Abstract
Fundo
amostras cirúrgicas têm sido muito utilizados como sujeitos importantes para a investigação do cancro. De acordo com um aumento de terapia neoadjuvante, amostras de biópsia têm recentemente se tornou imperativo para transcriptoma câncer. Por outro lado, tanto a biopsia e amostras cirúrgicos estão disponíveis para a expressão de perfil para a previsão de resultados clínicos por terapia adjuvante; No entanto, ainda não está claro se os perfis de expressão peça cirúrgica são úteis para a previsão através de amostras de biópsia, porque pouco tem sido feito sobre a expressão gênica comparativa de perfil entre os dois tipos de amostras.
Metodologia e Descobertas
Um total de 166 amostras (77 biópsia e 89 cirúrgica) de lesões normais e malignas do esôfago foram analisados por microarrays. perfis de expressão gênica foram comparadas entre biópsia e amostras cirúrgicas. induzida artificialmente transição epitelial-mesenquimal (aiEMT) foi encontrado nas amostras cirúrgicas, e também ocorreu em camadas de células epiteliais esofágicas ratinho sob uma condição isquémica. Identificação de subgrupos clinicamente significativas foi pensado para ser interrompido pela desordem do perfil de expressão através deste aiEMT.
Conclusão e Significado
Este estudo irá evocar a má interpretação fundamentais, incluindo a subestimação do poder avaliação prognóstica de marcadores por superestimação da EMT na pesquisa do câncer passado, e irá fornecer alguns conselhos para o futuro próximo da seguinte forma: 1) Compreender o tempo que os tecidos estavam sob uma condição isquêmica. 2) A prevalência de amostras de biópsia para
in vivo
perfil de expressão com baixos preconceitos sobre a investigação básica e clínica. 3) Verificar o conteúdo das células cancerosas e contaminação normal ou necrótica dos tecidos em amostras de biópsia para prevalência
Citation:. Aoyagi K, Minashi K, Igaki H, Tachimori Y, Nishimura T, Hokamura N, et al. (2011) induzidas artificialmente epitelial-mesenquimal Transição em assuntos cirúrgicos: suas implicações na clínica e básica Cancer Research. PLoS ONE 6 (4): e18196. doi: 10.1371 /journal.pone.0018196
editor: Irene Oi Lin Ng, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 24 de dezembro de 2010; Aceito: 22 de fevereiro de 2011; Publicação: 21 de abril de 2011
Direitos de autor: © 2011 Aoyagi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pelo Programa de Promoção de Estudos Fundamentais em Ciências da Saúde do Instituto Nacional de Biomedical Inovação; um Grant-in-Aid para a Terceira abrangente estratégia de 10 anos de Controle do Câncer do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-estar do Japão; Princesa Fundo Takamatsu Cancer Research, e Fundação para a Promoção da Cancer Research (RR: T.N.). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo
Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O cancro é uma das principais causas de mortes humanas em. muitos países. perfis de expressão de gene a partir de microarranjos de DNA são individualizados e útil no diagnóstico e prognóstico de doenças [1]. Embora alguns fatores artificiais, tais como isquemia, hipoxia, hyponutrition e estresse causado pelo frio, possivelmente ocorrer durante ressecção cirúrgica eo transporte das amostras (figura S1), as amostras cirúrgicas têm sido muito utilizados como sujeitos importantes para a investigação clínica e básica câncer. De acordo com um aumento de terapia neoadjuvante (em cabeça e pescoço, esôfago, pulmão, pâncreas, próstata e câncer de mama), amostras de biópsia têm recentemente se tornou imperativo para transcriptoma câncer. Por outro lado, tanto a biopsia e amostras cirúrgicos estão disponíveis para a expressão de perfil para a previsão de resultados clínicos por terapia adjuvante (em cancros do estômago, cólon, fígado, bexiga, pâncreas, cérebro, rim, ovário, colo uterino, e da mama). As metas para análise de microarray foram, durante os últimos dez anos, principalmente samplesfrom cirúrgica o desenvolvimento e prevalência dos dois tipos de microarray: oligonucleotídeo [2], [3] e cDNA [4], [5]. No entanto, se um grande número de perfis de expressão de exemplo cirúrgica acumulados são úteis para a predição através da utilização de amostras de biópsia a partir de pacientes pré-tratados é ainda pouco claro, porque pouco tem sido feito sobre a expressão do gene de perfil comparativo entre os dois tipos de amostras.
