Abstract

Fundo

proliferador de peroxissoma activado receptor gama (PPAR) agonistas, tais como os tiazolinedionas (TZDs), foram estudados para a sua utilização potencial como agentes terapêuticos do cancro. Nós investigamos o efeito de quatro TZDs com rosiglitazona (Rosi), ciglitazona (CGZ), troglitazona (TGZ) e pioglitazona (Pio) -on a proliferação de células de cancro do ovário, expressão PPAR e da atividade repórter luciferase PPAR. Nós exploramos se TZDs agir de forma dependente ou independente PPAR, utilizando abordagens moleculares para inibir ou sobre-expressar actividade PPAR.

principais conclusões

O tratamento com CGZ ou TGZ por 24 horas diminuição da proliferação em três ovário linhas celulares de cancro, OVCAR3, CaOv3, e SKOV3, enquanto Rosi e Pio teve nenhum efeito. Esta diminuição na proliferação de células OVCAR3 foi devido a uma maior fracção das células no G

0 /L

uma fase do ciclo celular. CGZ e TGZ tratamento aumentou a apoptose após 4 horas de tratamento, mas não após 8 ou 12 horas. O tratamento com TGZ ou CGZ aumento da expressão de mRNA de PPARy em células OVCAR3; No entanto, os níveis de proteína mantiveram-se inalterados. Surpreendentemente, os ensaios de luciferase do promotor revelou que nenhum dos TZDs aumento da actividade de PPARy. A sobre-expressão de PPARy tipo selvagem aumentou a actividade repórter. Este foi ainda mais aumentada por TGZ, Rosi, e Pio indicando que estas células têm a capacidade endógena de mediar PPARy transactivação. Para determinar se o PPARy medeia a redução induzida por TZD em proliferação, as células foram tratadas com CGZ TGZ ou na ausência ou presença de um negativo dominante (DN) de tipo selvagem ou a sobre-expressão de PPARy construir. Nem vector alterou a proliferação de células mediada por TZD sugerindo que este efeito de TZD em células de cancro do ovário pode ser independente PPARy.

Conclusões

e CGZ TGZ causar uma diminuição na proliferação de células do cancro do ovário que é PPARy independente. Este conceito é suportado pela descoberta de que um DN ou a sobre-expressão do tipo selvagem PPAR não afetou as mudanças na proliferação celular e ciclo celular

Citation:. Al-Alem L, Southard RC, Kilgore MW, Curry TE (2011) específico da linha celular tiazolidinedionas Inibição do cancro do ovário Proliferação e causar interrupção do ciclo celular em uma forma independente PPAR. PLoS ONE 6 (1): e16179. doi: 10.1371 /journal.pone.0016179

editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos

Recebido: 17 Agosto, 2010; Aceito: 14 de dezembro de 2010; Publicação: 21 de janeiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Al-Alem et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (números de concessão CA95609, HD057446 e RR15592). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a quinta maior causa de morte por câncer em mulheres. Dos três tipos principais de câncer de ovário (epitelial, células germinativas, e cordão sexual cancros do estroma), contas de câncer epitelial de ovário para cerca de 90% de todos os casos, e é a primeira causa de morte por doenças malignas ginecológicas [1], [2] . Apesar da intensa pesquisa sobre o câncer de ovário com novas metas sendo constantemente investigados, metas de tratamento permanecem escassos. Um dos desafios na investigação do cancro do ovário é a ausência de um modelo animal experimental que recapitula a doença humana que pode ser experimentalmente manipuladas [1], [3]. Assim, as linhas celulares de cancro do ovário foram empregues para compreender os processos fundamentais envolvidos no crescimento de células de cancro, a diferenciação e a proliferação. O presente estudo utilizou três células de cancro do ovário, OVCAR3, CaOv3 e SKVO3, que são derivadas de cancro epitelial de ovário humano [4], [5] para explorar novas modalidades terapêuticas em crescimento de células de cancro e proliferação.

Um dos os alvos terapêuticos sob investigação para o câncer de ovário é receptores nucleares. As drogas que inibem ou activam os receptores nucleares têm sido utilizados para tratar muitas doenças. receptores nucleares Na verdade, cerca de 13% das drogas atualmente no mercado-alvo [6]. PPARy é um receptor nuclear altamente conservado [7], expressa em todo o corpo [8] e é sobre-expresso em muitos cancros, incluindo cancro da mama e do ovário, tornando-se um jogador potencialmente importante no desenvolvimento do cancro.

endógena ligantes PPAR ainda são desconhecidas, mas os candidatos bem caracterizados incluem ácidos graxos poliinsaturados, prostaglandina J

