Abstract

O câncer de pulmão é a principal causa de morte por câncer em todo o mundo. Várias alterações no metabolismo do ARN foram encontrados em células de cancro de pulmão; isto sugere que as moléculas relacionadas com o metabolismo de RNA estão envolvidos no desenvolvimento desta patologia. Neste estudo, que procurou por genes relacionados com o metabolismo de ARN que exibem diferentes níveis de expressão entre os tecidos pulmonares normais e tumorais. Foram identificados oito genes diferencialmente expressos em conjuntos de dados de microarray de adenocarcinoma de pulmão. Destes, sete eram sobre-regulada enquanto um foi regulada para baixo. Curiosamente, a maioria destes genes não tivessem sido previamente associado com o cancro do pulmão. Estes genes desempenham diversos papéis no metabolismo do mRNA: três estão associados com o spliceosome (ASCL3L1, SNRPB e SNRPE), enquanto outros participam nos processos de RNA relacionados, como a tradução (MARS e MRPL3), estabilidade do mRNA (PCBPC1), transportes mRNA (RAE ), ou de edição de mRNA (ADAR2, também conhecido como ADARB1). Além disso, encontramos uma alta incidência de perda de heterozigosidade em 21q22.3 cromossomo, onde o locus ADAR2 está localizado, em linhas celulares de NSCLC e tecidos primários, sugerindo que a regulação negativa da ADAR2 no cancro do pulmão está associado a perdas genéticas específicas. Finalmente, em uma série de pacientes de adenocarcinoma, a expressão de cinco dos genes desregulados (ADAR2, MARS, RAE, SNRPB e SNRPE) correlacionada com o prognóstico. Tomados em conjunto, estes resultados suportam a hipótese de que as mudanças no metabolismo de RNA estão envolvidos na patogênese do câncer de pulmão, e identificar novos alvos potenciais para o tratamento desta doença

Citation:. Valles I, Pajares MJ, Segura V , Guruceaga E, Gomez-Roman J, Blanco D, et al. (2012) Identificação de genes desregulados Novel RNA Metabolism-relacionadas em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 7 (8): e42086. doi: 10.1371 /journal.pone.0042086

Autor: Stefan Maas, da Universidade Lehigh, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de março de 2012; Aceito: 02 de julho de 2012; Publicação: 02 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Valles et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho tem sido apoiada por “projeto UTE CIMA”; Governo espanhol (ISCIII452RTICC RD06 /0020/0066, PI02 /1116 e PI10 /00166), o Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) “Una manera de hacer Europa”. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pulmão é um dos cânceres humanos mais comuns e uma das principais causas de morte por câncer em todo o mundo [1], [2]. Ele inclui dois principais subtipos histológicos, cancro do pulmão de pequenas células (SCLC) e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), e este último é responsável por 80-85% de todos os casos. O cancro do pulmão é frequentemente detectada em um estágio avançado, altura em que a doença é quase incurável. Melhor caracterização das alterações biológicas associadas com a sua patogênese poderia ajudar a identificar novos biomarcadores para o diagnóstico precoce e novos alvos para terapias mais eficazes.

O splicing alternativo é um processo biológico essencial para a diversidade de proteínas. Através de splicing alternativo, múltiplos transcritos são gerados a partir de um único precursor de ARNm. Alterações na união alternativa tem sido demonstrada estar associada com várias doenças, incluindo cancro. Vários produtos de genes de splicing alternativo têm sido associados ao desenvolvimento de doenças neoplásicas [3]. variantes de processamento associados ao câncer podem potencialmente servir como ferramentas de diagnóstico e prognóstico, bem como alvos terapêuticos no câncer [4]. No cancro do pulmão, muitas alterações de splicing foram anteriormente descritas nos processos relacionados com o cancro, tais como o crescimento de células, do controlo do ciclo celular, apoptose, angiogénese ou [5] – [9]. Por exemplo, níveis elevados da variante anti-apoptótica de Bcl-xL foram relatados para contribuir para a progressão do tumor em ambos SCLC NSCLC e [10], [11]. Recentemente, mudanças de emenda que afetaram transcrições de VEGFA, MACF1, APP, e NUMB foram demonstrados em pacientes com adenocarcinoma de pulmão [9]. Além disso, foi mostrada a expressão de uma isoforma específica de INSENSIBILIZADO em amostras de tumores para promover a proliferação celular [9]. Além disso, a modulação da caspase 9 splicing alternativo, foi demonstrado que afecta a sensibilidade de células NSCLC de alguns agentes quimioterapêuticos [12].

