Abstract

TP53 é o gene mais comumente mutado em câncer de cabeça e pescoço (CECP), com mutações sendo associada à resistência à terapia convencional. A restauração da função de p53 normal, foi anteriormente investigado através da utilização de RITA (reactivação de p53 e a indução de apoptose de células de tumor), uma pequena molécula que induz uma alteração conformacional na p53, levando à activação dos seus alvos a jusante. No presente estudo verificou-se que RITA fato exerce efeitos significativos nas células CECP. No entanto, neste modelo, verificou-se que um resultado significativo do tratamento RITA foi acelerada senescência. senescência RITA-induzida em uma variedade de origens, incluindo p53 células p53 nulo. Além disso, a inibição da expressão de p53 não parecem inibir significativamente a senescência induzida por RITA. Assim, este fenômeno parece ser parcialmente independente de p53. Além disso, a senescência induzida por RITA parece ser parcialmente mediada pela activação da resposta a danos no ADN e SIRT1 (informações silenciosa regulador T1) inibição, com um efeito sinérgico visto através da combinação de qualquer radiação ionizante ou a inibição SIRT1 tratamento com RITA. Estes dados apontam para um novo mecanismo de função RITA, bem como indício da sua eventual benefício terapêutico em HNSCC

Citation:. Chuang HC, Yang LP, Fitzgerald AL, Osman A, Woo SH, Myers JN, et al . (2014) O p53-Reativando pequena molécula RITA induz senescência em células de cabeça e pescoço. PLoS ONE 9 (8): e104821. doi: 10.1371 /journal.pone.0104821

editor: Arianna L. Kim, Columbia University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de abril de 2014; Aceito: 16 de julho de 2014; Publicação: 13 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chuang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Universidade do Texas MD Anderson Cabeça e Prêmio de Desenvolvimento de pescoço do cancro SPORE Carreira (HS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

As mutações no

TP53 Quais são uma alteração genética comum presente em muitos tipos de tumor sólido, incluindo cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (CECP) [1], [2]. O nosso grupo e outros mostraram que

TP53

mutações estão associadas com o aumento da resistência à radioterapia e quimioterapia em linhas celulares HNSCC

in vitro Comprar e com maus resultados em pacientes com CECP [3] – [5 ]. Infelizmente, as estratégias terapêuticas para re-introduzir p53 de tipo selvagem (wt) em tumores têm sido um desafio logístico [6], e, assim, as estratégias têm sido exploradas para a re-activação de p53 endógena terapêutico em vez [7] – [10]. Um composto de interesse, RITA (reactivação de p53 e a indução de apoptose de células de tumor), é uma molécula pequena que se liga ao terminal-N da proteína p53 e induz uma alteração conformacional que pode conduzir à restauração da função de p53 normal, [11] , [12]. RITA pode activar p53 alvos a jusante, tanto em peso p53 [13], [14] e p53 mutante (mt) células [15] numa variedade de modelos.

RITA é pensado para actuam principalmente através da indução de apoptose , e na verdade, RITA, sozinho ou em combinação com cisplatina, pode induzir a apoptose em muitas linhas de células de carcinoma epidermóide [16], [17]. No entanto, este efeito não é universal. As linhas celulares que expressam p53 wt, mas não sofrem apoptose em resposta ao tratamento RITA incluem a linha de células de carcinoma epidermóide JHU-028 [17], a linha celular de osteossarcoma humano SJSA e a linha celular de carcinoma do cólon humano RKO [18].

a apoptose não é o único destino celular após activação de p53. Numerosos estudos demonstram que a activação de p53 em resposta a uma variedade de estímulos nas células cancerosas conduz a senescência acelerada [7]. Embora o resultado final da célula após a sua entrada senescência é claro, vários estudos ligaram a indução da senescência com resposta a agentes terapêuticos. Temos observado que a radiação [3] e cisplatina [4] inibiu o crescimento celular através da indução da senescência em células p53 wt CECP. Consistente com esta observação, as células que expressam CECP mt p53 foi encontrado para ser resistente à radiação ou a cisplatina, em grande parte devido à ausência de uma resposta a senescência. Nós ainda observado que muitas destas mesmas linhas de células são também resistentes à apoptose induzida pela terapia [3], [4]. Assim, pelo menos neste modelo, a indução da senescência parece reflectir um resultado do tratamento favorável.