2 (PGJ

2) e ácido araquidônico [9]. ligandos de PPAR sintéticos incluem as tiazolidinedionas (TZDs), que consistem de rosiglitazona (Avandia), troglitazona (Rezulin®), pioglitazona (Glustin ® /ACTOS ®), e ciglitazona, todos os quais foram desenvolvidos e /ou utilizados para tratar tipo diabetes II [10], [11], [12]. O uso de TZDs como uma abordagem terapêutica em cancro tem sido investigada, mas os resultados têm sido controverso [13], [14], [15]. Neste estudo foram utilizadas abordagens moleculares, fisiológicos e farmacológicos para investigar o efeito dos quatro TZDs diferentes em células de câncer de ovário e de determinar se estes efeitos são PPAR dependente ou independente.

Resultados

OVCAR3, linhas celulares de cancro do ovário CaOv3 e SKOV3 expressar PPAR

a fim de determinar se as células de câncer de ovário expressam o PPARy, PCR em tempo real e análise de western blot foi realizada. Não havia expressão de PPARy diferencial nas três linhas de células diferentes, tanto no ARNm e os níveis de proteína. Enquanto a expressão de mRNA de PPARy foi mais elevada em células SKOV3 (Figura 1A), as células SKOV3 apresentou os menores níveis de proteína de PPARy (Figura 1B). Em contraste, OVCAR3 tinham baixos níveis de expressão de mRNA de PPARy mas a expressão abundante da proteína de PPARy (Figuras 1A e 1B, respectivamente). actividade de PPARy em três linhas de células foi examinada utilizando células transfectadas com um 3XPPRE-Luc-

Renilla

construir e em comparação com células transfectadas com luciferase e

Renilla

construções que falta o PPRE. OVCAR 3 células exibiram actividade de cerca de duas vezes mais PPRE endógena comparada com as células CaOv3, enquanto que as células SKOV3 mostrou 50% mais PPRE actividade em comparação com células OVCAR3 (Figura 1C).

(A), a expressão de ARNm (B) A expressão de proteínas e (C) PPRE actividade de luciferase. Os dados foram normalizados para níveis de expressão de PPARy e actividade em células OVCAR3. Os resultados são a média ± SEM para, pelo menos, 3 medições a partir de três experiências individuais. Bares que não compartilham a designação de letra são significativamente diferentes (

p Art 0,05). As células transfectadas com Luc e de Renilla constrói falta PPRE (PPRE -) eram significativamente mais baixa do que a mesma linha celular transfectada com PPRE-luciferase de Renilla constrói (PPRE +) pelo teste t de Welch (

P

0,05) .

ácido retinóico receptor (RXR) não é um fator limitante na atividade PPAR

PPAR se liga ao seu parceiro heterodimérico RXR antes de se ligar ao DNA [16]. RXR é conhecido por ser expresso constitutivamente em células e tem sido demonstrado para heterodimerizar com outros receptores para além de PPARy, tais como o receptor da vitamina D [17]. Para RXR para ser ativado, o seu ligando 9-

cis

ácido retinóico (9-

Cis

-RA) precisa estar presente. A fim de garantir que activado RXR não é um fator limitante em nossos experimentos, as células foram tratadas com 9-

Cis

-RA. Nestas experiências, as células foram transfectadas com diferentes construções de PPARy incluindo Δ467 que é um negativo dominante (DN) forma de PPARy [18], [19], bem como um sobre a forma de expressão de tipo selvagem de PPARy (OE), que é usado para aumentar expressão de PPARy. Uma forma DN do PPARy foi usado ao longo destes estudos com base em experiências iniciais que revelaram que DN transfecção diminuiu a actividade PPRE 40% abaixo dos níveis em células transfectadas com shRNA PPARy (dados não mostrados). A fim de assegurar que sobre-expressa o PPARy se quer sob a forma DN ou OE em comparação com células de controlo (isto é, as células transfectadas com PGL3), a expressão da proteína de PPARy foi medido usando análise de Western blot. Como esperado, houve uma indução marcada de tanto a forma DN e OE de PPAR (Figura 2A inserção). Após a transfecção com o controlo, DN ou oe vector, as células foram subsequentemente tratadas com controlo de veículo ou 1 uM de 9-

Cis

-RA durante 24 horas no escuro. Observou-se que a presença de 9-

Cis

-RA não afectou a actividade do ensaio de repórter de PPARy em células OVCAR 3, indicando que o RXR activado não é um factor limitante nesta linha celular (Figura 2A). A adição de 9-

Cis

-RA para células CaOv3 não alteram a actividade PPRE até PPARy foi sobre-expresso (Figura 2B), sugerindo que o RXR activado não é taxa de limitar até PPARy é altamente abundante nesta linha celular. Surpreendentemente, em células SKOV3, 9-