Os mecanismos subjacentes de processamento alternativo aberrantes em cancro do pulmão permanecem pouco compreendidos. Em alguns casos, as mutações em elementos de regulação de splicing no interior da sequência de nucleótidos do gene resultam em modificações na selecção de local de splicing, por sua vez, conduz a transcritos de splicing alternativo [13]. Em outros casos, as alterações em proteínas relacionadas com o ARNm-metabolismo são responsáveis ​​pelos padrões de splicing anormais. Alguns estudos reportaram alterações na concentração, a localização, a composição ou a actividade de diversas proteínas de ligação a ARN em cancro do pulmão [14] – [19], o que sugere que esta via é frequentemente alterada e é importante para a transformação maligna. O RNA ligação às proteínas SF2 /ASF é overexpressed em tumores NSCLC e promove a sobrevivência através do reforço da expressão survivin [18]. Os estudos em modelos animais sugerem que a alteração do equilíbrio entre diferentes proteínas de ligação a ARN contribui para a carcinogénese pulmonar [20], [21]. No entanto, a caracterização do repertório de RNA moléculas relacionadas com o metabolismo envolvidos no cancro do pulmão é atualmente incompleto e mais estudos são necessários.

Neste estudo, buscamos identificar novos RNA genes relacionados com o metabolismo com expressão alterada em tumores pulmonares primários. Usando conjuntos de dados de microarranjos de adenocarcinoma de pulmão, temos procurado por genes que exibiram significativamente diferentes níveis de expressão entre os tecidos pulmonares normais e tumorais. Foram identificados sete proteínas relacionadas com o metabolismo de ARNm sobre-reguladas em tecidos de tumor e uma sub-regulada. Alguns dos genes mais expressos pertencem à família de proteínas spliceosomal, implicando esta maquinaria celular no desenvolvimento do NSCLC. O ADAR2 gene reprimidos foi localizado em uma área com uma alta freqüência de deleções em NSCLC. Além disso, a expressão de cinco desses genes foi associada com o prognóstico de pacientes com adenocarcinoma de pulmão, apoiando a importância do metabolismo de RNA na biologia do câncer de pulmão.

Resultados

Gene Seleção por Análise Bioinformatics

os genes pertencentes a RNA categorias relacionadas com o metabolismo foram selecionados do banco de dados Gene Ontology (www.godatabase.org). Três grandes categorias de ARN relacionadas com o metabolismo foram escolhidas: “ligar ARN”, “splicing de RNA”, e “spliceosome complexo”. O fold-change (FC) dos níveis de expressão de genes entre tecido pulmonar normal e adenocarcinoma foi calculado usando dados de três experiências microarray [22] – [24]. Um conjunto de genes com níveis de expressão de ARNm significativamente diferentes entre tecidos normais e cancerosas foi obtido a partir de cada uma das três experiências microarray (Tabela S1). Um exemplo representativo é mostrado na Figura 1A, e a sobreposição entre os diferentes listas é apresentado na Figura 1B. Além disso, verificou-se que estes genes foram expressas diferencialmente no carcinoma de células escamosas, carcinoma de pulmão de células pequenas, e carcinóides casos presentes nos conjuntos de dados (dados não mostrados). Para corroborar a validade desta seleção, adicional

in silico

validação foi realizada com uma quarta coorte independente de pacientes de adenocarcinoma de pulmão [25], e os resultados confirmaram os achados do experimento inicial (Tabela S2).

