Abstract

Apesar de um melhor entendimento da patogênese do câncer oral, o seu resultado do tratamento continua pobre. Assim, existe uma necessidade para novas estratégias terapêuticas para melhorar o prognóstico desta doença. interferência de RNA (RNAi) parece ser uma ferramenta terapêutica promissora para o tratamento de muitas doenças, incluindo o cancro oral. No entanto, um obstáculo para terapias mediada por ARNi de entrega tem sido, em particular, à conservação de pequenos RNAs interferentes (siARN) em endossomas e a sua subsequente degradação nos lisossomas, o que resulta no silenciamento de genes ineficiente. Assim, o presente estudo examinou a viabilidade da concepção e utilização de um péptido, denominado 599, que consiste numa sequência de influenza sintético derivado de vírus do endossoma-disruptiva fusogénico péptido e um estiramento de nona-penetrante célula catiónico (D-arginina) resíduos, para entregar siRNAs em células cancerosas orais e induzir o silenciamento do alvo terapêutico, CIP2A, uma oncoproteína sobre-expressos em várias neoplasias humanas, incluindo câncer oral. O aumento da razão molar de péptido de 599-a-siRNA demonstrou uma capacidade de ligação mais elevada para moléculas de siRNA e entrega siRNA reforçada para o citoplasma das células cancerosas por via oral. De facto, medições quantitativas de entrega de siRNA em células demonstraram que uma proporção molar 50:1 péptido-a-siRNA poderia entregar 18 vezes quantidades mais elevadas de ARNic em comparação com as células tratadas apenas com ARNsi sem efeitos citotóxicos significativos a longo prazo. Mais importante ainda, a entrega mediada por siARN 599 péptido promovido significativo de mRNA e proteína CIP2A silenciamento que resultou na diminuição da capacidade de invasão de células de cancro oral e crescimento independente de ancoragem. Em conjunto, estes dados demonstram que um péptido quimérico que consiste de uma sequência fusogénico, em combinação com resíduos de penetração de células, podem ser usadas para entregar eficazmente ARNic em células cancerosas orais e induzir o silenciamento do seu gene alvo, potencialmente oferecendo uma nova estratégia terapêutica em combate ao câncer bucal

Citation:. Cantini L, Attaway CC, Butler B, Andino LM, Sokolosky ML, Jakymiw a (2013) fusog�icas-oligoarginina Peptide-Mediated Entrega de siRNAs segmentação dos CIP2A Oncogene em células orais do cancro. PLoS ONE 8 (9): e73348. doi: 10.1371 /journal.pone.0073348

editor: Kin-Hang Kok, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 14 de maio de 2013; Aceito: 19 de julho de 2013; Publicação: 03 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Cantini et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo NIDCR e NCRR concede R00DE018191 (AJ) e P20RR017696, respectivamente. Este trabalho também foi financiado pela concessão Bankhead-Coley Cancer Research Program Florida 08BN-02 (AJ). Apoio técnico fornecido pela Facilidade Clemson Luz de imagem foi possível graças ao Prêmio National Science Foundation # 1126407 e um mecanismo de concessão Universidade Clemson Core para Terri F. Bruce. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Estima-se que cerca de 40.000 novos casos e cerca de 8.000 mortes relacionadas com o cancro da cavidade oral e faringe ocorrerão anualmente nos EUA em 2012 [1]. câncer de cavidade oral é atualmente classificado como o sexto tipo de câncer mais prevalente no mundo, com carcinomas de células escamosas da mucosa oral sendo o tipo mais comum (~ 90%) [2], [3]. Apesar de grandes quantidades de pesquisa e avanços nas áreas de oncologia e cirurgia, a taxa de sobrevida em 5 anos para o cancro oral tem apenas modestamente melhorado nos últimos 30 anos e seu prognóstico permanece pobre comparado a mama, cólon, ou câncer de próstata [1] . Portanto, novas estratégias terapêuticas são necessárias para melhorar o resultado desta doença.