Cis

-RA aumentou o ensaio da actividade de repórter PPARy em células de controlo (PGL3), mas não teve nenhum efeito quando PPAR foi mais expresso em relação ao controle (Figura 2C).

as células foram duplo transfectadas com uma construção PPRE e uma das seguintes opções: vazio vetor (PGL3), forma DN de PPAR (DN) ou forma de tipo selvagem de PPAR (OE). Após as transfecções duplas, as células foram tratadas durante 24 horas com o controlo de veículo (DMSO) ou 1 uM de 9-

Cis

-RA no escuro. PPRE actividade da luciferase é ilustrado por (A) OVCAR3, (B) CaOv3, e (C) SKOV3. Os controlos representam células que foram transfectadas com o vector vazio e de controlo tratados com veículo, como mostrado na primeira barra em cada painel. Os resultados para o ensaio de luciferase PPRE são as médias ± SEM de pelo menos 9 medições. Bares que não compartilham a designação de letra são significativamente diferentes (

p Art 0,05). Insira Painel A: Western blot da proteína PPAR em células OVCAR3 dupla transfectadas com uma construção PPRE e quer vazio vector, construções DN ou OE PPAR e tratados com veículo de controlo durante 24 horas

CGZ e TGZ causa. uma diminuição na proliferação celular

para definir os efeitos dos ligandos PPARy sobre a proliferação celular, foram realizados ensaios de MTS. células OVCAR3 foram tratados com concentrações de 0, 0,1, 1 ou 10 uM de Rosi, CGZ, TGZ ou Pio durante 24 horas. A concentração máxima de TZD utilizada foi de 10 uM vez que as acções específicas de PPARy são relatados com TZDs em concentrações ≤10 uM [20] e as concentrações mais elevadas são conhecidos para induzir a morte de células [21]. A administração das quatro TZDs resultou em diferenças na proliferação celular. O tratamento com CGZ diminuição da proliferação de 80%, TGZ causou uma diminuição de 65%, enquanto Rosi e Pio teve nenhum efeito sobre a proliferação das barras pretas (Figura 3A-D). Em um esforço para entender se a diminuição da proliferação após o tratamento TZD é comum em outras células de cancro do ovário, o tratamento TZD de CaOv3 e SKOV3 foi explorada. Uma diminuição semelhante na proliferação foi observada nestas linhas celulares quando tratados com CGZ e TGZ a 10 uM. CaOv3 células mostram uma diminuição de 80% e 30% da proliferação celular quando tratada com CGZ e TGZ, respectivamente (Figura 3A-B). células SKOV3 mostram um 45% e 35% de redução quando tratados com 10 uM e CGZ TGZ, respectivamente (Figura 3A-B). Semelhante a células OVCAR3, células SKOV3 CaOv3 e tratados com Rosi Pio ou não exibem uma alteração na proliferação (Figura 3C-D).

células de cancro do ovário foram privadas de soro durante 24 horas e tratou-se durante mais 24 horas com controlo de veículo (DMSO) ou 0,1, 1,0 ou 10 uM de CGZ (A), TGZ (B), Rosi (C), ou Pio (D). A proliferação celular foi avaliada por meio do ensaio de MTS. Os resultados são a média ± SEM para, pelo menos, 3 medições a partir de três experiências individuais. A análise estatística foi realizada dentro de cada linha de células. Bares que não compartilham a designação de letra são significativamente diferentes dentro de um grupo de tratamento (

p Art 0,05). Barras pretas: OVCAR3, cinza: CaOv3, cinza claro:. SKOV3

CGZ e diminuição TGZ BrdU DNA incorporação

O ensaio mede a atividade mitocondrial MTS nas células, o que é indicativo de sua viabilidade [22] e considerada uma avaliação indirecta da proliferação celular. No entanto, existe um relatório que a TZD pode interferir com o ensaio de MTS [23]. Por isso, nós também mediu a taxa de replicação do ADN em células OVCAR3 utilizando a incorporação de BrdU como um outro índice de proliferação de células. células OVCAR3 foram tratados com 0, 0,1, 1 ou 10 uM de Rosi, CGZ, TGZ ou Pio durante 24 horas. Os ensaios de BrdU mostram resultados semelhantes às do ensaio de MTS. Houve uma diminuição de aproximadamente 70% na proliferação em células tratadas com 10 pM de CGZ ou TGZ, e nenhum efeito de Rosi Pio ou sobre a proliferação celular (Figura 4A-D).