) genes de ARN relacionado com os níveis de expressão significativamente diferentes (p 0,01) entre as amostras de adenocarcinoma de pulmão e amostras de pulmão normal (últimos 10 colunas) em um dos bancos de dados de microarrays utilizados no estudo [23]. A cor vermelha indica os níveis de expressão mais elevados, enquanto que a cor verde indica os níveis de expressão inferiores. B) diagrama de Venn correspondente a genes com diferenças de expressão significativas entre amostras normais e adenocarcinoma.

expressão de genes relacionados ao metabolismo de RNA seleccionados em linhas celulares de cancro do pulmão e de pulmão normal culturas primárias

os níveis de expressão dos genes seleccionados foram avaliados por PCR convencional e em CPPC linhas de células NSCLC e em células NHBE primárias. Para a maioria dos genes, os níveis de ARNm em linhas de células de cancro de pulmão foram mais elevados do que em células NHBE (Figura 2). Além disso, os níveis de ARNm foram geralmente mais elevadas em linhas de células de SCLC em comparação com linhas celulares de NSCLC. Este resultado está em concordância com as observações anteriores, em que os níveis de outras proteínas de ligação a ARN de expressão também foram determinadas para ser mais elevada em comparação com SCLC NSCLC [15]. Em ADAR2, várias linhas celulares de cancro de pulmão exibiram níveis mais baixos de ARNm em comparação com as células NHBE. Foram excluídos RNPS1 e SNRPC em análises posteriores, porque os níveis de expressão foram homogêneos entre todos os tipos de células.

Os níveis de expressão foram determinados em linhas celulares de cancro do pulmão e células normais do epitélio brônquico humano (NHBE). GAPDH foi usada como gene de controlo. Quimioterapia: câncer de pulmão de pequenas células; ADC: adenocarcinoma; SCC: carcinoma de células escamosas; LCC: carcinoma de grandes células; CT: tumor carcinóide; NC:. Contraprova negativa (água)

Para quantificar as diferenças nos níveis de expressão, PCR em tempo real para cada um dos oito genes seleccionados foi realizada no painel de linhas celulares de cancro do pulmão, bem como em NHBE células primárias normais e SAECs. Esta análise confirmou os resultados anteriores: expressão dos genes supra-regulados foi maior em células de cancro do pulmão em comparação com as células NHBE ou SAECs. Em contraste, a expressão ADAR2 em células de câncer de pulmão foi menor do que em células NHBE ou SAECs (Figura 3).

Os níveis de expressão foram determinados em linhas celulares de cancro do pulmão e culturas primárias de pulmão não-malignas (NHBE e SAEC). HPRT foi usado como gene de controlo. As barras representam normalizada rácios de expressão relativa aos níveis de genes em células NHBE. Rácios 1 indicam os níveis de expressão mais elevados do que em células NHBE, ao passo que os rácios 1 denotam níveis de expressão inferiores

alterações genéticas no ADAR2 Locus

Nós caracterizou as alterações genéticas associadas. com ADAR2 infra-regulação no câncer de pulmão. Assim, avaliou-se a presença de LOH em 21q22.3, a localização do locus ADAR2. Utilizou-se um painel de oito microssatélites heterozigotos. Os microssatélites foram amplificadas por PCR e analisadas usando electroforese capilar. Microssatélite heterozigosidade foi inicialmente avaliada no painel de linhas celulares de cancro do pulmão e os resultados são apresentados na Figura 4. Em seis linhas celulares (H23, HCC827, A549, H322, H1385, H1299 e), todos os microssatélites eram homozigotos. Embora a presença da perda de heterozigosidade (LOH) não é definitivamente conclusivos devido à falta de ADN genómico normal, combinado, este é extremamente improvável homozigotia e sugere fortemente uma perda de material genético. Em outras linhas de células os resultados foram variáveis, e certos casos, sugere áreas de LOH (por exemplo, a região mais centromérica em células H157) localizada. Em seguida, comparou-se a homozigotia em 21q22.3 e os níveis de expressão de mRNA ADAR2 (obtido anteriormente). Todas as linhas celulares homozigóticas para os microsatélites expressou níveis baixos de mRNA ADAR2. De facto, dois dos três linhas celulares com os níveis mais baixos de expressão de ARNm de ADAR2 (A549 e H1385) pertencem a este grupo. Em contraste, as cinco linhas de células com os mais altos níveis de expressão ADAR2 (H82, H187, H157, H226 e H460) foram sobretudo heterozigotos para os microssatélites que flanqueiam o locus ADAR2 (D21S171 e D21S1574).

homozigose (verde) ou heterozigotia (vermelho) foi determinada em cada linha celular. Os microssatélites são ordenados do mais centromérico ao mais telomérica. ADAR2 lócus está localizado dentro D21S171 e D21S1574.

