Abstract

Um bom prognóstico pode ser esperado para a maioria, mas não todos, os casos de câncer papilar de tireóide. estudos moleculares demonstraram numerosos tratamento benéfico e fatores prognósticos em vários marcadores moleculares. Enquanto a maioria dos relatórios anteriores têm-se centrado sobre genómica e proteómica, poucos têm incidido sobre lipidomics. Com o advento de espectrometria de massa (MS), tornou-se possível identificar muitos tipos de moléculas, e esta ferramenta analítica tornou-se crítico no domínio da ômicas. Recentemente, a espectrometria de massa de imagem (IMS) foi desenvolvido. Depois de um processo de pré-tratamento simples, IMS pode ser usado para examinar as secções de tecido em lâminas de vidro com a informação de localização.

Aqui, foi realizada uma análise IMS de sete casos de cancro papilar da tiróide através da comparação dos canceroso com tecidos normais, concentrando sobre a distribuição de fosfolípidos. Identificou-se que a fosfatidilcolina (16: 0/18: 1) e (16: 0/18: 2) e esfingomielina (D18: 0/16: 1) são significativamente mais elevados no cancro papilar da tiróide que no tecido normal da tiróide, tal como determinado pelo conjunto de massa (MS /MS) análise. Estas diferenças de distribuição pode ser associada com o comportamento biológico de cancro papilar da tiróide

citação:. Ishikawa S, Tateya I, Hayasaka t, Masaki N, Y Takizawa, Ohno S, et al. (2012) aumento da expressão de fosfatidilcolina (16: 0/18: 1) e (16: 0/18: 2) no cancro da tiróide papilar. PLoS ONE 7 (11): e48873. doi: 10.1371 /journal.pone.0048873

editor: Yunli Zhou, Harvard Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de maio de 2012; Aceito: 02 de outubro de 2012; Publicação: 06 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Ishikawa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma bolsa SENTAN da Agência de Ciência e Tecnologia do Japão para MS (https://www.jst.go.jp/sentan/en/); um Grant-in-Aid para a Investigação Científica de MS (WAKATE-S: 20670004, https://www.jsps.go.jp); e uma concessão do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, Japão para TI e MK. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de tireóide é o tumor maligno mais comum na região da cabeça e pescoço. Os tipos histológicos de câncer de tireóide variam, e incluem carcinoma papilífero (80% de todos os casos de cancro da tiróide), carcinoma folicular, carcinoma medular, e carcinoma indiferenciado. Prognosis também varia dependendo do tipo histológico. carcinoma indiferenciado tem um prognóstico ruim, com uma taxa de sobrevivência de 10 anos de 10-20% ou menos, enquanto os pacientes com outros tipos histológicos, tais como carcinoma papilar, carcinoma folicular e carcinoma medular, pode esperar bons resultados com a 10-year taxa de sobrevivência de 90%, 90%, e 70-80%, respectivamente [1]. No entanto, até casos de carcinoma papilar pode deixar de ser controlado devido a metástases à distância ou a transformação anaplásico. Será necessário prever de forma fiável transformação anaplásico antes que ela ocorra, e para identificar casos de mau prognóstico entre os carcinomas papilares, a fim de melhorar o prognóstico de câncer de tireóide.

A evolução da genômica e biologia molecular têm lançar luz sobre os mecanismos patogênicos relacionados com cancro da tiróide [2]. Grandes esforços têm sido feitos para identificar genes e biomoléculas que são expressos diferencialmente em tecidos cancerosos, que podem ser utilizados como biomarcadores para elucidar patogénese do cancro da tiróide e orientar terapias adequadas e específicas moleculares [3], [4], [5]. Vários genes candidatos (para os receptores de TSH, RET /PTC, Ras, BRAF, p53) no desenvolvimento de diferentes tipos de cancro da tiróide [2] foram identificados até agora. Além disso, algumas tentativas têm sido feitas para utilizar proteómica como uma ferramenta de descoberta para neoplasmas da tiróide. Lewis e colegas de trabalho relataram uma diferença na expressão da proteína entre carcinoma de tireóide papilar e tecido tireoidiano normal usando espectrometria de massa (MS) [6]. No entanto, o mecanismo de transformação maligna não é bem compreendida, especialmente ao nível da proteína.