Quimioradioterapia (CRT), seguido por cirurgia é o tratamento padrão para câncer de esôfago nos países ocidentais. No Japão, a quimioterapia neoadjuvante seguida de cirurgia e CRT definitiva são as terapias padrão [6], e para cânceres de esôfago localmente avançado (estágio II ou III), a cirurgia era a terapia padrão há cerca de 5 anos atrás [7]. Isso nos permite obter tanto biópsia e amostras cirúrgicas de pacientes com câncer de esôfago e comparar perfis de expressão genética entre estes dois tipos de amostras. Aqui nós relatamos que artificialmente induzido transição epitelial-mesenquimal (aiEMT) ocorre em amostras cirúrgicas. A sua presença tem, possivelmente, interferiu não só com microarray- ou pesquisa clínica immunohistochemistory à base, mas também com a pesquisa básica.
Resultados
a comparação dos perfis de expressão entre a biópsia e amostras de tumor ressecado cirurgicamente esofágicas Obtidos a partir de diferentes casos de
em primeiro lugar, em comparação perfis de expressão gênica entre 35 amostras frescas de biópsia contendo nenhuma lesão necrótica e 66 amostras de tumores de esôfago cirúrgicas, que foram obtidos a partir de uma margem do tumor após a exposição durante 4-7 horas sob uma condição isquêmica , pelo agrupamento não supervisionado com 3.126 genes processados (Materiais e Métodos). Não houve diferença significativa na distribuição da clínica ou patológica estágio entre estes dois conjuntos de cânceres de esôfago porque os tumores localmente avançados (estágio II ou III) são os principais alvos de ambos chemoradiotherapy e cirurgia [8] – [10]. Sessenta das 66 amostras cirúrgicas (90,9%) e 29 das 35 amostras de biópsia (82,9%) apareceu em um e cluster (esquerda) b (à direita) da amostra, respectivamente (Figura 1A). Para investigar o número de genes diferencialmente expressos entre estes dois tipos de amostras, com reprodutibilidade, foram comparados os perfis de expressão entre os três conjuntos de amostras independentes (A, B, e C): uma outra amostra de 20 biópsia definir contra três conjuntos de amostras cirúrgicas (A, B, e C) contendo 20 casos selecionados aleatoriamente a partir dos 66 casos (Figura 1B, superior). O número de genes diferencialmente expressos seleccionados por U-teste (p 0,01) foram de 2, 295, 2328, e 2, em 245 conjuntos A, B, e C, respectivamente. Entre estes 3 conjuntos, 1.495 genes (65,1% em A, 64,2% no B e 66,6% na C) eram comumente identificados (Figura 1B, superior). Assim, mais de 20% (1.495 /6.000, 24,9%) dos genes foram expressas diferencialmente entre biopsia e amostras cirúrgicas porque o número médio de genes detectáveis em cada caso foi de aproximadamente 6.000. Estes resultados sugerem que existe uma grande diferença entre a biópsia e amostras cirúrgicas.
(A) agrupamento não supervisionado com 3.126 genes processados. Cirúrgicos (a) e biópsia aglomerados de amostra (B) são mostrados. (B) Comparação dos perfis de expressão entre os três conjuntos independentes (A, B, e C): uma amostra de 20-biópsia seleccionado aleatoriamente definida contra três conjuntos de amostras cirúrgicas (A, B, e C) contendo 20 casos independentes. O número de genes diferencialmente expressos selecionados pelo u-teste (p 0,01): 2, 295 em conjunto A, 2.328 no conjunto B, e 2, 245 em conjunto C (Superior). O número de genes diferencialmente expressos com uma mudança de 3 vezes entre duas intensidades médias de sinal: 297, 273, e 300. resultados Clustering com esses conjuntos de genes (mais baixa). (C) genes regulados positivamente em amostras cirúrgicas ou biópsia. Através da utilização de todos os perfis sob condições de selecção rigorosas (ver Materiais e Métodos), 38 e 219 genes foram identificados como genes sobre-regulada em amostras de biópsias cirúrgicas e, respectivamente.