Nós estudamos a presença de homozigotia em 21q22.3 no DNA genômico de 48 pacientes com câncer de pulmão. A avaliação dos oito microssatélites em tecidos tumorais e tecidos normais pareados nos permitiu determinar com precisão a freqüência de LOH nesta região cromossômica. Figura 5A ilustra os três padrões electroforéticos alternativos obtidos: Caso não informativa, retenção de heterozigosidade, e LOH. Após a análise de microssatélites, LOH foi encontrada em aproximadamente 30-40% dos casos (Figura 5B). LOH em 21q22.3 foi significativamente maior nos carcinomas de células escamosas do que em adenocarcinomas (25 ± 6% vs 49 ± 7%, p = 0,003). Não foram encontradas diferenças na frequência de LOH entre os estágios (fase I: 37 ± 2% vs. fases II-III: 34 ± 7%, p = 0,279). Para avaliar o locus ADAR2 mais especificamente, foi analisado um SNP localizado dentro do gene ADAR2 (rs1051367). Dos vinte casos informativos (isto é, casos heterozigotos para rs1051367 SNP em tecido normal), quinze (75%) eram homozigotos no tecido tumoral combinado correspondente. Uma comparação entre os resultados obtidos a partir da análise de microssatélites e SNP sequenciação demonstrou a concordância entre os respectivos técnicas, embora o número de pacientes com LOH no ADAR2 SNP foi maior (30-40% vs. 75%).

DNA genômico de cânceres de pulmão primário e seus tecidos pulmonares normais correspondentes foram utilizados. A) Os exemplos representativos dos padrões eletroforéticos obtidos pela análise de microssatélites: um caso de não-informativo, com apenas um pico de amplificação; retenção de heterozigosidade, com dois picos em ambas as amostras normais e tumorais; e LOH, com dois picos na amostra normal, mas apenas um pico na amostra tumoral correspondente. As setas indicam a alelos microssatélites. B) LOH dos microssatélites indicados foi analisado em 48 pacientes com NSCLC. Os microssatélites são ordenados do mais centromérico ao mais telomérica. LOH no locus ADAR2 foi analisada por sequenciação directa dos rs1051367 polimorfismo (A /G). caixas verdes representam LOH, caixas vermelhas indicam retenção de heterozigosidade e caixas amarelas são loci não-informativo.

expressão de genes relacionados ao metabolismo de RNA e câncer de pulmão Resultados Clínicos

Nós investigamos se a expressão dos genes relacionados com o metabolismo de RNA foi expressos diferencialmente associados com os resultados clínicos em pacientes com adenocarcinoma pulmonar utilizando um microarray de dados disponíveis publicamente [26]. Os pacientes foram divididos de acordo com altos e baixos níveis de expressão de mRNA usando a mediana como ponto de corte (Figura 6). No caso de ASCC3L1, MRPL3 e PABPC1, não foi encontrada associação entre os níveis de mRNA e evolução clínica de pacientes (dados não mostrados). Alta expressão de MARS, rae1, SNRPB e SNRPE foi significativamente associada à sobrevida global reduzida. Altos níveis de mRNA ADAR2 foram significativamente associados com um melhor resultado. Para uma análise combinada dos cinco genes de prognóstico, os pacientes foram divididos em três grupos: doentes sem eventos desregulamentação, os pacientes com um a três eventos, e pacientes com quatro ou cinco eventos. A pontuação combinada dos cinco genes foi um forte marcador de prognóstico (Figura 6). Assim, pacientes com nenhum evento desregulamentação exibiu muito boa sobrevivência. Em contraste, os pacientes com a desregulamentação em quatro ou cinco dos genes apresentaram o pior sobrevivência. O modelo de riscos proporcionais de Cox foi utilizado para avaliar o impacto do escore prognóstico na sobrevida global, tanto em análise univariada e multivariada (Tabela 1). A pontuação RNA-metabolismo foi um fator prognóstico independente para sobrevida global em pacientes com adenocarcinoma de pulmão.