RNA de interferência (RNAi) é um mecanismo regulador altamente conservado gene pós-transcricional desencadeada por codificação não-pequenas moléculas, double-stranded RNA, que pode silenciar especificamente a expressão do gene por um ou outro reprimir a tradução e /ou indução de degradação de ARNm [4], [5]. Curtas moléculas de ARN de cadeia dupla, conhecido como pequeno ARN interferente (siRNA) são moléculas funcionais, que em associação com a selecção de mRNA alvo silenciamento complexo (RISC) induzido por ARN mediar específica da sequência e clivagem [6], [7], [8 ], [9]. A descoberta de que a introdução de siRNAs quimicamente sintetizados em células de mamíferos podem induzir eficientemente a inibição específica da sequência de expressão do gene [6], fez evidente o potencial terapêutico de aproveitamento de RNAi, como meio de alvejar especificamente e silenciar genes causadores de doenças. experimentos pré-clínicos subseqüentes em animais e ensaios clínicos mais recentes validaram mais siRNAs como inibidores potentes de uma variedade de genes causadores de doenças e como uma nova classe promissora de terapias [8], [10], [11].

Embora o desenho de siRNAs-classe terapêutica melhorou [8], [10], a entrega continua a ser o maior obstáculo para o uso generalizado de siRNAs para aplicações terapêuticas [8]. Porque macromoléculas terapêuticas são geralmente entregues através de endocitose [12], um dos principais passos limitantes para muitas abordagens de entrega, incluindo a entrega de siRNA, é endossomal aprisionamento e subsequente degradação da carga terapêutico nos lisossomas [11], [12], [13] . Assim, para melhorar a biodisponibilidade intracelular de siARN, são necessárias estratégias eficazes para a fuga endossomal.

Para transportar o genoma viral para o citoplasma, vírus de animais que são internalizados através de endocitose mediada por receptores, utilizam proteínas com endossoma-disruptiva sequências do domínio de péptido de fusão para mediar a desestabilização da membrana endossomal da célula hospedeira [14]. O método pelo qual essas proteínas virais destabilizar as membranas endossómicas ocorre em um modo dependente da acidificação e foi imitados por péptidos sintéticos, denominados péptidos fusogénicos [15], [16]. Em particular, os vários péptidos fusogénicos sintéticos baseados no domínio de fusão N-terminal da subunidade HA2 da proteína hemaglutinina da gripe vírus provaram ser eficazes a influenciar a transferência de genes [15]. Entre esses peptídeos fusog�icas, tanto o peptídeo INF-7 e sua forma dimérica diINF-7, têm demonstrado a sua capacidade de endosome perturbador, melhorando os sistemas de transferência de genes não virais e aumentar tanto a entrega citosólica de macromoléculas aprisionada em imunolipossomas e mediada por lipofectamina siRNA- silenciamento induzido gene [15], [16], [17]. Além disso, a co-incubação de péptidos quiméricos consistindo do péptido endossoma-disruptiva HA2 fundido com péptidos de penetração de células (CPP; vectores de péptidos catiónicos que podem induzir rapidamente a sua própria internalização celular através de diferentes formas de endocitose [18]), tem também sido demonstrada para melhorar o escape endossomal de carga CPP-complexado, por conseguinte promovendo a fortes efeitos biológicos [12], [18], [19]. Em um estudo particular, a co-incubação de péptidos ligados CPP-HA2 com siRNAs CPP-complexada foi encontrada para melhorar a moderadamente o silenciamento do gene repórter alvo [20].

Embora as estratégias acima descritos demonstraram melhorias em efeitos de silenciamento mediado por siRNA, vários problemas que permanecem ainda poderia limitar a eficácia de entrega citosólica mediada pelo péptido fusogénico de ARNsi. Em primeiro lugar, porque os péptidos fusogénicos ou HA2-quimérico não foram complexadas com os siRNAs, esta abordagem não garante que os péptidos se co-localizam dentro das mesmas vesículas de endocitose como ARNsi de carga [12]. Co-localização é necessária, a fim de libertar moléculas de ARNsi da vesícula endocítica [12]. Em segundo lugar, devido a esta ausência de interacção entre os péptidos e os siRNAs, é possível que os péptidos podiam escapar os endossomas sem perturbar seriamente as membranas endossómicas, em última análise, deixando a carga siARN retido dentro da vesícula [12]. Assim, para contornar estes problemas, este estudo teve como objetivo projetar um péptido quimérico, que consiste numa sequência fusog�ico ligado a um CPP que permitiria estável ligação com siRNAs via interações eletrostáticas e promover a sua entrega e endossomal intracelular escape, a fim de induzir o silenciamento terapêutico de um oncogene alvo em células de câncer bucal. Uma vez que o péptido de INF-7 é um péptido que destabilizam a membrana mais potente em comparação com o péptido HA2 pai e nona catiónico (D-arginina) os péptidos são PPLs altamente eficiente, capaz de absorção celular melhorada [12], [21], bem como a entrega de ARNic em tumores e cérebro de ratos [22], [23], foi elaborado um péptido quimérico, designado por 599, que se aproveitar ambas estas propriedades dentro de uma única molécula de complexo directamente para e aumentar a biodisponibilidade intracelular de siARN. Aqui, nós demonstramos que o peptídeo 599 proporciona efetivamente siRNAs desenhados para atingir CIP2A, uma oncoproteína overexpressed na cabeça humana e do pescoço escamosas carcinomas de células (HNSCCs), incluindo carcinomas de células escamosas orais (epidermóide estudados) [24], [25], [26] , em células de câncer bucal, medeia silenciamento CIP2A eficiente e, consequentemente, inibe a capacidade de invasão de células de câncer oral e crescimento independente de ancoragem.