Lipids estão associados com a estrutura da membrana celular, proliferação [7], a diferenciação, a regulação metabólica, inflamação [8], e a imunidade. É importante compreender a relação entre tumor e lipídios no diagnóstico e tratamento. Lipids, especialmente fosfolípidos (PLS), desempenham papéis importantes na composição da membrana celular. É geralmente aceite que as características da membrana são determinadas pelos componentes de espécies PL, e a composição destas espécies é rigorosamente determinada pelos componentes das espécies de ácido gordo [9], [10]. Alguns relatórios realizados até à data têm-se centrado sobre os lipídios, especialmente a ligação de ácidos graxos no câncer de cabeça e pescoço; No entanto, até à data, nenhum método foi desenvolvido que permite a detecção da ligação de ácidos gordos em PLs.

espectrometria de massa de tratamento de imagens (IMS) é uma ferramenta poderosa, recentemente desenvolvido que identifica a distribuição de moléculas conhecidas sobre desconhecidos /uma secção de tecido [11], [12], [13]. varredura a laser permite precisa MS, bidimensional em lâminas de vidro. Atualmente, a IMS é a única ferramenta que permite a visualização da ligação de ácidos graxos para PLs em secções de tecido, e esta abordagem de próxima geração está atraindo a atenção substancial.

O objetivo do presente estudo foi a utilização de IMS para elucidar quais PL-bound ácidos gordos foram os principais componentes das membranas celulares e, em particular, aqueles que foram expressos em níveis relativamente elevados em cancro papilar da tiróide. Este estudo foi o primeiro a investigar os casos de PLs no cancro da tiróide através da análise de IMS, eo primeiro a identificar com sucesso PLs que são altamente expressos em câncer de tireóide.

Resultados

1. análise IMS de caso 1 |

As regiões de interesse (ROI) em câncer e regiões normais foram definidos de acordo com hematoxilina e eosina (HE) -staining resultados de uma secção de tecido adjacente à seção utilizado para análise IMS. Figura 1A fornece resultados HE-coloração para o caso 1 enquanto a Figura 1B mostra ampliada regiões representativas de câncer eo tecido normal. As células cancerosas tinha um rácio citoplasmática alta e exibido características característica nuclear de câncer de tireóide papilar. achados histológicos de câncer papilar de tireóide consistiam de epitélio colunar thyroidal definido na projeção papilar. O tecido normal da tireóide é composta de muitos sacos ocos esféricos chamados folículos tireoidianos.

(A) Thyroid tecido de câncer papilar foi localizada no lado esquerdo, e tecido normal da tireóide foi localizado à direita (aumento original de 40 ×). A região do estroma foi excluída. O ROI foi determinada a partir dos correspondentes resultados HE-coloração. As caixas pretas indicam a região representante do câncer e tecido normal da tireóide. (B) ampliada regiões representativas de câncer eo tecido normal (ampliação original de 200 ×). As células cancerosas tinha um rácio citoplasmática alta e exibido características característica nuclear de câncer de tireóide papilar. achados histológicos de câncer papilar de tireóide consistiam de epitélio colunar thyroidal definido na projeção papilar. O tecido normal da tireóide é composta de muitos sacos ocos esféricos chamados folículos tireoidianos.

A Figura 2 mostra os espectros obtidos a partir de caso 1 tecido com painéis A e B derivada de regiões cancerosas e normais, respectivamente. Ambos os espectros são espectros médios, e foram obtidos a partir de ROI em câncer eo tecido normal. O número de pontos calculados na região de cancro e normal era 1425 e 258, respectivamente. O eixo horizontal indica a relação entre massa-para-carga (

m /z

) e o eixo vertical indica a abundância relativa do ião. O ião mais intenso é atribuído uma abundância de 100, e é referido como o pico base. A maioria dos iões formados em uma espectrometria de massa tem uma única carga, de modo que o

m /z

valor é equivalente à massa em si.