Os dados foram obtidos a partir de um estudo microarray [26]. Os números mostram as curvas de Kaplan-Meier e log estatísticas de classificação para a sobrevida global em pacientes divididos em alta e baixa expressão de mRNA (usando a mediana como ponto de corte). Última valor corresponde a pacientes divididos pelo número de desregulamentação eventos (ver Materiais e Métodos).

Discussão

Foram identificados oito genes de ARN relacionado diferencialmente expressos em câncer de pulmão , uma descoberta que reforça a hipótese de que o RNA metabolismo é importante na patogênese do câncer de pulmão. Sete dos genes identificados foram regulados positivamente, ao passo que apenas um foi regulada para baixo. Curiosamente, a maioria destes genes não tinha sido previamente relatado para ser associado com o cancro do pulmão. Além disso, a expressão da maioria destes genes exibiram uma associação com a sobrevivência global em doentes com adenocarcinoma do pulmão, sugerindo uma ligação entre o metabolismo do ARN e patogénese do cancro do pulmão.

relatórios anteriores demonstraram que os genes de ARN do metabolismo são desregulados e implicada na transformação maligna das células do pulmão [14], [16], [18]. Os resultados do nosso estudo a identificar um novo conjunto de genes diferencialmente expressos associados com RNA-metabolismo. É claro que a expressão de muitos outros genes de ARN relacionado é alterada no cancro do pulmão. O grupo de genes identificados em nosso estudo foi fortemente influenciado pela estratégia rigorosa de seleção. As análises estatísticas foram restritiva; Assim, foram escolhidos apenas os genes mais importantes. Além disso, as mudanças no splicing, que têm sido relatados para alguns genes de ARN relacionado [17], [27], [28], não podem ser detectadas usando esta abordagem analítica.

A maioria dos genes de ARN relacionado identificados em nosso estudo foram regulados positivamente no tecido tumoral. A razão para isso não está clara; isto pode ser devido ao aumento da taxa metabólica associada com a proliferação de células tumorais. No entanto, a grande maioria dos genes de ARN relacionado exibiram nenhuma diferença entre o tumor e os tecidos pulmonares normais. Além disso, um gene relevante identificado no nosso estudo foi regulada negativamente (ADAR2), e a expressão de ARNm de cinco dos genes seleccionados foi associada com o resultado clínico em uma série de doentes com adenocarcinoma. Em particular, a alta expressão de genes up-regulamentados (MARS, rae1, SNRPB e SNRPE) foi associado com pior prognóstico, ao passo que a alta expressão do gene subregulado (ADAR2) correlacionado com a sobrevivência melhorada. Curiosamente, o grupo de pacientes sem a desregulamentação em qualquer destes genes exibiu muito boa sobrevivência. Por outro lado, um elevado número de eventos desregulamentação foi associada com a sobrevivência pobre. Estes resultados sugerem que a actividade da ARN-maquinaria metabólica pode potencialmente servir como um marcador prognóstico para cancro do pulmão.

Proteínas traduzido de três dos oito genes regulados positivamente pertencem à família de ribonucleoproteínas nucleares pequenas spliceosomal ( snRNP): ASCC3L1, SNRPB, e SNRPE. O spliceosome é um complexo de snRNPs além de um grande número de proteínas associadas. Este complexo reconhece sítios de splice e intrões remove a partir de moléculas de pré-ARNm. Pouco se sabe sobre o papel desempenhado pelo spliceosome no câncer. Recentemente, usando análise de sequenciação de todo o exome, alguns estudos identificaram uma elevada frequência de mutações em componentes distintos da spliceosome na leucemia linfocítica crônica e mielodisplasia [29] – [33], implicando esta maquinaria celular no desenvolvimento de câncer [34] . Assim, alguns inibidores spliceosomal foram testados em células cancerosas e a spliceosome tem sido proposto como um alvo anti-cancro [35]. A identificação de três proteínas spliceosomal expressos diferencialmente no cancro do pulmão que sugere um papel é desempenhado pela spliceosome neste malignidade. Infelizmente, não há informações sobre o papel destas proteínas específicas no câncer pouco publicados. ASCC3L1 (SNRNP200) codifica helicase Brr2, um componente importante do U5 spliceosomal snRNP. Para o nosso conhecimento, este estudo é o primeiro a demonstrar que ASCC3L1 está associada à malignidade. ribonucle�ido nuclear pequena proteína associada B (SNRPB) é parte de snRNP U1. SNRPB tem sido relatada como sendo um supressor de metástases num modelo de aloenxerto de ratinho de cancro da próstata [36]. Um polimorfismo raro no gene SNRPB tem sido associada com um risco reduzido de câncer de mama em portadores da mutação BRCA1 [37]. A sobre-expressão de pequeno ribonucleótido nuclear proteína associada E (SNRPE) foi supostamente associada com a interrupção de crescimento na fase G2 em células de ambas as malignas e não-malignas [38]. No entanto, de acordo com nossos resultados, SNRPE é amplificado e sobre-expressos em gliomas malignos e carcinomas de células escamosas oral [39], [40]. SNRPE também é amplificado e sobre-regulada no carcinoma hepatocelular e pode funcionar como um oncogene, aumentando a proliferação celular [41].