Da 1.495 genes, foram selecionados mais genes diferencialmente expressos entre os 3 jogos que tiveram uma mudança de 3 vezes entre duas intensidades médias de sinal de cada gene entre a biópsia e amostras cirúrgicas. A partir de conjuntos A, B, e C, 297, 273, e 300 genes foram identificados, respectivamente (Figura 1B, inferior). Mais de 80% destes genes foram sobre-expressos nas amostras cirúrgicas, o que sugere uma presença preferencial de fatores artificiais ou de uma contaminação de partes normais.
Para abordar a razão para a diferença, finalmente seleccionados genes que expressavam preferencialmente em todas as 35 amostras de biópsia ou 66 cirúrgicos sob condições rigorosas com U-teste (P 0,01), teste de permutação, e uma alteração de 2 vezes, etc (Materiais e Métodos). Por este procedimento, os 38 e 219 genes foram identificados como genes sobre-regulada na biopsia e amostras cirúrgicas, respectivamente (Tabela S1 e Figura 1C). Interessantemente, nas amostras cirúrgicas, muitos marcadores EMT foram encontrados para ser expressa preferencialmente e com frequência. resultados de microarranjos de 13 marcadores EMT representativos incluindo fibronectina (FN), vimentina (VIM) e colágenos (cols) são mostrados na Figura 2A. Além disso, os transdutores de sinal de membrana, tais como citocina, quimiocina e receptores também foram encontradas para ser regulada para cima nas amostras cirúrgicas. microarray Representante e resultados de RT-PCR de
IL8
,
CXCR4
,
CXCL9,
PDGFRB
,
CCL5
, e
TLR2
, respectivamente, são mostrados nas Figuras 2B e 2C. Em correspondência com EMT, E-caderina (
CDH1
) foi encontrado para ser regulada para baixo nas amostras cirúrgicas (Figura 2A, à direita mais baixa).
(A) os padrões de expressão de um epitelial marcador de células e-caderina (
CDH1
) e marcadores de EMT típicos, incluindo fibronectina (
FN
), vimentina (
VIM
) e colágenos (
cols
). (B) os padrões de expressão de transdutores de sinal 6 de membrana: uma citocina (
IL8
), duas quimiocinas (
CXCL9
e
CCL5
) e três receptores do tipo membrana (
CXCR4
,
PDGFRB
, e
TLR2
). (C) Semi-quantitativas resultados de RT-PCR destes 6 transdutores de membrana em amostras representativas.
a comparação dos perfis de expressão entre amostras de biópsia e cirúrgicos amostras de tumores de esôfago recessionada obtidas nos casos idênticos
da mesma maneira acima, foram comparados os perfis de expressão de gene entre 18 biópsia e 18 amostras de tumores esofágicos cirurgicamente ressecado, e seleccionada 41 e 716 genes que foram identificados como sobre-regulada genes nos dois tipos de amostras, respectivamente (Tabela S2 e Figura 3). De acordo com os resultados acima de diferentes casos, muitos marcadores de EMT e transdutores de sinais da membrana também foram encontrados para ser regulada para cima com frequência nas amostras cirúrgicas (Figura 4A). Mais importante ainda, dois reguladores de EMT,
ZEB1
e
ZEB2
, e alguns fatores de transcrição miogênica relacionadas com a EMT, incluindo
MEOX2
e
MEF2C
foram capazes de ser seleccionados como genes sobre-regulada nas amostras cirúrgicas (Figuras 4A). Quantitativo em tempo real RT-PCR confirmou a sobre-expressão de
ZEB1
,
ZEB2, FN, e VIM
nas 18 amostras cirúrgicas de processos idênticos (Figura 4B). A sobre-expressão de
ZEB1
e
ZEB2
foi também encontrado nas 66 amostras cirúrgicas de diferentes casos (Figura S2), embora estes dois reguladores EMT não poderia ser extraído de perfis de expressão sob o acima condições rigorosas. SNAI1 /Caracol, SNAI2 /Slug, ZEB1 /ZFHX1A, ZEB2 /SIP1 /ZFHX1B, TWIST1 /TWIST, e TWIST2 são reguladores EMT representativos [11], [12]. Entre eles,
TWIST1
, bem como dois
ZEBs
foram sobre-expressos nos dois conjuntos de tumores esofágicos (Figura S3). Para investigar se aiEMT nos níveis de mRNA afeta imuno-histoquímica (IHQ), foi realizada IHC em um vimentina marcador mesenquimais típico na biópsia e amostras cirúrgicas de processos idênticos. Em primeiro lugar, determinado condições em que as camadas de células epiteliais normais não poderiam ser coradas, mas as células tumorais com EMT poderia ser (Figuras 5A, 5B), porque as camadas indiferenciadas (basais e parabasais) têm sido relatados para expressar genes relacionados-EMT incluindo
VIM
[4]. Em 3 de 5 pares de amostras examinadas, lesões tumorais de uma amostra cirúrgica foram encontrados para ser mais altamente corados do que os de uma amostra de biópsia (Figuras 5C-H); No entanto, os restantes 2 pares não mostrou essa diferença (dados não mostrados). Portanto, o aiEMT que ocorreu nas amostras cirúrgicas no nível de mRNA foi pensado para afetar apenas um subconjunto de amostras cirúrgicas no nível de proteínas relacionadas com EMT.