resultados

O 599 Peptide Efetivamente Vinculado e entrega siRNAs em células orais do cancro

de forma a testar se o péptido 599, através do seu nona catiónico (D-arginina) resíduos pode eficazmente ligar-se ARNic carregados negativamente baseado em interacções electrostáticas, um ensaio de desvio em gel de agarose foi efectuada (Fig. 1). Usando várias quantidades do peptídeo 599, que varia de 1 a um excesso molar de 50 vezes de siRNAs, demonstrou-se que o péptido 599 poderia de facto ligar-se moléculas de ARNip concebidos para direccionar CIP2A (siCIP2A), retardando o siCIP2A a partir de um péptido-a- molar siRNA (P: N) proporção de 20:01, sem siRNAs livres detectáveis ​​no gel em 50:1. Na P: N rácios de 10:01, o peptídeo só tinha efeitos moderados na ligação siRNA, e às 01:01 foi completamente ineficaz

Um com brometo de etídio 4% ensaio de desvio em gel de agarose examinar a capacidade de. várias quantidades do peptídeo 599 (que varia de 1 a 50 vezes o excesso molar de siRNAs) para formar complexos com siCIP2A. siCIP2A, siRNA alvejando o oncogene CIP2A; MWM, marcador de peso molecular (o número de pares de bases para cada fragmento de ADN são mostradas)

Após a demonstração de que o péptido 599 poderia ligar-se a ARNic em P específica:. N proporções, temos em seguida examinada a capacidade do péptido a entregar siRNAs fluorescentemente marcadas em células cancerosas orais por análise de microscopia de fluorescência (Fig. 2A). Usando um siRNA fluorescentemente marcado, DY547 conjugado com siCIP2A (D-siCIP2A), em complexo com quantidades crescentes de 599 péptido, que varia de 1 a um excesso molar de 50 vezes de siRNAs, observou-se que o aumento da razão P: N reforçada a entrega de moléculas de siRNA em CAL 27 células de câncer bucal após duas horas de incubação. Mais especificamente, o 50:1 razão P: N foi demonstrado ter uma maior capacidade de induzir captação de siRNA em células em comparação com o P 20:01: N proporção que só teve um efeito moderado. Por outro lado, as células tratadas com D-siCIP2A isoladamente ou em complexo com um péptido a 599 01:01 razão P: N foram incapazes de absorção eficaz de siARN. medidas quantitativas de internalizado D-siCIP2A em CAL 27 células após 2,5 horas de incubação também corroborou que o aumento da 599 P: N rácios de aumento da captação de siRNA nas células. Em particular, o 50:1 e 100:1 P: N proporções apresentadas aproximadamente 18 e 42 vezes valores significativamente mais elevados de D-siCIP2A, respectivamente, em comparação com as células tratadas com D-siCIP2A sozinho (Fig. 2B). A título de comparação, o agente de transfecção comercial INTERFERin ™ (IFN), apenas entregues aproximadamente 2 vezes maior quantidade de D-siCIP2A, em comparação com as células tratadas apenas com D-siCIP2A. De nota, embora o 100:1 razão P: N foi capaz de fornecer a maior quantidade de siRNAs em células, induziu efeitos citotóxicos significativos a longo prazo, medidas usando um controle não-alvo siRNA (SINT) (Fig 2C). . Em particular, o 100:1 razão P: N reduziu significativamente a proliferação de células de 48 horas de pós-tratamento, em comparação com células não tratadas. Por outro lado, o 50:1 razão P: N não teve efeitos significativos sobre a citotoxicidade a longo prazo. Como resultado, com base nestas descobertas a 50:1 P:. Relação N foi usado para posterior caracterização e experimentação