As outras proteínas que foram up-regulamentados em nosso estudo foram MARS, MRPL3, PABPC1 e RAE . Metionina-tRNA sintetase (MARS ou metrs) atua como um catalisador na ligação de metionina à sua tRNA correspondente. O aumento de actividade desta enzima tem sido relatada em cancro do cólon humano [42]. Mais recentemente, uma indução da expressão de Marte foi mostrado em linhas celulares de cancro da mama, estimuladas com factor de crescimento semelhante a insulina [43]. mutações de desvio de enquadramento na MARS foram descritos nos carcinomas gástricos e colorectais com instabilidade microssatélite [44]. L3 proteína ribossomal mitocondrial (MRPL3) é um componente da subunidade 39S do ribossoma mitocondrial. Elevada expressão desta proteína foi relatada em hepatocarcinoma, carcinoma do cólon, e o linfoma, o que sugere uma associação desta proteína com taxas de divisão celular elevadas [45]. Um poli-proteína de ligação a um citoplasmática (PABPC1) participa em poli-A encurtamento na extremidade 3 ‘dos ​​mRNAs eucarióticos. resultados contraditórios sobre o papel desta proteína no cancro têm sido relatados. Um estudo concluiu que baixos níveis de PABPC1 correlacionada com tumores mais invasivos e as taxas de sobrevivência piores em pacientes com câncer de esôfago [46]. No entanto, em outros estudos, PABPC1 sobre-expressão foi descrita em tumores de próstata [47], carcinoma hepatocelular [48], câncer de bexiga superficial [49], e câncer de pulmão [50]; No último relatório, os autores sugerem a participação do complexo de iniciação da tradução na tumorigênese do câncer de pulmão. PABPC1 também regula a actividade de telomerase, que conduz a uma vantagem de crescimento em queratinócitos que expressam papilomavírus humano tipo 16 E6 [51]. ARN exportação um homólogo (rae1) é uma proteína de exportação nuclear envolvidas no transporte do mRNA do núcleo para o citoplasma. Rae1 também desempenha um papel crítico na manutenção da bipolaridade fuso durante a divisão celular [52], [53]. Rae1 ARNm e os níveis de proteína diminuir mediante inibição da proliferação de células de neuroblastoma, e a sua sobre-expressão impede a paragem do ciclo celular induzida por ácido retinóico e diferenciação [54]; No entanto, um estudo anterior demonstrou que os ratinhos mutantes rae1 /NUP98 são mais susceptíveis aos tumores do pulmão induzidos por DMBA em comparação com ratinhos de tipo selvagem, indicando que combinada rae1 /NUP98 haplo-potencialmente insuficiência promove tumorigénese [55].