Por selecção rigoroso (ver Materiais e Métodos), 41 e 716 genes foram identificados como up-regulamentados genes nas amostras de biópsia e cirúrgicos, respectivamente.
(a) os padrões de expressão de 2 reguladores EMT representativos (
ZEB1
e
ZEB2
), 8 marcadores EMT típicos, incluindo fibronectina (
FN
), vimentina (
VIM
), 3 colágenos (
COL1A2
,
COL3A1
e
COL14A1
),
FBN1
,
MYH11
, e
ACTC1
e 2 fatores de transcrição miog�icas relacionadas com a EMT (
MEOX2 Comprar e
MEF2C
). (B) quantitativo em tempo real os resultados de RT-PCR de
ZEB1, ZEB2, FN, e VIM
. caixa fechada: peça cirúrgica; Abra a caixa:. Amostra de biópsia
IHC da vimentina em uma amostra cirúrgico adicional, que continha porções normais, mostraram que as células epiteliais do esôfago normais não foram marcadas, mas as células tumorais invasivas foram (A, B). Em 3 de 5 pares de biópsia e amostras cirúrgicas, a sobre-expressão de vimentina foi observada nas amostras cirúrgicas. (Biópsia: C, E, G; cirúrgica: D, F, H)
sobre-expressão de
ZEB1
,
ZEB2
, e
TWIST1
em ressecado cirurgicamente tecidos normais
Obtivemos 4 amostras de biópsia e 5 amostras cirúrgicas de não tecidos -cancerous, e compararam seus perfis de expressão. Da mesma forma com os perfis de expressão acima de tecidos tumorais (Figuras 2, 4, S2 e S3), três reguladores EMT (
ZEB1
,
ZEB2
, e
) e dois marcadores EMT típicos (
VIM
e
FN
) foram encontrados para ser sobre-expresso nos 5 amostras cirúrgicas (Figura 6A). O nosso relatório anterior, mostrando o envolvimento de ZEB2 e TWIST1 na EMT de células epiteliais do esôfago normais e malignas [9] apoia a presença ali EMT induzida artificialmente.
(A) sobre-expressão de EMT-reguladores (
ZEB1
,
ZEB2
, e
TWIST1
) e EMT-marcadores (
VIM
e
FN
) no esôfago normais cirurgicamente ressecado mucosa. (B) Indução de rato
Zeb1
,
Zeb2
,
Vim
, e
Fn
sob condição isquêmica. Após a ressecção do esôfago rato, que colocou em PBS para 0 ou 4 horas à temperatura ambiente (sob uma condição isquêmica), imediatamente feitos cortes congelados, capturados a camada de células epiteliais (superior) por microdissecção a laser, amplificada mRNA por TALPAT [24] – [28], e perfis de expressão obtidos usando o mouse expressão de matriz 430 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA). Os experimentos foram realizados em 3 ratinhos. O
Zeb1
,
Zeb2
,
Vim
, e
Fn
genes são induzidos 4 horas após a ressecção (Baixa). *
P Art 0,05. (C) Quantitativa em tempo real RT-PCR de
Zeb1
,
Zeb2
,
Vim
, e
Fn
. Sobre-expressão de
Zeb1
,
Zeb2
,
Vim
, e
Fn
, mostrado por microarray, foi confirmada.