(A) análise de microscopia de fluorescência CAL 27 células cancerosas orais incubadas durante 2 horas com DY547-conjugado siRNA alvejando CIP2A (D-siCIP2A; vermelho), isoladamente ou em complexo com quantidades crescentes de péptido 599 (variando de 1 a um excesso molar de 50 vezes de siRNAs). Núcleos (azul) foram contrastadas com DAPI. Barra de escala: 50 ^ m. (B) CAL 27 células foram incubadas durante 2,5 horas com D-siCIP2A por si só ou em complexo com quantidades crescentes de péptido 599 (variando de 1 a um excesso molar de 100 vezes de siRNAs). Para comparação, as células também foram transfectados utilizando o reagente de transfecção comercial, INTERFERin ™ (IFN). A quantidade de siRNA entregue nas células em pmol por mg de proteína é relatado com cada tratamento normalizadas para D-siCIP2A sozinho. Os dados são média ± EPM de quatro experiências separadas, onde *** P 0,001, ** P 0,01 comparado com D-siCIP2A células tratadas apenas com (ANOVA, teste de comparação múltipla de Dunnett). (C) Avaliação da toxicidade de longo prazo (tal como medido por um ensaio de proliferação celular) de CAL 27 células 48 horas pós-tratamento com um siRNA não segmentação (Sint) sozinho, concentrações crescentes de 599 péptido sozinho, ou quantidades crescentes de 599 péptido (variando de 1 a um excesso molar de 100 vezes de siRNAs) em complexo com Sint. Para comparação, as células também foram transfectadas com o reagente de transfecção comercial, IFN. As células não tratadas foram definidos como 100% viáveis. Os dados são média ± SEM realizadas em triplicado (n = 3), em que *** P 0,001, ** P . 0,01 em comparação com células não tratadas (ANOVA, teste de comparação múltipla de Dunnett)

Caracterização do 599 Peptide-siRNA complexo

Para obter insights sobre o mecanismo de entrada de célula do 599 /siRNA complexa, a localização subcelular do complexo 599 /D-siCIP2A foi ainda analisada em células vivas por microscopia de fluorescência acoplado com imagens de contraste de fase (Fig. 3A). Após uma inspeção mais próxima do internalizado D-siCIP2As, ele apareceu com base no padrão captação pontuada extensa de siRNAs que o complexo de 599 /D-siCIP2A estava sendo endocitado. Co-coloração de células fixas com o início EEA1 marcador endossomal, confirmou a co-localização de D-siCIP2As com vesículas endossomais (Fig. 3B), indicando, assim, um modo de internalização endocítica.

(A) microscopia de fluorescência análise e sobreposição de uma imagem de contraste de fase de CAL 27 células vivas orais cancerosas incubadas durante 2 horas com ARNsi DY547-conjugado de segmentação CIP2A (D-siCIP2A; vermelho) complexado com o peptídeo 599 a uma razão molar 50:1 péptido-a-siRNA. Barra de escala: 50 ^ m. (B) análise por microscopia de imunofluorescência indirecta de CAL 27 células cancerosas orais incubadas durante 2 horas com D-siCIP2A (vermelho) complexado com o peptídeo 599 a uma razão molar 50:1 péptido-a-siRNA. Endossomas (verde) foram coradas utilizando um anticorpo monoclonal de coelho anticorpo anti-EEA1. Núcleos (azul) foram contrastadas com DAPI. A co-localização de D-siCIP2A com endossomas (amarela) é observado no painel resultante da fusão e é enfatizada pelas setas. Barra de escala: 25 ^ M

Para avaliar o péptido 599 em termos de tamanho de partícula e carga de superfície após a complexação com siCIP2A tanto dispersão dinâmica de luz e as medições de potencial zeta foram realizadas. (Fig. 4A). Com base nas medições de, 96% das partículas formadas foram centrados a 74 nm e 4% a 220 nm pela distribuição do tamanho ponderadas pelo número, com o tamanho médio das partículas da população principal que é de 80 ± 0,5 nM. O potencial zeta do complexo 599 /siCIP2A foi determinada como sendo positivo com um valor de 32,5 ± 0,5 mV. O complexo de 599 /siCIP2A também foi visualizado usando iluminação óptica à base de campo escuro (Fig. 4B). Utilizando esta tecnologia de imagem do complexo 599 /siCIP2A foi encontrado para expor as estruturas esféricas relativamente uniformes.