(A) Espectro de região de cancro e (B) espectro de região normal. Cada espectro foi a média do ROI de câncer e tecido normal na Figura 1. Cada número indicado no quadro 1 foi atribuído usando esses espectros.

A Tabela 1 mostra o top 50 de pico pegando resultados para o caso 1 ( excluindo picos isotópicos) que foram analisados ​​estatisticamente. Cancro e intensidade normal significa a intensidade média (± erro padrão) que foi dividido pelo ponto de leitura no cancro e regiões normais. Welch t-teste foi realizado entre a intensidade média de cancro e de regiões normais. O

m /z

valores da Tabela 1 são listados em ordem de sua intensidade na região de câncer. O número do

m /z

valores sem picos isotópicos foi de 40, eo número dos valores com diferenças significativas foi 26. Todos

m /z

valores da Tabela 1 foram atribuídos usando o espectro mostrado na Figura 2A e B.

2. A visualização da distribuição molecular em tecido da tiróide de caso 1 |

A Figura 3 mostra a imagem de iões que foi visualizada usando o

m /z

valores apresentados na Tabela 1. A gama de imagens a cores, cada ião foi otimizada manualmente, de modo que os picos têm diferentes gamas de cores. Em geral, a proliferação celular maligna foi estimulado devido a factores de crescimento celular, as quais induzem um aumento na densidade das células e componentes de células cancerosas, tais como PLs. Portanto, enquanto a intensidade de todos os

m /z

valores devem ser mais elevada em regiões do cancro, a intensidade de alguns valores (em particular,

m /z

772,5, 782,5 e 848,5) no cancro regiões foi menor.

visualizadas imagens de iões correspondentes aos resultados mostrados na Tabela 1. em todas as imagens, o tecido canceroso está na esquerda e tecido normal é do lado direito. A distribuição da intensidade para cada

m /z

valor não foi constante no câncer e tecido normal da tireóide.

3. Comparação dos resultados em todos os casos

na mesma maneira como o caso 1, colheita de pico e a análise estatística foi realizada em todos os casos. A Tabela 2 mostra os 50 melhores de pico pegando resultados e exclui picos isotópicos. O

m /z

foram excluídos valores que mostram não haver diferenças significativas. Três

m /z

valores *, incluindo

m /z

798,5, 796,5 e 741,5, foram encontrados para ser comum para todos os casos.

O comum

m /z

valores em todos os casos são apresentados na Figura 4. ROIs de cancro e de tecido normal em todos os casos foram descritos nos resultados coradas com HE para todos os casos. A intensidade de quase todos

m /z

valores foi maior na região de cancro, em comparação com a região tiróide normal. Só a distribuição de intensidade de

m /z 741,5

os diferencia dos outros.

O ROI de cada caso é definida por uma linha a tracejado na imagens HE-coloração. A intensidade de todos os valores na região do cancro foi maior do que em regiões normais. A distribuição de intensidade no

m /z

741,5 era diferente da distribuição de intensidade no outro

m /z

valores.

4. Identificação molecular

A análise três comum

m /z

valores em todos os casos, foram submetidos a massa em tandem (MS /MS) para identificar as estruturas dos biomoléculas associadas com os iões de precursor. (Figura 5). O metabolito MS Search (https://www.hmdb.ca/labm/jsp/mlims/MSDbParent.jsp) foi utilizado para referenciar.

Dados (A) MS /MS de

m /z

798,5. Foi analisada a estrutura de um pico. O espectro de ião do produto de

m /z 798,5

como um ião precursor foi obtido por MS /MS da região cancro papilar da tiróide. Este biomolécula foi identificado pela perda neutra [PC (16: 0/18: 1) + K]

+. Do mesmo modo, em (B)

m /z 796,5

foi identificado como [PC (16: 0/18: 2) + K]

+. (C)

m /z

741,5 foi identificado como [SM (d18: 0/16: 1) + K]