Finalmente, para investigar se estes 5 genes são induzidos em células epiteliais por isquemia relacionada com a ressecção cirúrgica, nós ressecado um esôfago do rato, e colocou-o em PBS para 0 ou 4 horas, e imediatamente fez cortes congelados seguido por laser capturado microdissecação das camadas de células epiteliais (Figura 6B, superior). perfis de expressão das camadas de células epiteliais do rato a 0 ou 4 horas após a ressecção revelou que o mouse
Zeb1
,
Zeb2
,
Vim
, e
Fn
foram induzidos 4 horas após a ressecção (Figura 6B, abaixe). Quantitativo em tempo real RT-PCR confirmou a sobre-expressão de
Zeb1
,
Zeb2
,
Vim
, e
Fn
após a ressecção (Figura 6C) . Uma vez que a sensibilidade global de matrizes Affymetrix rato é conhecido por ser mais baixa do que em seres humanos, e a utilização de uma pequena quantidade de ARN, tal como sujeitos capturado por laser é também conhecida para reduzir a sensibilidade de microarray,
TWIST1
próprio ARNm não podia ser detectado nesta experiência rato (dados não apresentados).
Para investigar se aiEMT nos níveis de ARNm afecta IHC, foi realizada em um IHC vimentina marcador típico mesenquimais 8 horas após ressecção. Aqui nós determinamos condições em que as camadas de células epiteliais normais são coradas. Em todas as 3 amostras independentes examinados, as camadas de células epiteliais normais não foram encontrados para ser altamente coradas 8 horas após a ressecção (Figuras 7A-C). A discrepância entre o nível de ARNm e proteína de nível podem ser explicadas pelos dois motivos seguintes: 1), embora camadas indiferenciadas (basais e parabasais) têm sido relatados para expressar genes relacionados com o EMT incluindo
VIM
[4], os seus Os níveis de expressão foram muito inferiores do tumor (Figura 5B). 2) pode também ser difícil para mostrar a mudança de aproximadamente 2 vezes o nível de ARNm (Figuras 6B, C) como no nível de proteína por IHQ, porque IHC é inferior a RT-PCR em ambas sensibilidade e quantificação.
Após a ressecção do esôfago rato, que colocou em PBS durante 0, 4, 8 horas à temperatura ambiente (sob uma condição isquêmica), imediatamente fez cortes congelados e IHC de vimentina foi realizada sob condições mais sensíveis em comparação com a Figura 5 . As experiências foram realizadas em ratinhos (3 A-C). Sobre-expressão de vimentina no rato epitélio esofágico não foi observada mesmo após 8 horas de exposição sob uma condição isquêmica. Arrow: vimentina positivas de músculo liso, cabeça da seta:. Camadas de células de rato estratificadas esofágicas epiteliais
Todos os resultados sugerem que a EMT, especialmente no nível de mRNA, é induzida artificialmente, tanto epiteliais normais e malignas células por eventos relacionados com a ressecção cirúrgica (hipóxia induzida por isquemia e hyponutrition e inflamação induzida por hipoxia, etc.).
induzido artificialmente EMT (aiEMT) pela identificação de subgrupos baseados em Microarray ressecção cirúrgica Previne
a identificação de subgrupos clinicamente significativas é muito importante para a medicina personalizada e para o desenvolvimento de drogas contra os casos intratáveis. Quando usamos os perfis das 35 amostras de biópsias obtidas de pacientes tratados com quimioradioterapia [8], o agrupamento não supervisionado com 5.570 genes processados (Materiais e Métodos) identificou um grupo que responde bem constituído por 9 pacientes (7/9, 78% mostrando completa expressão resposta a radioquimioterapia) a partir da 35 (Figura 8A, esquerda). No entanto, quando foram usados os perfis das 66 amostras cirúrgicas, o agrupamento não supervisionado com 2.016 genes processados não poderia identificar qualquer subgrupo (Figura 8A, à direita). Assim, os perfis de expressão amostra de biopsia parecia ser mais eficaz na identificação subgrupo do que aqueles das amostras cirúrgicas. Na verdade, nós relatado anteriormente que os perfis de expressão amostra de biópsia poderia distinguir sobreviventes a longo prazo ou de curto prazo de quimioradioterapia definitivo [8]; no entanto, perfis de expressão amostra cirúrgicos nunca se identificou pobres subgrupos prognósticos com extensa metástase em linfonodo [10]. Além disso, em amostras cirúrgicas, EMT foi acelerado em 36 (85,7%) dos 42 cânceres de esôfago [9]. Esta elevada percentagem parece ser causada por aiEMT.