(A), distribuição de tamanho e potencial zeta do péptido 599 complexado com siCIP2A a um molar 50:1 péptido-a-siRNA relação de 20 minutos após a formulação em água. Imagem de microscopia óptica do péptido 599 complexado com siCIP2A numa proporção 50:1 péptido-a-siRNA molar de 20 minutos após a formulação em água (B) em campo escuro à base. Barra de escala:. 10000 nm

Para testar a importância dos dois componentes de núcleo (isto é, do endossoma-disruptivas e nona-penetrante célula catiónico (D-arginina) porções de resíduos) para conferir a capacidade de o 599 péptido a entregar siRNAs em células, dois péptidos adicionais foram sintetizados consistindo de a sequência do endossoma interrupções (616) ou a nona catiónico de penetração celular (D-arginina) resíduos sozinho (9R). Após o tratamento de 27 células de CAL ou com o 599, 616, ou 9R péptidos em complexo com D-siCIP2A em um 50:1 razão P: N, microscopia de fluorescência análises revelaram que apenas o péptido intacto 599 tanto com o endossoma-disruptiva e catiónico nona de penetração celular (D-arginina) porções de resíduos poderia mediar a entrega de siRNAs em células, enquanto que ambos os 616 e 9R peptídeos não teve efeito aparente na entrega siRNA 2 horas pós-tratamento (Fig. 5).

a microscopia de fluorescência análises de CAL 27 células de cancro oral incubadas durante 2 horas com ARNsi DY547-conjugado de segmentação CIP2A (D-siCIP2A; vermelho) complexado com os péptidos 599, 616, e 9R numa proporção molar 50:1 péptido-a-siRNA. Núcleos (azul) foram contrastadas com DAPI. Barra de escala: 50 mm

O fracasso do péptido 616 para entregar os siRNAs em células foi muito provavelmente devido à sua incapacidade para se ligarem ao mesmo siRNAs P:. N razões tão elevadas quanto 100:1 (dados não mostrado). No entanto, o resultado com o péptido 9R foi de certa forma surpreendente, uma vez que foi demonstrado que se ligam eficazmente a uma siRNAs 50:1 razão P: N com base em um teste de desvio em gel de agarose (Fig. S1A) e pode formar partículas com um tamanho médio de 58,2 ± 0,2 nM e um valor de potencial Zeta de 25,8 ± 0,5 mV (Fig. S1B). Porque paraformaldeído fixação de células pode resultar na redistribuição de artefatual (Arg)

9 péptidos [27], foi possível que a distribuição celular do complexo 9R /D-siCIP2A pode ter sido afectado por este fixador químico. Portanto, a absorção de D-siCIP2A também foi avaliada usando a abordagem quantitativa independente de fixação que também foi encontrado que o péptido 9R, variando de 0,1 a um excesso molar de 100 vezes de siRNAs, era incapaz de mediar a entrega de siRNA em células e foi indistinguível células tratadas com D-siCIP2A sozinho (Fig. S1C).

