentes TIL (CD3 +, CD8 + , FoxP3 +) densidades em cânceres colorretais com instabilidade de microssatélites. Na análise univariada, invasão nó (p = 0,002) e critérios VELIPI (p = 0,004) foram preditivos de DFS, mas não CD3 +, CD8 + e FoxP3 + TIL densidades (dados não mostrados). Embora o nosso grande série de pacientes (n = 106) foi confiável para estudar diferentes características histológicas de CRCs com instabilidade de microssatélites, não foi suficiente para realizar uma análise estatística robusta relativos à sobrevivência. Na verdade, porque este tipo de câncer tem um bom prognóstico, a poucos pacientes (n = 16) tiveram uma recaída e nenhuma correlação entre qualquer densidade populacional TIL e DFS pode ser observada. No entanto, verificou-se uma forte correlação negativa entre a densidade FoxP3 + TIL no compartimento estromal o centro do tumor e características tumorais mais agressivas: invasão da parede, os critérios de invasão nó e VELIPI, sugerindo que as células T reguladoras dentro do tumor pode estar associada com a propagação de células de câncer limitada

potencial

Vários estudos têm demonstrado que as células T CD8 +, que possam constituir a maior parte do infiltrado intra-epiteliais, são associados com uma melhor sobrevivência em CRCs [21] -. [24]. Além disso, o conjunto infiltrado CD8 + TIL mostrou ser mais densa em CRCs MSI do que em MSS CRCs, provavelmente devido à expressão por células tumorais de MSI de neo-antigénios imunogénicos derivados de mutação frameshift [13] – [17]. Estes estudos sugerem que a vantagem de sobrevivência em MSI CRCs pode ser, pelo menos em parte, atribuído a um aumento de células T intra-tumoral resposta CD8 +, orientada contra estes neo-antigénios. No entanto, nosso estudo não estabelecer associação entre CD8 + se infiltrar densidade e melhor prognóstico em MSI CRCs. Seria interessante para avaliar a funcionalidade de CD8 + TIL desde algumas observações clinicas sugerem uma função prejudicada de CD8 + TIL, em MSI CRCs [25], [26].

Outra subpopulação importante TIL é composto de células CD4 + T células. Infelizmente, até agora, não temos sido capazes de analisar a população de células CD4 + T, embora CD8 + citotóxicos respostas eficazes requerem a ajuda de células T CD4 +. De fato, entre os diferentes anticorpos anti-CD4, tentámos, nem um único permitido para a coloração de boa qualidade que seria útil no que respeita à TMA e compatível com o nosso software de análise de imagem. As células T CD4 + apareça aumentada em tumores em comparação com tecidos normais [27] e um baixo CD4 + infiltrado pode ser associada com uma melhor sobrevivência [28], [29], que permanece controverso [5]. Esta observação pode ser explicada pelo facto de que as células T CD4 + representa uma população heterogénea contendo ambas as células activadas T auxiliares de diversas actividades, e células T reguladoras.

Grande interesse tem sido recentemente demonstrado em células FoxP3 + T que têm de regulamentação as funções em resposta imunitária. Esta população de linfócitos é caracterizada por secreção de citocinas imunossupressoras (TGF-ß e IL-10) e expressão de moléculas, tais como CTLA-4 (linfócito T citotóxico Antigen 4) que inibem a activação e proliferação de células T efectoras CD4 + e CD8 + [30 ]. Uma elevada densidade de células T reguladoras foi encontrado frequentemente nos gânglios linfáticos e tumores de pacientes de CRC, e também no sangue, em comparação com indivíduos saudáveis ​​[31] – [33]. Inicialmente, alguns estudos encontraram uma correlação entre a alta FoxP3 + densidade TIL e mau prognóstico no CRC [4], [34]. Estudos recentes, contudo, verificaram, surpreendentemente, que este infiltrado pode ser associado com um bom prognóstico [33], [35] – [37]. Até agora, apenas Michel

et al

ter cuidadosamente avaliada a presença dessas células na MSI CRCs [38]. Eles observaram uma FoxP3 mais elevados + infiltrar na MSI CRCs que em MSS CRCs. No entanto, a ligação com prognóstico não foi estudada. Em nosso estudo, em CRCs MSI, FoxP3 + TIL densidade foi claramente associados com características de tumor menos invasivas, em particular com a ausência de critérios VELIPI, e, portanto, poderia ser indiretamente associada a um melhor prognóstico. Este resultado foi inesperado e pode até parecer paradoxal, já que as células T reguladoras inibir a resposta imune. De facto, estas células T reguladoras podem reflectir um mecanismo desenvolvido pelo próprio tumor para limitar a resposta anti-tumoral, e, talvez, a resposta anti-tumoral esta mais eficiente é, as mais numerosas estas células T reguladoras são. Esta hipótese é fortemente apoiada pela correlação encontramos entre CD3, CD8 e densidades FoxP3 + TIL. Outra explicação coul ser que as células T reguladoras reduzir a inflamação que pode contribuir para o crescimento do tumor e seu potencial metastático, como relatado por Mantovani

et al

[39]. Heterogeneidade no cancro colorectal infiltrando células T reguladoras, como foi recentemente descrito por Blatner

et al

[40], também poderia explicar alguns resultados clínicos inesperados em pacientes com câncer colorretal. No entanto, a correlação estatisticamente significativa entre FoxP3 + TIL densidade e DFS pôde ser estabelecida, talvez outra vez por causa de uma falta de poder estatístico, devido ao pequeno número de recidivas tumorais

.

A força do nosso estudo, em comparação com outros estudos foi que levou em conta a precisão TIL localizações. As subpopulações diferentes TIL parecia ser principalmente co-localizada no estroma do tumor. Como em MSS CRCs, as células T CD8 + parecia constituir a maioria dos linfócitos T intra-epiteliais infiltrar no MSI CRCs. FoxP3 + T densidade celular apareceu a ser baixa em comparação com células CD3 + e CD8 + T, destacando o fato de que outras células T CD4 + estão presentes, que poderia desempenhar um papel importante na MSI CRCs.

Em nosso estudo, os fatores preditivos de recorrência foram critérios de invasão e VELIPI nó, como já relatado em MSS CRCs [41]. Associação entre a densidade das células T reguladoras que se infiltram no tumor ea ausência de critérios VELIPI é certamente a mais importante descoberta neste estudo. Todos esses resultados precisam ser confirmados e mais precisamente definido, espero que em uma coorte multicêntrico maior de pacientes MSI CRC, incluindo mais pacientes com recorrência da doença.

Reconhecimentos

Os autores agradecem a Jeffrey Arsham , um tradutor americano, por ter analisado e revisto o texto no idioma original em Inglês. Os autores agradecem a Julie Tinat para os dados relativos a testes de MMR germinal.