(A) agrupamento não supervisionado de 35 biópsia e 66 amostras de tumores de esôfago cirurgicamente ressecados com 5.570 e 2.016 genes transformados, respectivamente. Um cluster de amostra com 2.971 genes aparece apenas nas amostras de biópsia. (B) A comparação do número de genes transformados para o agrupamento não supervisionado entre biópsia e amostras cirúrgicas. O número de genes transformados e genes vulgarmente seleccionados é indicada. (C) distribuição de frequência para percentagem de amostras de conjuntos de genes transformados finalmente. Cada distribuição de 5, 570 genes em amostras de biópsia (esquerda) e 2.016 genes em amostras cirúrgicas (à direita) é indicado.
Para abordar a razão pela qual subgrupo é difícil em amostras cirúrgicas, comparamos o número e a distribuição de cada um dos genes transformados, os quais foram utilizados para o agrupamento sem supervisão. Em primeiro lugar, seleccionado genes com uma intensidade de sinal em mais de 1000 em mais de 10% das amostras. A partir de 35 amostras de biópsia e 66 cirúrgicos, 6.551 e 4.797 genes, respectivamente, foram selecionados. A partir destes genes, finalmente seleccionado mais do que 3 vezes genes alterados por comparação da intensidade média do sinal de cada gene em mais de 10% das amostras. Nas amostras de biopsia 35, 85% (5.570) 6.551 de genes transformados primeiro permaneceu, ao passo que o número de genes transformados finais diminuiu de 4.797 primeiros genes transformados de 2016 (42%) (Figura 8B, superior). Dos 2.016 genes finalmente transformados em amostras cirúrgicas, 1.724 (86%) foram incluídos nos 5.570 genes finalmente processadas nas amostras de biópsia; No entanto, 3846 (69%) de 5570 genes foram única para as amostras de biópsias (Figura 8B, inferior). Além disso, a distribuição de frequência (por percentagem de amostras) destes dois conjuntos de genes transformados finalmente mostra que aproximadamente 60% dos 2.016 genes transformados nas amostras cirúrgicas expressar apenas num número limitado de casos (0-10%) (Figura 8C) . Assim, aiEMT em amostras cirúrgicas podem diminuir o número de genes transformados úteis para a identificação subgrupo.
Discussão
Recentemente, relatou a presença de interferência entre Hedgehog (Hh) e EMT sinalização em condições normais e malignas células epiteliais do esófago [9]. Neste relatório,
ZEB2
foi mostrado como sendo um gene a jusante de tanto um transdutor GLI1 transcrição primária na sinalização de Hh e de outro regulador de EMT, TWIST1, e que ZEB2 ainda mais supra-regulados 5 receptores de quimioquinas ou factores de crescimento,
PDGFRA
,
EDNRA
,
CXCR4
,
VEGFR2
, e
TRKB
(Figura S4). O bloco de sinal de Hh inibiu a diferenciação de queratinócitos esofágica e invasão de células cancerosas e do crescimento. Assim, a sobre-expressão de
ZEB2
e
TWIST1
em amostras cirúrgicas de ambos os tecidos normais e tumorais pode induzir EMT, resultando em sobre-expressão de marcadores EMT representativos
VIM
,
FN
, e
cols
(Figuras 2, 4, 6, S2 e S3) e transdutores de sinais de membrana
IL8
,
CXCL4
,
CCL5
,
CXCR4
,
PDGFRB
, e
TLR2
(Figura 2). A sobre-expressão da membrana transdutores de sinal pode ainda activar cascatas a jusante. Esta é uma das principais razões para a grande diferença de perfis de expressão entre biópsia e amostras cirúrgicas (Figuras 1 e 3).
contaminação extensa de porções mesenquimais normais em tecidos tumorais cirurgicamente ressecados pode também explicar a expressão ao longo dos reguladores de EMT e genes relacionados com o EMT, embora patologistas treinados cuidadosamente excisadas amostras de tecido granel do tumor principal, deixando uma margem clara do tecido normal circundante (Materiais e Métodos). No entanto, a sobre-expressão foi também observada em tecidos e camadas de células epiteliais normais do rato cirurgicamente ressecado 4 horas após a ressecção (Figura 6). Portanto, concluiu-se que artificialmente induzida EMT, denominado aiEMT, ocorreu em ambas as células epiteliais normais e malignas por os eventos relacionados com ressecção cirúrgica (hipóxia induzida por isquemia, hyponutrition induzida por isquemia, e inflamação induzida por hipoxia, etc.) (Figura S1 ).