o gene de adenosina-desaminase regulados negativamente na qualidade de ARN 2 (ADAR2 ou ADARB1) é um editase ARN que catalisa a desaminação de adenosina a inosina em regiões de cadeia dupla. A desregulação de adenosina a inosina edição em cancros humanos potencialmente contribui para o programa transcricional alterada necessária para sustentar a carcinogénese [56]. ADAR2 é expressa ubiquamente em muitos tecidos, especialmente no sistema nervoso central [57]. epilepsia de início precoce e morte prematura foram relatados em ADAR2 nocautear ratos [58]. No cancro, um estudo anterior relatada sobre-expressão de ADAR2

in vitro

células transformadas humanas adultas estaminais mesenquimais, f ibroblastos, transformadas e algumas linhas de células de outros tecidos [59]. Níveis mais elevados de ARNm ADAR2 também foram observados em linhas de células de cancro de próstata independente de androgénios em relação a linhas celulares responsivos aos andrógenos [60]. No entanto, a maioria dos relatórios ligar o cancro com expressão ADAR2 reduzida ou atividade. Assim, um decréscimo na actividade enzimática de ADAR2 em doentes com glioblastoma multiforme (MGB) foi associada a uma maior Ca

2+ permeabilidade e a activação da via de Akt, que contribui para o crescimento do tumor e agressividade [61], [62]. Paz et al. também observaram um decréscimo dos níveis de ARNm ADAR2 em tumores cerebrais e demonstraram que a sua sobre-expressão numa linha de células MGB resultou numa diminuição da proliferação das células [63]. A diminuição da atividade edição ADAR2, que se correlacionou com o grau de malignidade, também foi encontrado em astrocitomas pediátricos [64]. Quando o estado de edição foi revertido em três linhas de células de astrocitoma, uma diminuição significativa no comportamento maligno das células foi determinada [64]. Mais recentemente, Galeano et ai. observou-se uma diminuição geral dos eventos de edição ADAR2 mediadas na bexiga e câncer colorretal [65]. No caso de cancro do pulmão, uma redução de expressão ADAR2 foi anteriormente descrito no carcinoma do pulmão de células escamosas [66].

regulação negativa do ADAR2 no cancro do pulmão está potencialmente associada a alterações genéticas em 21q22, onde o gene é ADAR2 localizado. Estudos anteriores relataram a perda de material genético no braço longo do cromossoma 21 em pacientes com vários tumores sólidos [67] – [71], incluindo cancro do pulmão [72] – [76]. Lee et al. analisou nove marcadores microssatélites, colocados entre 21q21.1 e 21q22.3 em pacientes com NSCLC. LOH foi detectada durante, pelo menos, um deles em mais de 55% dos tumores, com 26% de taxa de incidência LOH -48% dos microssatélites individuais [74]. Sato et al. descrito LOH em 21q22.3 em 28% das amostras de adenocarcinoma e pacientes com carcinoma de células escamosas [72]. Estamos focados na análise de alterações 21q22.3 na região de ADAR2. Encontrámos 30-40% de incidência de LOH entre os pacientes com NSCLC, com quase metade dos tumores (23 em 48) exibindo LOH em pelo menos um dos microssatélites analisados. De acordo com estudos anteriores, carcinomas de células escamosas apresentaram maior freqüência de LOH em 21q22 de adenocarcinomas. Além disso, foi observada uma incidência muito elevada de LOH (75%) por análise de um SNP localizado dentro do gene ADAR2. Estes resultados podem ser explicados pela existência de regiões alternadas com e sem LOH, e indicam que o locus genético ADAR2 é uma das regiões mais frequentemente alterados em carcinogénese pulmão. Tomadas em conjunto, as perdas frequentes genéticos no locus ADAR2 e sua expressão reduzida sugerem que ADAR2 potencialmente funciona como um supressor tumoral no cancro do pulmão. Os dados funcionais também apoiar esta hipótese, porque a sobre-expressão de ADAR2 em linhas celulares de cancro inibe a proliferação e migração de [63], [64]. Além disso, nós demonstramos que os baixos níveis de mRNA ADAR2 estão significativamente associados com a sobrevida global em pacientes de adenocarcinoma de pulmão. Um escore prognóstico baseado na expressão de ADAR2 e quatro genes relacionados com o metabolismo de RNA complementares (MARS, rae1, SNRPB e SNRPE) podem estratificar os pacientes de câncer de pulmão em grupos de alto e baixo risco para morte por câncer. A pesquisa adicional é mandado para examinar se esta informação pode ser útil para identificar os pacientes com NSCLC ressecável que estão em alto risco de recorrência e se beneficiariam de terapia adjuvante.