o 599 Peptide medeia CIP2A silenciamento gênico em células de cancro oral

para o peptídeo 599 para ser considerado um veículo de entrega eficaz para siRNA- terapêutica com base, que deve ser capaz de fornecer os siRNAs funcionais em células que pode silenciar o seu gene alvo a que se destinam. Para avaliar a funcionalidade dos ARNis /complexo, duas linhas celulares de cancro orais 599, CAL 27 e SCC-25, foram tratados com o péptido 599 complexado com qualquer siCIP2A ou um controlo de Sint 50:1 numa razão P: N, após o que tanto o ARNm CIP2A e os níveis de proteína foram avaliadas 48 horas após o tratamento por PCR em tempo real e análise de transferência de Western, respectivamente. A determinação quantitativa por PCR em tempo real demonstrou um knockdown significativa nos níveis de ARNm CIP2A em ambas as linhas celulares de cancro orais tratados com o 599 /siCIP2A complexo em comparação com as células tratadas controlar 599 /sint (Fig. 6A). Mais especificamente, observou-se uma redução de -60% e -85% nos níveis de ARNm em CIP2A CAL 27 e SCC-25 linhas celulares de cancro por via oral, respectivamente. Além disso, análises de Western blot confirmou a capacidade do péptido 599 para mediar a entrega de siRNAs funcionais em ambas as linhas celulares com a demonstração da supressão de níveis de proteína CIP2A 48 horas pós-tratamento com o 599 /siCIP2A complexo em comparação com o controle 599 /células tratadas sint ( A Fig. 6B). É de notar que os níveis de proteína oncogénica do factor de transcrição de c-Myc foram também avaliadas porque CIP2A é conhecido por regular a estabilidade da proteína [25]. A análise Western blot confirmou que o silenciamento de CIP2A causou desestabilização de c-Myc em ambas as linhas celulares (Fig. 6B).

(A), em tempo real A análise de PCR dos níveis de ARNm em CIP2A CAL 27 e SCC-25, por via oral células cancerosas 48 horas pós-tratamento com 599 de péptidos complexados a uma razão 50:1 péptido-a-siRNA molar de 100 nM de siRNA alvejando CIP2A (siCIP2A) em comparação com controlo não segmentação de siRNA (Sint). Os níveis de ARNm foram normalizados para CIP2A rRNA 18S. Os dados são média ± SEM de três experiências separadas realizadas em triplicado, onde ** P 0,01 comparado com células tratadas sint (teste t de Student). (B) as análises de transferência de Western dos níveis de expressão de proteína CIP2A e c-myc em CAL 27 e SCC-25 células de cancro oral 48 horas pós-tratamento com 599 péptido complexado com 100 nM, quer de Sint ou siCIP2A a um péptido-a 50:1 -siRNA razão molar. Os níveis de proteína GAPDH foram monitorados para garantir a igualdade de carregamento de amostras.

Caracterização da 599 /siCIP2A Complexo Mediada por RNAi Response

Em um esforço para caracterizar ainda mais 599 silenciamento mediado por peptídeo de CIP2A em células cancerosas por via oral a duração de silenciamento do gene, o silenciamento de genes dependente da dose, e a actividade de silenciamento no soro também foram avaliados. A implementação bem sucedida de RNAi como uma forma de terapia depende dessas três características fundamentais. Assim, num esforço para determinar a persistência de 599 silenciamento mediado por péptidos, de CIP2A em células cancerosas orais ao longo do tempo, uma análises de Western blot de CIP2A níveis de expressão de proteína em CAL 27 e 25 SCC-células de cancro oral 1, 3, 5, 7 , foram realizadas e 9 dias pós-tratamento com 599 péptido complexado com qualquer um ou sint siCIP2A a uma razão molar 50:1 péptido-a-siARN (Fig. 7A). Após um único tratamento com 599 /siCIP2A, observou-se o efeito de silenciamento para a duração de 5 dias em células CAL-27 e até 9 dias em células SCC-25 com o máximo de silenciamento que ocorrem durante 3 e 7 dias, respectivamente. Em experiências de dose-resposta em células SCC-25 (Fig. 7B), observou-se o péptido 599 para conferir siCIP2A silenciamento mediado dependente da dose, com concentrações de ARNip @ 50 nM de proteína que confere CIP2A -100% knockdown e concentrações de ARNip tão baixo quanto 20 nM continua a ter efeitos de silenciamento mensuráveis. Resultados semelhantes foram observados em células CAL 27 (dados não mostrados), excepto que as concentrações mais elevadas de siRNA (≥80 nm) foram necessários para conferir a melhor ~ 90% silenciamento proteína CIP2A. Por fim, porque a estabilidade de ARNic é uma preocupação importante na RNAi-terapia, 599 mediada por péptido silenciamento CIP2A foi avaliada na ausência e na presença de soro e comparação com vários reagentes catiónicos convencionais disponíveis comercialmente à base de lípidos de transfecção (fig. 7c). Após o tratamento das células SCC-25 com 599 /siCIP2A, proteína CIP2A -95% foi derrubado na ausência de uma entrada inicial de soro e foi comparável ao silenciamento CIP2A observada para todos os reagentes de transfecção à base de lípidos catiónicos testados ( 99%) HiPerFect® excepto que exibiu apenas uma redução de -30% nos níveis de proteína. De importância, no entanto, é que, mesmo na presença de soro, do complexo 599 /CIP2A ainda pode produzir uma resposta ARNi muito eficaz em ~ 70% knockdown proteína CIP2A. A quantificação destes dados foram baseados na análise densitométrica de três experiências independentes utilizando Western blot programa Image J [28].