+

Em MS /MS para PLs. com catiões, certos picos característicos fragmento são muitas vezes detectados. O pico a

m /z 798,5

(Figura 5A) foi identificado como a fosfatidilcolina (PC), devido à perda neutra de 59 183 Da e durante Da MS /MS, o que é indicativo de PC [14], [ ,,,0],15]. Enquanto isso, a perda neutra de 256 Da correspondeu ácido palmítico. O tipo de catião aduzido a uma biomolécula é geralmente ou um ião de sódio ou potássio, quando a amostra é obtida a partir de tecido biológico. Observou-se uma diferença de 38,0 entre o

m /z 577,5 e 615,5

, o que é consistente com a substituição de um ião de potássio (peso molecular, 39,10) com um protão (peso molecular, 1.01). De acordo com uma pesquisa MS Metabolito, o pico a

m /z 798,5

indica [PC (16: 0/18: 1) + K]

+. Da mesma forma, podemos concluir que

m /z

796,5 correspondeu [PC (16: 0/18: 2) + K]

+ (Figura 5B)

A. resultados de

m /z

741,5 apresentou picos de

m /z

682,4 e 558,4 (Figura 5C). O pico a

m /z 682,4

correspondeu a perda neutra de trimetilamina (59 Da), e o pico a

m /z 577,5

correspondeu a perda neutra de trimetilamina (59 Da) e cyclophosphate (124 Da). O pico em

m /z

184 corresponderam a trimetilamina (59 Da), cyclophosphate (124 Da) e um íon de protões (1 Da). Estes resultados indicaram que

m /z

741,5 continha um fosfocolina de metal alcalino aduto; portanto,

m /z

741,5 era um PC ou esfingomielina (SM) espécies. A aplicação da regra de azoto a fosfolípidos, a massa nominal ímpar indicado SM devido à presença de um átomo de azoto adicional no esfingosina de SM. Concluímos, assim, que

m /z

741,5 era uma espécie SM. A busca metabolito MS fato sugeriu que

m /z

741,5 correspondeu [SM (d18: 0/16: 1) + K].

+

Discussão

para mais de um século, exames patológicos têm sido a principal ferramenta e mais importante para o diagnóstico de regiões cancerosas. classificação de câncer em si foi estabelecida com base nas conclusões de métodos de coloração clássicos, como coloração HE, e tais métodos continuarão a desempenhar um papel preponderante no diagnóstico de câncer. No entanto, as limitações de classificação com base nos resultados de coloração clássicos deve ser observado. É muitas vezes o caso de que os pacientes com o mesmo diagnóstico patológico nem sempre têm o mesmo prognóstico. Os diagnósticos são muitas vezes feitas com base na morfologia. Usando técnicas convencionais patológicos, que só pode efectuar observações morfológicas, e é difícil para revelar os detalhes dos componentes em secções de tecido.

In situ

hibridação e /ou imuno-histoquímica analisa permitir a análise da distribuição de moléculas conhecidas; no entanto, manteve-se impossível para examinar a distribuição de moléculas desconhecidas. Para um diagnóstico detalhado e preciso, é necessário obter informações sobre componentes, tais como proteínas e lipídios específicas em uma amostra.

Como uma técnica importante na era pós-genoma geração proteoma, MS tornou-se amplamente utilizado em numerosos campos médicos para o diagnóstico e tratamento de várias doenças, incluindo câncer. Numerosos novos biomarcadores foram identificadas, até agora, utilizando MS, que já foi expandido para incluir a IMS [11], [16], uma técnica que permite a análise e a visualização da distribuição de biomoléculas individuais em qualquer área de uma secção de tecido [17] . Assim, esta abordagem é potencialmente de grande importância.

Uma sequência IMS cria uma série de espectros. Para obter uma informação válida a partir destes espectros, foi realizada a adição de um ião de aducto. No tecido biológico, lípidos tendem a ser carregado positivamente por um protão, sódio, e um ião de potássio, o que indica que a distribuição do ião positivo influencia a distribuição de lípidos; diferentes valores tendem a ser obtidas nos resultados de análises de IMS. Neste estudo, foram adicionados sal de potássio para a matriz com base em relatórios de Sugiura e co-trabalhadores que analisadas selectivamente PC com composições de ácidos gordos diferentes, a adição de sal de potássio à solução de matriz [18]. Quando adicionado à matriz, a solução de sal de potássio causou uma fusão de vários aductos de iões (aductos com protão, sódio e potássio), em uma espécie potassiated individuais. Esta abordagem permitiu-nos reduzir uma série de picos e tornou mais fácil para identificar moléculas de interesse.