O objectivo deste estudo foi determinar o efeito sobre a sobrevivência de RITA, proliferação e indução da senescência em vários humano HNSCC linhas de celular. Nós ainda procurou compreender os mecanismos pelos quais ocorrem estes efeitos.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

As linhas de células de carcinoma epidermóide utilizados neste estudo estavam presentes generosos do Dr. Jeffrey Myers (Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center e foram anteriormente caracterizados [19]. HN30 e linhas de células HN31 foram derivados a partir de um tumor primário e da linfa metástases nodais de carcinoma de células escamosas da faringe, respectivamente. toda a exome destas duas linhas celulares foi sequenciado para um projecto distinto e, com a excepção de TP53, não se observaram outras mutações discordantes entre as duas linhas celulares. a linha de células PCI-13 foi derivado de um carcinoma de células escamosas da cavidade oral. Todas as linhas celulares foram mantidas em Dulbecco meio de Eagle modificado contendo 10% de soro de bovino, penicilina /estreptomicina, glutamina, piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais fetais e vitaminas. as técnicas para bater de forma estável para baixo p53 em células HN30 (que têm p53 wt) e células HN31 (que têm mt p53) são descrito noutro local [3]. PCI-13 células, que não têm p53 endógeno, foram manipuladas para expressar

TP53

construções superexpressão (p53 wt, A161S, G245D), que foram gerados e inserido num vector retroviral pBabe contendo uma inserção de puromicina-resistência ( pBABE-puro; Addgene) usando técnicas de clonagem convencionais. As células HN31 foram transfectadas com ARN curto-hairpin (shRNA) específico para SIRT-1 (informações silenciosa regulador T1) ou controlo scrambled shRNA através de vectores lentivirais que contêm o gene da puromicina-resistência da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), de acordo com o as instruções do fabricante. células de controlo transfectadas-lentivirais (HN31-C2) e sua shRNA, estável homólogo SIRT-1-knockdown (HN31-S19) foram isolados por immunoblotting após clones foram rastreados. β-actina foi utilizado como um controlo de carga interna.

Antibodies and immunoblotting

Proteína e os níveis de expressão de proteínas fosforiladas foram avaliadas por imunotransferência de lisados ​​de células inteiras a partir de células tratadas ou não tratadas com RITA. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: p53 (DO-1) e fosfo-serina 15 de p53 a partir de Santa Cruz Biotechnology; p21 de Calbiochem; p-p53 (Ser-15), modulador regulada por p53 da apoptose (PUMA), murino duplo minuto2 (MDM2), quinase checkpoint 2 (Chk2), fosforilada Chk2 (p-Chk2, Thr68), SIRT1, e β-actina de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). De cabra anti-ratinho e anti-coelho de anticorpos secundário conjugado com peroxidase de rábano foram adquiridos a partir de Cell Signaling e Santa Cruz Biotechnology, respectivamente.

Reagentes

RITA foi adquirido a partir de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI ) e o inibidor de proteína quinase estaurosporina foi adquirido de Sigma (St Louis, MO). O inibidor SIRT1 Tenovin-6 foi obtido a partir de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX). RITA foi dissolvido em 100% de dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração de estoque de 50 mM e armazenado como alíquotas até à sua utilização. Estaurosporina e Tenovin-6 foram dissolvidos em 100% de DMSO e água, respectivamente, para concentrações de estoque de 1 M e armazenado como alíquotas até à sua utilização.

ensaios de supressão de crescimento

O ensaio de viabilidade celular foi descrito previamente [20]. Resumidamente, 2000 células /poço foram semeadas em placas de 96 cavidades, tratado com várias concentrações de RITA de até 72 horas, e a viabilidade foi avaliada com um ensaio MTT. Para o ensaio de colónias de formação [3], células CECP foram semeadas em placas de 6 poços por 24 horas, tratada com RITA, e cultivadas durante 10-14 dias. As células foram fixadas em solução de formalina /10% de violeta de 3% de cristal e as colónias contendo mais de 50 células foram contadas com o software ImageJ.