recentemente, os factores de hipoxia (HIF-indutível-1A ou HIF-2A) têm sido relatados para regular directamente TWIST1 [13], [14] e LOXL2, que alegadamente estabilizadas um regulador EMT, SNAI1 /CARACOL, através da interação física no domínio lesma e resíduos de lisina de caracol K98 e K137 [15]. O local de ligação SNAI1 também foi encontrado na região promotora 5 ‘do
ZEB2
[16]. Sobre-expressão de ambos
HIF1A
e
LOXL2
foi observada apenas nos tecidos tumorais cirurgicamente ressecados obtidos de casos diferentes (Figura S5). Além disso, outros
HIF1
famílias (
HIF1B
e
HIF2A
) não foram sobre-expressos em nenhuma das amostras cirúrgicas. Portanto, a elucidação dos mecanismos moleculares de aiEMT em amostras cirúrgicas permanece para estudos futuros. No entanto, observou-se que a hipóxia e /ou inflamação induzida por isquemia foi relatado para liberar repressão da NFkB [17], que regula
ZEB1
,
ZEB2
, e
TWIST1
[18], [19], e que a sinalização de TGF-β pode estar envolvido na aiEMT, porque a sobre-expressão de
NFKB1
e
TGFBR2
foi encontrado em amostras cirúrgicas (Figura S6).
como mencionado na introdução, as amostras cirúrgicas têm sido usadas como temas importantes para o câncer de investigação clínica e básica por muitos anos. Portanto, aiEMT em amostras cirúrgicas podem possivelmente ter interferido com ou prevenida, não só microarray- ou à base de imuno-histoquímica investigação clínica (identificação do marcador de diagnóstico, subgrupo, tornando preditores, e avaliação do prognóstico, etc), mas também a pesquisa básica (fazendo um mapa via de sinal , a identificação do alvo terapêutico, etc). Este estudo irá provavelmente provocar má interpretação fundamentais, incluindo a subestimação do poder avaliação prognóstica de marcadores por superestimação da EMT na pesquisa do câncer passado, e irá fornecer alguns conselhos para o futuro próximo da seguinte forma: 1) Compreender o tempo que os tecidos estavam sob uma condição isquêmica ( desde o início da ressecção para o estoque ou preparação RNA). A quantidade total de tempo nunca deve exceder 4 horas. 2) A prevalência de amostras de biópsia para
in vivo
perfil de expressão com baixos preconceitos sobre a investigação básica e clínica; por exemplo, para a previsão de resultados clínicos não só neoadjuvante, mas também a quimioterapia adjuvante, a radioterapia, e radioquimioterapia, tais como em relatórios anteriores [8], [20] – [23]. 3) Verificar o conteúdo das células cancerosas e contaminação normal ou necrótica dos tecidos em amostras de biópsia para a prevalência. Na amostragem por uma biópsia de agulha, porções de tumor (2 milímetros X 2mm) deve ser obtido a partir de uma margem (periferia) do tumor pela exclusão de lesões necróticas centrais ao abrigo da endoscopia. Se lesões necróticas foram severamente contaminados nas amostras, as amostras devem ser excluídos, quantificando e qualificando RNA. Se as amostras continham lesões normais extensas, tais amostras pode ser excluído pelo método de pontuação baseada no perfil de expressão usando genes específicos normais e /ou tumorais.