(A), análises de Western blot de CIP2A níveis de expressão de proteína em CAL 27 e SCC-25, por via oral células cancerosas 1, 3, 5, 7 e 9 dias pós-tratamento com 599 peptídeo complexado, quer 100 nM de controle não-targeting siRNA (SINT) ou siRNA segmentação CIP2A (siCIP2A) a uma 50:1 peptídeo-to-siRNA proporção molar. Os níveis de proteína GAPDH foram monitorados para garantir a igualdade de carregamento de amostras. (B) Análise de transferência de Western de proteína knockdown CIP2A em SCC-25 células de cancro oral 48 horas pós-tratamento com 599 peptídeo sozinho (5 uM) ou complexados a uma razão molar 50:1 péptido-a-siRNA para qualquer sint (100 nM ) ou concentrações decrescentes de siCIP2A. Os níveis de proteína CIP2A em células não tratadas foram também analisadas para comparação. Os níveis de proteína GAPDH foram monitorados para garantir a igualdade de carregamento de amostras. (C) análises de Western blot de proteínas CIP2A knockdown em SCC-25 células de cancro oral 48 horas pós-tratamento com 599 de péptidos complexados, quer 100 nM de Sint ou siCIP2A a uma razão molar 50:1 péptido-a-siRNA, na presença (+) ou ausência (-) de soro, em comparação com células não tratadas ou células tratadas com os reagentes de transfecção comerciais Lipofectamine® RNAiMAX (RNAiMAX), Lipofectamine® 2000 (LF2000), INTERFERin ™ (IFN), e HiPerFect®. Os níveis de proteína GAPDH foram monitorados para garantir a igualdade de carregamento de amostras.

O 599 Peptide-Mediated silenciamento de CIP2A Diminui Oral Invasividade Cancer Cell e Crescimento

Anchorage-Independent

literatura publicadas anteriormente demonstrou que silenciamento CIP2A em células cancerígenas derivadas de diferentes tecidos, como HNSCCs, carcinomas das células renais, o cancro da mama e pode ter efeitos sobre a invasão de células cancerosas e o crescimento independente de ancoragem [25], [29], [30]. Assim, para demonstrar adicionalmente a utilidade potencial do péptido 599 na terapêutica à base de ARNsi para o cancro oral, testámos se 599 silenciamento mediado por péptidos, de CIP2A poderia afectar a capacidade de invasão e propriedades de crescimento independente de ancoragem de células de cancro oral. Devido ao facto de que as células CAL 27 apresentava apenas um efeito silenciador breve e não crescem bem em meio semi-sólido [31], os efeitos CIP2A 599 silenciamento mediado-péptido na invasão celular e crescimento independente de ancoragem, apenas foram testados em SCC- 25 células. No momento do tratamento de células SCC-25 com o péptido 599 complexado com siCIP2A, observou-se uma inibição significativa ~33% na capacidade de invasão de células, em comparação com as células tratadas controlar 599 /sint (Fig. 8A). Além disso, 599 silenciamento de CIP2A péptido mediada em células SCC-25 reduziu significativamente o crescimento independente de ancoragem por ~39% comparado com o controlo 599 /Sint células tratadas (Fig. 8B). Juntos, estes resultados demonstraram a capacidade do péptido 599 para funcionar como um veículo de entrega eficaz para a terapêutica do cancro orais à base de siRNA.