Senescence-associated- β-galactosidase coloração

Senescence-associado de p-galactosidase (SA-β-gal) a coloração foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (Cell Signaling Technology). Resumidamente, as células CECP foram plaqueadas em placas de 6 poços e tratadas com RITA a várias concentrações durante vários tempos (geralmente 5 dias), após o que as células foram fixadas durante 10 minutos e coradas para a actividade de SA-β-gal durante a noite a 37 ° C. Achatado e células azul-de coloração foram classificados como senescentes e relatado como uma percentagem de todas as células observadas por campo de alta potência.

Análise estatística

Os dados foram agrupados para análise de vários experimentos independentes, e ensaios à base de células foram realizadas em triplicado. Dois-atado Estudante de

t

testes foram utilizados para avaliar as diferenças em senescência e para outras comparações de grupos desemparelhados. Para todas as comparações,

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Efeitos de RITA de p53 e proteínas associadas a p53

Nós utilizados. um par de linhas de células de carcinoma epidermóide isogénica, com um peso de p53 (HN30) e a outra com mt p53 (HN31), para testar o efeito de RITA sobre a expressão e a fosforilação da p53 e outras proteínas relacionadas. RITA induziram fortemente a fosforilação das proteínas p53 e p21, após 12 horas em células HN30 e depois de 24 horas de células HN31 (Fig. 1a). Os níveis de proteína PUMA também foram elevados após 24 horas de exposição ao RITA em ambas as linhas celulares. Os aumentos na expressão de p53, a fosforilação da p53 e a expressão PUMA às 24 horas eram todos dependente da dose (Fig. 1B). Estes resultados indicam que pode activar RITA alvos a jusante de sinalização de p53 nestas linhas celulares isogénicas com p53 em peso ou MT.

(A e B) HN30 (p53 de tipo selvagem) e HN31 (p53 mutado) de cabeça e pescoço as células cancerosas foram tratados com RITA durante os tempos indicados (a) e (B) as doses e a expressão de p53 e os seus alvos foram avaliadas por imunotransferência. (C) As células foram tratadas com RITA (0,1 pM-20 uM) durante 72 horas e avaliadas através do ensaio de MTT. Os dados são expressos como média ± S.E. de três experiências. (D) células HN30 e HN31 foram tratados com RITA nas doses indicadas durante 10-14 dias, após o que as colónias foram fixadas, coradas, e quantificadas. Imagens representativas de três experimentos com resultados semelhantes são mostrados. Os dados quantitativos foram expressos como média ± S.E. de três experiências. * – Indica p 0,05 versus controlo não tratada

RITA inibe o crescimento de linhas de cabeça e de células do cancro do pescoço

Vários estudos têm que RITA pode induzir a morte de células tumorais [15], [. ,,,0],18]. Inicialmente, testámos se RITA pode suprimir o crescimento de células HN30 e HN31. Utilizando um ensaio de proliferação de células de curta duração, observou-se que RITA, em concentrações superiores a 5? M, a supressão do crescimento modesto induzida em ambas as células HN30 HN31 e após 72 horas de tratamento contínuo (Fig. 1C). Num ensaio de formação de colónias de mais longo prazo, RITA foi encontrada para reduzir significativamente o número de colónias formadas por ambas as linhas de células em todas as doses testadas (P 0,05). (Fig. 1D)

RITA induz senescência em cabeça e linhas celulares de cancro do pescoço

Nós já mostrou que o modo dominante de resposta a qualquer concentrações fisiologicamente relevantes da cisplatina [4] ou doses padrão de radiação [3] no tipo selvagem linhas celulares HNSCC p53 não é apoptose. Do mesmo modo, no modelo actual, mínimo de caspase e clivagem PARP foi observada após a exposição a RITA (Fig. 2A). Assim, para testar a hipótese de que a resposta anti-proliferativa observada de células HN30 HN31 e a RITA foi, pelo menos parcialmente devido à indução da senescência, analisou-se a actividade SA-β-gal, um marcador de senescência celular. Descobrimos que RITA afectada morfologia celular e aumentou significativamente a coloração SA-β-Gal de um modo dependente da dose em ambas as linhas celulares (p 0,05; Fig. 2B), indicando que o tratamento RITA levou a senescência acelerada nestas linhas celulares isogénicas.