No relatório anterior, demonstramos a viabilidade de IMS como uma ferramenta para a análise de espécimes patológicos [19]. Mostrámos que a IMS pode ser usado ao perfil moléculas biológicas, incluindo os subtipos de PLs. Estamos focados na distribuição de PLs no cancro papilar da tiróide. PLs estão presentes como um constituinte da membrana celular e são também expressas em tecido de cancro. As intensidades de mais

m /z

valores em regiões cancerosas são mais elevados do que aqueles em regiões normais; No entanto, a intensidade de alguns valores (

m /z

772,5, 782,5 e 848,5) em regiões de cancro foi menor do que em regiões de tecidos normais (ver Figura 2 e Tabela 1). Em geral, a proliferação celular maligna foi estimulado devido a factores de crescimento celular, as quais induzem um aumento na densidade das células e componentes de células cancerosas, tais como PLs. PLs são compostas por várias combinações de lípidos, que são com base no seu comprimento, o grau de saciedade cadeia acilo, e o grupo de cabeça polar. A Figura 2 sugere que estas diferenças na intensidade pode surgir a partir da distribuição dos ácidos gordos específicos do cancro da tiróide que são ligados a pls.

No cancro da mama, pls, especialmente PCs, em tecidos de cancro foram referidos como tendo uma nível relativamente alto de ácido linoleico (18: 2) e níveis baixos de ácido esteárico (18: 0) [20] e ácido oleico (18: 1) [21], quando comparado com o tecido normal da mama. Luisa

et al.

Identificou o padrão no padrão e de classe diferenças PL em células de cancro da mama [22]. No seu relatório, as células cancerosas mostrou uma elevada abundância relativa de PC (16: 0/18: 1) e PC (18: 1/18: 1) que corresponde a [MH]

+ a

m /z

760 e 786. para SM, SM (18: 1/16: 0) correspondente a [MH]

+ em

m /z

703 foi detectada principalmente em células cancerosas

Outro relatório anterior mostrou que o mARN de 1-acilglicerol-3-fosfato-o-aciltransferase (AGPAT) 11 que utiliza eficientemente o LPA (18: 1) como um aceitador de acilo e ácido gordo de 18: 1, tal como um dador de acilo é significativamente -regulada no peito humano e câncer cervical [23]. Nossos resultados mostram que o

m /z

798.5 picos contêm gordos C18 ácido: 1, e eles são expressos fortemente em regiões com cancro da tiróide. Enquanto um estudo anterior revelou a selecção de graxos específicos de ligação de ácido PLs, nós fornecemos mais informações sobre as mudanças relativas de PLs no cancro papilar da tiróide.

Na Figura 4, a distribuição da intensidade no

m /Z

741,5 correspondeu [SM (D18: 0/16: 1) + K]

+ e é diferente da distribuição de intensidade nas outras, excepto para o caso 1 e 5. os resultados de coloração HE-mostrou que a área em que

m /z

741,5 intensidade é expressa fortemente consistiu principalmente em regiões do estroma e câncer. Nós relataram que a intensidade da SM era expressa mais elevada nas regiões do estroma e do cancro do que em regiões normais num estudo de metástases do cancro do cólon fígado [19]. O nosso resultado foi consistente com este relatório

estearoil-CoA dessaturase 1 (SCD1) é a enzima limitante da velocidade na síntese celular de ácidos gordos mono-insaturados, incluindo C18:. 1, a partir de ácidos gordos saturados. Falvella

et al.

Informou que SCD1 superexpressão gene está associado a hepatocarcinogênese em ratos [24]. Scaglia

et ai.