(A) A quantificação da percentagem de invadir SCC-25 células de cancro oral após tratamento com 599 péptido complexado a uma razão 50:1 péptido-a-siRNA molar de 100 nM de siRNA alvejando CIP2A (siCIP2A) em comparação com controlo não segmentação de siRNA (Sint). Os dados são média ± EPM de quatro experiências separadas, onde * P 0,05 comparado com células tratadas sint (teste t de Student). (B) o crescimento ancoragem independente dos SCC-25 células de cancro oral após o tratamento com o péptido 599 complexados a uma razão molar 50:1 péptido-a-siRNA para 100 nM de siCIP2A em comparação com o controlo Sint. Os dados são média ± EPM de quatro experiências separadas, onde * P . 0,05 em comparação com células tratadas sint (teste t de Student)

Discussão

Para tecnologias baseadas em RNAi para ser eficaz terapias, que requerem a entrega intracelular eficiente de siRNAs terapêuticos para o citoplasma das células. No entanto, porque a maioria entrega abordagens tráfego de carga siRNA em células através de endocitose, o aprisionamento de estas moléculas dentro das vesículas de endocitose tornou-se um importante passo limitante [11], [12] e, assim, uma barreira para a utilização eficaz de terapias baseadas em RNAi. Para contornar este problema, desenhado e testado um péptido, denominado 599, que consistiu em parte as sequências de ambos um CPP altamente eficiente e o péptido-desestabilizar endossoma INF-7 que, quando combinado permitiria a entrega efectiva da carga de siRNA complexado nas células. Os resultados do nosso estudo demonstraram que o peptídeo 599 poderia aumentar a biodisponibilidade intracelular de siRNAs em células de câncer oral e efetivamente mediar o silenciamento da CIP2A alvo oncoproteína com consequente inibição da capacidade de invasão de células de câncer oral e crescimento independente de ancoragem.

porque covalente conjugação de siRNAs para PPLs pode resultar na distribuição ineficiente de siRNAs funcionais de células [18], [32], [33], o ptido 599 foi concebido para incluir nona catiónico (D-arginina) resíduos que funcionariam não apenas como o componente CPP, mas também permitem que não covalente de moléculas de ligação de ARNip carregadas negativamente ao péptido através de interacções carregadas. ensaios de desvio em gel de agarose confirmou que o péptido 599 poderia complexo de moléculas de siRNA e que a ligação entre o péptido e os siRNAs 599 pareceu ser dependente da nona resíduos (D-arginina). Isto foi particularmente evidente com base no facto de o peptídeo 616, que apenas incluía a sequência do péptido de INF-7 altamente aniónica, não se podia ligar siRNAs.

investigação para saber se a formação do complexo péptido-599 siARN foi suficiente para induzir a internalização dos ARNic em células, revelou que o aumento da P: N rácios resultaria no aumento da absorção de siRNA em células após duas horas de tratamento em comparação com as células tratadas com INTERFERin ™ ou siRNA nu. Estes resultados eram consistentes com vários outros estudos que também foi encontrado que o aumento das concentrações de PPLs específicos aumentou a sua capacidade absorção siRNA [20], [23]. O aumento da captação de ARNic em células provavelmente ocorreu em maior P: N proporções com base em vários factores. Em primeiro lugar, porque quanto maior P: N proporções foram mais eficazes na ligação de siRNAs livre em solução, como era evidente através dos ensaios de desvio em gel de agarose, isto em-parte teria contribuído para maiores quantidades de siARN a ser internalizado nas células. Em segundo lugar, porque o tratamento de células com elevadas concentrações extracelulares de PPLs tem sido relatado para induzir a sua internalização em células através da activação de endocitose [34], o aumento da captação de ARNic em células com maior P: N rácios pode também ter sido atribuído à presença de quantidades maiores do péptido 599 que seria mais eficaz desencadear a endocitose do complexo.

internalização

CPP-mediada em células é impulsionado por resíduos catiónicos encontrados dentro de sua sequência e este processo tem sido relatada a ocorrer através de várias formas de endocitose [18]. No nosso estudo, o péptido 599 Observou-se que medeiam a internalização de siRNAs dentro das primeiras duas horas para vesículas endocíticas e remoção da nona (D-argininas) a partir do péptido 599, tal como representado pelo péptido de 616, confirmado o requisito de catiónico resíduos para a entrega de siRNA carga. Surpreendentemente, o péptido 9R que consistia apenas de Nona catiónico (D-arginina) resíduos foi igualmente incapazes de entregar os siRNAs em células, embora pudesse formar complexos com ARNsi.