(a) PARP e clivagem caspase 3 foram examinados através de western blot após a exposição das células a RITA a 1 mM para os períodos indicados. P, estaurosporina (1 uM durante 8 horas) foi usada como um controlo positivo. (B) As células HN31 HN30 e semeadas em placas de 6 poços de cultura de tecidos foram tratadas com as concentrações indicadas de RITA, durante 5 dias, após o que as células foram fixadas e coradas para associada à senescência -β-galactosidase (SA-gal-β) actividade . Imagens representativas de três experimentos com resultados semelhantes são mostrados. Em cada poço tratado ou não tratado, cinco selecções aleatórias de campo foram feitas e o número de células com morfologia senescentes e com coloração com azul foram contados sob ampliação de 20x (Olympus IX71). * – Indica p 0,05 versus controlo não tratada

estado de p53 e inibição do crescimento RITA mediada em linhas de células de carcinoma epidermóide

Em seguida, para investigar se a senescência induzida por RITA depende do estado p53. , que as linhas de células tratadas-estável-p53-knockdown HN30 HN31 e shp53-shp53 com RITA e descobriram que knockdown da expressão da proteína p53 marcadamente reduzida tanto a expressão e a fosforilação da p53 (Fig. 3). No entanto, a expressão da p21 de linha de base foi inalterada nas células HN30 (wt p53) (Fig. 3A). Descobrimos ainda que a inibição de p53 tinha apenas um efeito parcial de emergência sobre a inibição do crescimento induzida por RITA e a formação de colónias em células HN30, e não teve nenhum efeito significativo sobre salvamento células HN31 (Fig. 3B). Além disso, p53 knockdown não afetou a senescência induzida por RITA em qualquer tipo de células knockdown-p53 (Fig. 3C).

(A) Os níveis de p53 total e fosforilada e p21 foram medidos em HN30 e HN31 lentiviral- as células de controlo e o seu ARN curto-gancho de cabelo, o p53-estável-knockdown homólogos transfectadas após o tratamento com um RITA uM durante 72 horas. β-actina foi utilizado como um controlo de carga interna. (B) HN30 HN31 e as células de controlo transfectadas com lentivírus e os seus homólogos de p53-estável-knockdown foram tratados com RITA nas doses indicadas durante 10-14 dias, após o que as colónias foram fixadas, coradas e quantificados. Imagens representativas de três experimentos com resultados semelhantes são mostrados. Os dados quantitativos foram expressos como média ± S.E. de três experiências. Em todas as linhas celulares de controlo (e sh53), o tratamento levou a RITA significativamente (p 0,05) diminuição da formação de colónias em todas as doses testadas. as células de controlo transfectadas com lentivirais (C) e HN30 HN31 e os seus homólogos de p53-estável-knockdown foram semeadas em placas de 6 poços de cultura de tecidos e tratados com as concentrações indicadas de RITA, durante 5 dias, após o que as células foram fixadas e coradas para a senescência -β-galactosidase associada (SA-β-gal). Imagens representativas de três experimentos com resultados semelhantes são mostrados. Com a excepção de 0,1 uM em HN30-shp53, todas as doses de RITA em todas as linhas celulares aumentaram significativamente (p 0,05) aumento SA-β-gal em comparação com controlo não tratado. Não foram observadas diferenças significativas entre o controle e shp53 em qualquer linha de células.

Em seguida, testaram se a reconstituição das proteínas p53 e p53 wt mt em células PCI-13 p53 iria conferir susceptibilidade para RITA. Para estas experiências, pBabe (controlo de vector), p53 em peso, e as A161S e construções de p53 mutantes G245D foram re-introduzidos na pci-13 células para produzir o PCI-13-pBABE, PCI-13-WT, PCI-13-A161S e linhas de células PCI-13-G245D. Em contraste com as células p53-positiva, p53 e p53 fosforilado não foram detectadas nas células de controlo pBabe PCI-13 (Fig. 4a). Além disso, a p21 foi expressa apenas pelo peso e células que expressam de uma das células que expressam p53 MT (PCI-13-A161S). As células