Relatado que a inibição da expressão de SCD1 em células de cancro do pulmão humano prejudica a tumorigénese, ao passo que a taxa de apoptose foi elevada [25]. Estes relatórios indicam que SCD1 provoca um aumento no C18:. 1 em tecido de cancro

O tipo de célula de forma influências de ácido gordo e a fluidez da membrana celular [9]. As alterações da fluidez da membrana celular de cancro pode influenciar o comportamento biológico de cancro, tais como invasão /metástase. IMS é a única ferramenta que permite a visualização da ligação de ácidos gordos de PLs em secções de tecido. Recentemente, um número crescente de relatórios centrou-se sobre a relação entre insultos patológicos e PLs, incluindo PCs [26], i.e., a via de remodelação de PLs [27]. Espera-se que a análise IMS ajudará a alcançar uma melhor compreensão da relação entre ácidos graxos e mecanismos de câncer.

Usando IMS, nós diretamente perfilado PC e expressão SM a partir de amostras de tecido. Este perfil exploratório de PL com base na análise IMS forneceu resultados que enfatizam o potencial da IMS para diagnósticos patológicos. O potencial de aplicação de análise IMS no fluxo de trabalho clínico tem sido sugerido em um relatório anterior [28]. Comparado com os métodos convencionais, tais como a esclerose múltipla e imuno-histoquímica, a IMS tem certas vantagens como uma aplicação clínica. Purificação da amostra e extração é necessário antes da análise MS. Além disso, o desempenho de um ensaio à base de anticorpos em imuno-histoquímica é sempre facilmente degradada em alterações observadas na intensidade ou localização. Por outro lado, a análise IMS requer somente um simples de pré-tratamento, isto é, deposição de matriz e que fixa as definições de condições IMS. Isso significa que o tempo não é perdido entre a coleta e análise de amostras. Prevê-se que a IMS será facilmente introduzido na configuração exame patológico.

Estudos recentes forneceram evidências dos benefícios clínicos de análise IMS, ou seja, que seus perfis de discriminar entre outras doenças e câncer de próstata [29] e o estado de HER2 de cancro da mama [30]. Nesses relatórios, a IMS permitiu a classificação das características morfológicas e de diagnóstico. Uma variante recentemente desenvolvida de análise IMS, referido como “espectrometria de massa de imagem alvejado” (TIMS), foi descrito por Thiery e colegas [31]. Tal análise segmentada permitiu a visualização de moléculas de interesse directamente a partir da secção de tecido através da utilização do laser reactivo caudas moleculares fotocliváveis ​​ligados a anticorpos. Esta abordagem fornece quantificação por estimar a intensidade do sinal, e uma excelente relação sinal-ruído nos espectros resultantes. É importante notar que este diagnóstico foi feito em uma seção única amostra; algumas biópsias de câncer estavam disponíveis, e mais seria necessário para quantificar um biomarcador por IHC. No futuro, a análise IMS irá fornecer novos biomarcadores e, por sua vez, novas categorias patológicas, e pode, portanto, tornar-se uma ferramenta de diagnóstico crítico no ambiente clínico.

Materiais e Métodos

declaração Ética

coleta de amostras e arquivamento de dados do paciente foi realizada por meio de consentimento informado, e foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Kyoto. Este estudo foi realizado em conformidade com as orientações Universidade de Kyoto para um manuseamento espécime patológico.

1. Amostra preparação

Sete pacientes japoneses que foram submetidos a tireoidectomia rotina no Hospital Universitário de Kyoto estavam envolvidos no presente estudo. Seis mulheres e um homem foram incluídos e a idade média dos pacientes foi de 52 anos. Não houve recidiva em todos os casos. As amostras foram obtidas a partir de uma seção de cancro da tiróide e tecido normal adjacente imediatamente após a ressecção do tumor. O diagnóstico patológico foi de carcinoma de tireóide papilar. O tecido obtido foi congelado em azoto líquido imediatamente para minimizar a degradação e foi mantida a -80 ° C. As secções de tecido foram cortadas às rodelas com uma espessura de 10 um utilizando um criostato (CM 1950; Leica, Wetzler, Alemanha). Uma seção foi montado em um (ITO) lâmina de vidro de índio-estanho-revestida de óxido de análise IMS. Outra secção adjacente ao utilizado para o IMS foi montado sobre uma lâmina de vidro (revestimento MSC; Matsunami, Osaka, Japão) para coloração HE para identificar regiões normais e do cancro da tiróide