Em conclusão, neste estudo nós identificamos nova metabolismo de RNA genes relacionados com diferencialmente expressos em câncer de pulmão e associada com a evolução clínica. Estes resultados suportam o papel do metabolismo do ARN na patogénese desta doença. Além disso caracterização dos mecanismos que regulam este processo pode potencialmente levar ao desenvolvimento de melhores estratégias para diagnóstico, prognóstico e tratamento do câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Este estudo foi aprovado pelos comitês de ética da Clínica Universidad de Navarra (Pamplona, ​​Espanha) e do Hospital Marqués de Valdecilla (Santander, Espanha). consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente

microarrays experimentos

Quatro experimentos de microarranjos publicamente disponíveis foram utilizados para identificar genes relacionados RNA-metabolismo diferencialmente expressos entre adenocarcinoma de pulmão e tecido pulmonar normal [22]. – [25]. Algumas destas experiências incluíram dados de outros subtipos histológicos. Uma quinta experiência de microarray foi usada para analisar a relação entre os níveis de expressão do gene e o prognóstico em pacientes com adenocarcinoma pulmonar [26]. Tabela S3 contém informações sobre o número de amostras e os subtipos histológicos presente em cada estudo.

Lung Cancer linhas celulares e culturas primárias

linhas celulares de cancro de pulmão foram obtidas a partir da American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, VA). As células foram cultivadas em meio RPMI suplementado com glutamina 2 mM, soro bovino fetal a 10%, 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /mL de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). As células epiteliais das vias aéreas pequenas (SAEC) foram adquiridos a partir de Lonza (Walkersville, MD) e cultivadas em meio de crescimento epitelial das pequenas vias aéreas (SAGM, Lonza), suplementado com SAGM SingleQuots (Lonza). As células normais epiteliais brônquicas humanas (NHBE) (Clonetics, San Diego, CA) foram cultivadas em meio de crescimento de células epiteliais brônquicas (BEGM, Clonetics) complementado com os suplementos de crescimento do BulletKit (Clonetics). As culturas celulares foram mantidas a 37 ° C e 5% de CO

2 numa incubadora humidificada. Antes de extração de RNA ou DNA, as células foram testadas para a

Mycoplasma

contaminação, de acordo com as instruções do fabricante (MycoAlert Mycoplasma Detection Kit, Cambrex, Rockland, ME).

amostras clínicas

os tumores primários e seus correspondentes tecidos pulmonares normais foram obtidas a partir de pacientes com NSCLC tratados com cirurgia curativa resectional na Clínica Universidad de Navarra (Pamplona, ​​Espanha) ou no Hospital Marqués de Valdecilla (Santander, Espanha). Nenhum dos pacientes recebeu quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia. Cirurgicamente removidas amostras foram imediatamente congeladas em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Apenas foram utilizadas as amostras contendo células de tumor mais de 70%. Histologias e etapas de tumores incluídos no estudo estão listados na Tabela S4. Os tumores foram classificados de acordo com a 2004 classificação da OMS [77].

RNA Extração

extração de RNA foi realizada utilizando RNA Ultraspec (Biotecx Laboratories, Houston, TX). Para tecidos primários, a extracção de ARN foi realizada após a fragmentação mecânica de amostras congeladas, utilizando β-mercaptoetanol e Micro RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. Todas as amostras de ARN foram diluídos em água com DEPC e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. A concentração de RNA foi determinada por espectrofotometria (Nanodrop, Thermo Scientific, Wilmington, DE).

transcrição reversa (RT)

Dois microgramas de RNA foram incubadas com dNTPs 1 mM e 50 ng /mL oligo -dTs a 65 ° C durante 5 minutos. Em seguida, foram adicionados 4 ul de tampão 5 × RT, 1 ul de DTT 0,1 M, 40 U de RNase Out e 200 L de Super Script III transcriptase reversa (todos da Invitrogen). Os tubos foram incubados 50 minutos a 50 ° C e 15 minutos a 70 ° C, e, em seguida, colocados em gelo. Finalmente, foram adicionados 2 L de ARNase H (Invitrogen), e os tubos foram incubados 20 minutos a 37 ° C. O ADNc foi armazenado a -20 ° C até à sua utilização.

ADN genómico Extracção

O ADN genómico foi purificado com o QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), seguindo as instruções do fabricante.