(A) PCI-13 (p53 nulo) que expressam o controlo vector ou as construções de p53 indicados foram tratados com RITA 2,5 uM durante 72 horas, após o que os lisados ​​de proteína foram preparados e os níveis de p53 total e fosforilada e p21 foram avaliadas por transferência de western. β-actina foi utilizado como um controlo de carga interna. (B) PCI-13 as células que expressam as construções indicadas foram semeadas em placas de 6 poços, tratadas com RITA nas concentrações indicadas, e contaram-se num ensaio clonogénico. Com a excepção das células tratadas pBABE a 0,25 uM, todas as linhas de células em todas as concentrações testadas de RITA exibiu diminuiu significativamente a formação de colónias em comparação com o controlo não tratado (p 0,05). (C) As células PCI-13 que expressam as construções indicadas foram semeadas em placas de 6 poços de cultura de tecidos e tratados com 0,25 uM de RITA, após o que as células foram fixadas e coradas para a associada a senescência -β-galactosidase (SA-gal-β) actividade . Imagens representativas de três experimentos com resultados semelhantes são mostrados. Todas as linhas celulares exibiram um aumento significativo coloração SA-β-gal comparação com o controlo não tratado (p 0,05).

A longo prazo ensaio de formação de colónia (Fig. 4B) e SA-β-Gal coloração (Fig. 4C) mostrou que o crescimento RITA celular significativamente inibida e senescência induzida em todas as linhas de células PCI-13, independentemente do estado de p53, incluindo a linha parental p53 nulo (p 0,05). Assim, a presença da proteína p53 não parecem ser necessárias para RITA para exercer os seus efeitos.

resposta a danos no ADN induzida por RITA em linhas de células de carcinoma epidermóide está associada com regulação negativa SIRT1

é RITA também conhecida por induzir a resposta a danos no ADN [21], [22]. Ponto de verificação quinase 2 (Chk2) é um alvo a jusante importante da resposta a danos no ADN e conduz a paragem do ciclo celular, apoptose, ou senescência. Notavelmente, Chk2 activado pode induzir a senescência independente de p53 em células de câncer [23], [24]. Estes resultados, com a nossa conclusão de que RITA inibe o crescimento de células de carcinoma epidermóide e pode induzir a senescência, mesmo na ausência da p53, levou-nos a investigar o efeito da expressão em RITA Chk2 e estado de fosforilação. Descobrimos que a proteína Chk2 foi fosforilada em seu local de ativação, Thr68, após a exposição a RITA em HN30, HN31 e as células 13 PCI-, independentemente do status de p53 (Fig. 5A).

(A) HN30 ou HN31 As células transfectadas com controlo de lentivírus ou ARN curto-gancho de cabelo, as construções de p53-estável-knockdown foram tratadas com 1 uM RITA 1 durante 72 horas, após o que os lisados ​​de proteína foram preparados e os níveis de total e fosforilada Chk2 avaliada por imunotransf erência. Direita: PCI-13 células transfectadas com as construções indicadas foram tratados com 2,5 mM durante vários períodos de RITA, após o que os lisados ​​de proteína foram preparados e os níveis de total e fosforilada Chk2 foram avaliadas. (B) HN30, HN31, e PCI-13 células com as construções p53 indicados foram tratados com RITA para os períodos indicados, e os lisados ​​foram avaliados para a expressão da proteína SIRT1 por western blot. β-actina foi utilizado como um controlo de carga interna. células (C) HN31 estavelmente transduzidas com vectores lentivirais de controlo (C) ou SIRT1 shRNA (S) foram inicialmente testados para a inibição da expressão SIRT-1. Os clones representativos foram então tratadas com 2,5 uM RITA durante 72 horas, após o que as proteínas indicados foram extraídos e analisados ​​por transferência de Western. células (D) HN31 estavelmente transduzidas com vectores de controlo lentivirais (C2) ou SIRT1 shRNA (S19) foram semeadas em placas de cultura de tecidos de 6 poços e tratadas com as concentrações indicadas de RITA, durante 5 dias, após o que as células foram fixadas e coradas para a senescência atividade -β-galactosidase (SA-β-gal) -associated. Imagens representativas de três experimentos com resultados semelhantes são mostrados. * – Indica aumentou significativamente em relação ao controle do vetor na dose indicada (p 0,05). células (E) HN31 foram semeadas em placas de 6 poços e tratadas com RITA (0,25 M) com ou sem Tenovin 6 (0,125 ou 0,25 uM) durante 10 dias, após o que as colónias foram fixadas, coradas e quantificados. * – Indica significativamente diminuída em comparação com 6 Tenovin grupo sozinho na dose indicada. Os dados são normalizados para nem as condições do veículo apenas ou tratamento RITA. Imagens representativas de três experimentos com resultados semelhantes são mostrados. Os dados estão expressos como médias ± DP de três experiências.