2.. Matriz de deposição

A solução de matriz foi preparada por dissolução de 50 mg de 2, 5-di-hidroxibenzóico ácido (DHB, Bruker Daltonics, Leipzig, Alemanha) em 1 mL de 70% de metanol e acetato de potássio 10 mM. DHB é uma matriz amplamente utilizados para as moléculas de baixo peso molecular. A adição de sal de potássio à solução matriz causou uma fusão de vários adutos de íons em uma espécie potassiated individuais. Esta abordagem permitiu-nos reduzir o número de picos e facilitou a identificação de moléculas de interesse. Uma camada de matriz fina foi aplicado na superfície das secções de tecido, utilizando um bocal de aer�rafo 0,2 mm (Procon Menino FWA platina; Sr. passatempo, Tóquio, Japão) mantida a 15 cm da superfície do tecido. A quantidade total de solução de matriz em cada slide foi de 1 mL. A técnica de pulverização habilitado cobertura matriz completa sobre a superfície do tecido inteiro e facilitou a co-cristalização da matriz e biomoléculas.

3. Imagiologia análise de espectrometria de massa

As secções de tecido foram analisados ​​usando um assistida por matriz dessorção /ionização por laser-time-of-flight /time-of-flight (MALDI-TOF /TOF) -tipo instrumento, Ultraflex II TOF /TOF (Bruker Daltonics), que estava equipado com um 355-nm laser Nd: YAG a 200 Hz repetição. Os dados foram adquiridos no modo de ião positivo usando um método de calibração externa com íons de DHB, a angiotensina II e bradicinina. Os seus produtos de decomposição coberto de

m /z 100 a 1200.

proteínas de calibração foram depositadas sobre as superfícies de materiais de amostra. Cada pesquisa de rastreio foi realizado automaticamente nas regiões de cancro e de tecido normal. O intervalo de tempo entre pontos de dados foi de 100 mícrons, e 100 de laser disparos de feixe foram irradiadas em cada ponto de dados. Os parâmetros de espectrometria de massa foram optimizados manualmente para se obter a mais alta sensibilidade com

m /z

valores na gama de 400-900. Todos os espectros foram adquiridos automaticamente usando flexImaging 2.1 software (Bruker Daltonics), eo formato de arquivo foi convertido para permitir a análise com Biomap (https://www.maldi-msi.org) e SIMtools software (in-house software; Shimadzu Corporation) . A imagem ion foi visualizada usando software Biomap.

4. Comparação das intensidades de sinal entre o cancro e as regiões da tireóide normais

resultados da análise IMS foram integrados, eo ROI em câncer e os tecidos normais da tireóide foram definidas em função HE resultados usando software SIMtools. Os 50 melhores picos excluindo picos isotópicos foram retiradas do ROI que foi definido como o cancro e região tireoidiana normal, ea diferença estatística foi determinada por Welch t-teste. Diferenças com p 0,01 foram considerados significativos

5.. Comparação dos resultados para todos os casos

Realizamos IMS e análise estatística em todos os casos, e pegou o

m /z

valor que tinha expressão significativamente maior nas regiões câncer e era comum em todos os casos.

6. identificação molecular

m /z

valores comuns em todos os casos foram empregados para análise MS /MS para a identificação molécula. A análise por MS /MS foi realizada em secções de tecido, no modo de ião positivo usando Qstar Elite (Applied Biosystems /MDS Sciex, Foster City, CA, EUA), um espectrómetro de massa de quadrupolo /TOF híbrido equipado com uma fonte MALDI ortogonal e um laser de Nd pulsado : YAG. Metabolito procura MS foi utilizada para determinar as espécies moleculares de PLs. A solução de matriz foi preparado da mesma maneira que para a análise de IMS. Os parâmetros de espectrometria de massa foram optimizados manualmente para se obter a mais alta sensibilidade com os valores m /z na gama de 100-850.