Materiais e Métodos
Amostras de Tecido
Todos câncer de esôfago (carcinomas de células escamosas) e tecidos não cancerosos foram fornecidos pelo Hospital Central ou Hospital Oriental no Centro Nacional do Cancro após a obtenção do consentimento informado por escrito de cada paciente e aprovação pelo Comitê de Ética do Centro.
todas as amostras cirúrgicos foram obtidos a partir de pacientes sem terapia neoadjuvante, e todas as amostras de biopsia foram obtidas antes do tratamento. Para as amostras cirúrgicas, patologistas treinados cuidadosamente amostras de tecido excisada em massa do tumor principal, deixando uma margem de clara do tecido normal circundante. Assim, obteve-se a partir de amostras cirúrgicas uma margem (periferia) do tumor. Para as amostras de biópsias de agulha, as porções de tumor (2 mm x 2 mm) foram obtidos sob a endoscopia de uma margem do tumor com a exclusão de quaisquer lesões necróticas centrais. Se as amostras foram severamente contaminados por lesões necróticas, essas amostras foram excluídos por quantificar e qualificar RNA. Se as amostras continham lesões normais extensas, excluímos tais amostras pelo método de pontuação baseada no perfil de expressão usando genes específicos normais e /ou tumorais (em preparação).
O processo global de uma operação de câncer de esôfago requer muito tempo . Portanto, as amostras cirúrgicas foram excisadas a partir de uma margem do tumor por patologistas formados após exposição durante 4-7 horas sob uma condição isquémica, e foram imediatamente congelados a -80 ° C até à sua utilização. Pelo contrário, as amostras de biópsia de agulha sob endoscopia ressecados foram imediatamente congeladas a -80 ° C até à sua utilização. informações clínico-patológico é apresentada nos quadros S3, S4, S5.
Microdissecção Laser seguido por RNA extração e amplificação
secções de criostato (8um) de amostras do rato esôfago congelados foram laser de microdissectados com o MMI CellCut sistema (MMI Inc., Rockledge, FL). O ARN total foi isolado por suspensão das células em tampão de lise ISOGEN (Nippon Gene, Toyama, Japão), seguido por precipitação com isopropanol. O ARN foi amplificado por um método eficiente de amplificação de ARNm de alta fidelidade, chamado TALPAT (T7 ARN polimerase ligada-promotor, o adaptador de ligação-mediada, e a amplificação por PCR, seguida por
in vitro T7-
transcrição) [24-28 ]
Análise Microarray
perfis de expressão gênica foram obtidos a partir de 166 amostras:. sets tumorais (casos diferentes) do independente 35 e 20 amostras de biópsia e 66 amostras cirúrgicas, um outro tumor definido (caso idêntico) de 18 amostras de biópsia e 18 amostras cirúrgicas, um conjunto normal de 4 amostras de biópsia e 5 amostras cirúrgicas. Os ARNs totais extraídos a partir das amostras de tecidos a granel foram hibridados e para microarranjos de oligonucleótidos de alta densidade (Human Genome U95Av2 ou matriz U133PLUS2.0, Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA), em conformidade com as instruções do fabricante marcado com biotina. Para camadas de células capturado-Laser Mouse esofágicas epiteliais, foi usada mouse Genome 430 2.0 Matriz. Os dados digitalizados das matrizes foram processados pela Affymetrix Microarray Suite versão 4.0 ou 5.0, que dimensionado a intensidade média de todos os genes de cada matriz a um sinal de alvo 1000 para comparar de forma fiável matrizes múltiplas variáveis. Todos os dados de microarranjos foram depositados em um banco de dados compatível Miame, GEO; o número de acesso Superseries GSE22954.
Gene Seleção de Microarray de dados e hierárquica Clustering
agrupamento hierárquico é amplamente utilizado como um dos métodos de aprendizagem não supervisionada. agrupamento hierárquico dos dados microarray foi realizada pelo uso de GeneSpring (Agilent Technologies Ltd., CA, EUA), Microsoft Excel e Cluster software TreeView [29] .Para sem supervisão de agrupamento (Figuras 1A e 8A), que seleccionado primeira genes com uma intensidade de sinal em mais de 1000 em mais de 10% das amostras, e a partir destes genes, finalmente seleccionado mais do que três vezes genes alterados por comparação da intensidade média do sinal de cada gene em mais de 10% das amostras. Para genes sobre-expressos em amostras cirúrgicas ou de biópsia, foram selecionados primeira genes por U-teste (P 0,01), teste de permutação, e mudança 2- ou 3 vezes entre as intensidades de sinal médio dos dois conjuntos de amostras, e a partir da primeira selecionados genes que finalmente selecionados genes com mais de 1.000 em intensidade média do sinal.
Semi-quantitativa e RT-PCR quantitativo
o RNA total foi isolado por suspensão das células em tampão de lise Isogen (Nippon gene, Toyama, Japão), seguido por precipitação com isopropanol.