Em seguida, como Chk2 parece activar a senescência celular por inibição SIRT1 [25], e porque knockdown ou inibição da actividade SIRT1 também pode induzir a senescência semelhante a paragem do crescimento na ausência da p53 funcional [26] – [28], avaliou-se a expressão SIRT1 e descobriram que RITA levou à diminuição da expressão SIRT1 em todas as linhas celulares avaliadas, independentemente do estado de p53 (Fig 5B).

Para testar este efeito ainda mais, avaliou-se o esgotamento de SIRT1 por shRNA iria aumentar o efeito biológico de RITA. Descobrimos que a inibição mediada por shRNA de SIRT1 diminuiu os níveis de proteína SIRT1 e o aumento dos níveis Chk2 fosforilados após a exposição ao RITA (Fig. 5C). Além disso, o tratamento RITA substancialmente aumentada coloração SA-β-Gal em células HN31-S19 (SIRT1-knockdown) em comparação com células HN31-C2 (controlo-transfectadas) (Fig. 5D). Finalmente, a combinação de RITA e o inibidor SIRT1 Tenovin 6 produziu um crescimento celular efeito sinérgico de inibição (Fig. 5E). Colectivamente, estes resultados sugerem que RITA pode inibir a expressão de SIRT1 e que este efeito contribui para a senescência induzida por RITA.

RITA aumenta radiossensibilidade do mutante p53-expressão HNSCC

Com base no nosso achado anterior que radiossensibilidade em células de CECP está fortemente relacionada com a sua capacidade de sofrer senescência após a irradiação, especificamente que HN31 células mt p53 são radioresistente e têm baixos níveis de senescência induzida por radiação, e os nossos resultados atuais que RITA diminuição da viabilidade e aumentou a senescência em células HN31, investigámos se RITA poderia actuar como um radiossensibilizador. Descobrimos que o tratamento prévio de células HN31 com RITA durante 24 horas, seguido por irradiação resultou na inibição sinérgica do crescimento celular, ao comparar o IC80 (Fig. 6A). Especificamente, o índice de combinatória mutuamente não exclusiva (CI) foi calculada utilizando o método de Chou Talalay [29]. A combinação de RITA e radiação resultou em um IC de 0,50, com um IC de menos do que 1, indicando sinergia.

células HN31 (A) foram colocadas em placas a 1000 células /poço em placas de 6 poços, tratadas com RITA durante 24 horas, e tratou-se com 2 Gy de radiação. Números de colónias foram contadas e usadas para calcular a fracção sobrevivente. Os resultados são apresentados como um isobolograma padrão, com a linha a cheio que representam um efeito aditivo e os pontos que representam a dose que resulta em 80% de inibição (IC80) (B) Mecanismo de acção de RITA proposto no contexto dos diferentes estado de mutação da p53.

Discussão

Nós encontrados no presente estudo que RITA poderia inibir o crescimento e induzir a senescência em células CECP, mesmo na ausência de p53 ou no contexto do esgotamento da expressão da p53, e que este fenómeno foi associado com o aumento da activação e Chk2 depende, pelo menos em parte, em SIRT1. Estas descobertas estão em contraste com os estudos anteriores que mostraram que as funções de RITA principalmente através da indução de apoptose através da activação de sinalização de p53; Em vez disso, os nossos resultados indicam que RITA pode levar a senescência em células CECP entre outros efeitos e não é inteiramente dependente da expressão de p53.

Embora muitas das vias envolvidas na senescência são mediados por p53, em particular no contexto de fosforilação de p53, senescência também pode ocorrer na ausência desta proteína, sugerindo que os mecanismos independentes da p53 também pode mediar a senescência induzida pela terapia das células tumorais [30] – [34]. Por exemplo, a doxorrubicina foi mostrado para induzir um fenótipo senescente em células Saos-2 sem p53, em SW480 e células U251 que expressam o mutante p53, e em células HeLa e células HEp-2 linhas de células, em que a função de p53 foi inibida [35 ].

Outros grupos relataram que RITA não só pode induzir a p53 mas também induzir uma resposta concomitante danos no ADN [21], [22]. O DNA danos resposta envolve duas principais vias de sinalização, o sensor de quinases ataxia telangiectasia mutado (ATM) e ataxia telangiectasia e relacionados com Rad3 (ATR). Estas quinases activar as cinases efectoras a jusante Chk2 e Chk1. Chk2 pode provocar envelhecimento replicativo via p53 /p21 ou outras vias em resposta à disfunção dos telômeros e danos no DNA [36]. Recentemente, foi mostrado Chk2 para modular a resposta celular ao RITA [22]. As nossas descobertas de que o tratamento RITA solicitado um aumento na fosforilação Chk2 independentemente do estado de p53 são consistentes com esta observação (Fig. 5).

Sob condições de stress celular ou danos no DNA, activação Chk2 pode conduzir a uma redução na SIRT1 expressão e senescência [25]. SIRT1 é uma desacetilase de histona altamente conservada que é conhecido por mediar metabolismo celular, envelhecimento, e resposta ao estresse [37]. A sobre-expressão de SIRT1 foi mostrado para inibir a senescência celular numa variedade de malignidades diferentes [38]. Além disso, a SIRT1 é sobre-expresso em células quimiorresistentes, e inibindo SIRT1 pode suprimir o crescimento do tumor em alguns modelos de [27], [38] – [40]. De fato, no presente estudo, descobrimos que RITA inibida expressão SIRT1 em todas as linhas celulares testadas, independentemente do status de p53 (Fig. 5B). Além disso, o tratamento com um inibidor de SIRT1 ou SIRT1-específica shRNA conduziu a diminuições no crescimento e aumento da senescência em conjunto com o tratamento RITA. Embora a inibição da SIRT1 é pensado para induzir a senescência principalmente por interacção com p53, pelo menos, um grupo mostrou que a doxorrubicina pode induzir a senescência em células SCC que carecem de p53 através da inibição da SIRT1 [26]. Além disso, um grupo relatou que a inibição da SIRT1 pode induzir a senescência nos H1299 (p53 nulo) através de diminuição da actividade na sinalização de Ras /MAPK. Estas observações podem fornecer um link para os efeitos observados de RITA, mesmo em células CECP falta de proteína p53. Com base nos nossos resultados do estudo atual, bem como o trabalho dos outros, propomos que RITA induz a paragem do crescimento e senescência em pelo menos duas vias diferentes (Fig. 6B). Em células p53-competente, RITA provavelmente actua principalmente através alvos p53 canónicos, o qual é o efeito dominante do fármaco. O resultado final desta activação pode ser ou apoptose ou senescência, dependendo do contexto. Por outro lado, um, mas ainda menor efeito significativo na viabilidade das células é observada em linhas de células de p53 defeituosa. No entanto, na ausência da p53 funcional, ou qualquer proteína p53, RITA parece exercer, pelo menos, alguns dos seus efeitos através da activação da resposta a danos no ADN e inibição da expressão de SIRT1. A natureza exacta desta dupla função vai necessitar de mais estudo.

anteriormente resposta à cisplatina e radioterapia, com a indução da senescência ligada, mostrando que as células que são mais resistentes a estes medicamentos são também resistentes à indução da senescência [3 ], [4]. Embora a conveniência de senescência induzida pela terapia, como resposta às terapias clinicamente utilizado é um assunto de debate significativa [41], para tipos de células que são altamente resistentes a outras formas de morte celular ou de detenção, a senescência pode ser um resultado terapêutico alternativo. A nossa descoberta de que doses baixas de RITA (0,1-0,5) poderia sensibilizar selectivamente células CECP altamente resistentes à terapia in vitro [3] sugere que a adição de RITA pode vir a ser uma estratégia viável para sensibilizar tumores à radiação, o tratamento mais usado para CECP.

Reconhecimentos

gostaríamos de agradecer Mei Zhao por sua valiosa assistência técnica.