células OVCAR3 foram privadas de soro durante 24 horas e tratou-se durante mais 24 horas com o controlo de veículo (DMSO) ou 0,1, 1,0 ou 10 uM de CGZ (a), TGZ (B), Rosi (C), Pio (D). A proliferação celular foi avaliada por meio do ensaio BrdU. Os resultados são a média ± SEM para, pelo menos, 3 medições a partir de três experiências individuais. Bares que não compartilham a designação de letra são significativamente diferentes dentro de um grupo de tratamento (

p Art 0,05).

expressão de mRNA de PPARy é reforçada pelo tratamento TZD de células de cancro do ovário

Para avaliar a associação desses ligantes com regulação da PPAR, que examinou o efeito de TZDs na expressão de PPARy em células OVCAR3. As células foram tratadas com ou sem 10 uM de TZD e mRNA de PPARy e os níveis de proteína foram analisados ​​24 horas mais tarde. PPAR (expressão foi aumentado em células OVCAR3 tratados com CGZ (6,9 vezes) e TGZ (18,1 vezes) (Figura 5A). Surpreendentemente, houve um aumento na proteína PPAR (seguindo Rosi mas não CGZ ou tratamento TGZ (Figura 5B). Em Num esforço para explicar esta discrepância entre o ARNm e a expressão da proteína, foi investigado um curso de tempo de PPAR (ARNm e a expressão de proteína. as células foram tratadas com os diferentes TZDs para 4, 8, 12 ou 24 horas e ambos PCR em tempo real e análise de Western blot foram realizados. não foi observada uma correlação entre os padrões de expressão para o PPAR (ARNm e proteína ao longo do tempo o que indica que existem potencialmente outros mecanismos que afectam os níveis de PPAR (proteína nestas células. uma possibilidade é que o TZDs aumentar o volume e degradação de PPAR (proteína como visto em outros sistemas [24], [25].

mARN de PPARy e expressão da proteína foram medidos em células OVCAR3 utilizando (a) PCR em tempo real e (B) análise por western blot após TZD . tratamento as células foram privadas de soro durante 24 horas e tratou-se durante mais 24 horas com o controlo de veículo (DMSO) ou um dos seguintes: 10 mM de Rosi, CGZ, TGZ, ou Pio. Os resultados são a média ± SEM para, pelo menos, 3 medições a partir de duas experiências individuais. Bares com diferentes expoentes são significativamente diferentes (

p Art 0,05).

Desde CGZ e TGZ causou uma diminuição na proliferação celular em células CaOv3 e SKOV3, medimos a expressão de mRNA de PPARy nestas células. Em células CaOv3, a expressão de mRNA de PPARy e depois CGZ TGZ tratamento foi de 3,6 e 4,4 vezes acima do controlo de veículo, respectivamente, embora estas alterações não atingiu significância. células SKOV3 não mostraram alterações na expressão de PPARy após o tratamento com as TZDs (dados não mostrados). Coletivamente, os nossos dados indicam que PPAR (mRNA está presente e é regulada por TZDs em células de câncer de ovário ainda que em diferentes graus, dependendo do tipo de célula e o ligante usado para ativar PPARg.

CGZ e TGZ não induzir a apoptose

neste e em subsequentes experiências foram examinados apenas células OVCAR3 como estas células mostraram os efeitos mais notáveis ​​quando tratados com TZD. Além disso, estas células são normalmente utilizados no estudo do cancro do ovário, facilitar a comparação com estudos anteriores. em uma tentativa de melhor compreender o mecanismo de mediar a diminuição na proliferação de células, nós examinamos se a apoptose contribui para essa diminuição. observou-se uma diminuição na proliferação de células após 24 horas de tratamento (Figuras 3 e 4). Se esta diminuição é devida a apoptose, então esta morte celular deveria ter ocorrido em um ponto de tempo anterior. Assim, nós examinamos o efeito de TZDs sobre células OVCAR3 e determinar se as células eram ou viável ou submetidos a apoptose e foram mortos em 4, 8 ou 12 horas após o tratamento usando análise FACS. Houve um ligeiro aumento das células apoptóticas e mortos após 4 horas de tratamento com CGZ e TGZ (Figura 6A). No entanto, este aumento não foi detectado em amostras tratadas durante 8 ou 12 horas (Figura 6B e 6C). Trypan Blue experiências para confirmar vivo contra células mortas apresentaram resultados semelhantes (dados não mostrados).

células OVCAR3 foram privadas de soro durante 24 horas e tratou-se com o controlo de veículo (DMSO) ou 10 pM de CGZ ou TGZ para (A ) 4 horas, (b) de 8 horas, ou (c) 12 horas. Os resultados são a média ± SEM de 3 medições a partir de três experiências individuais. barras cinza claro representam células viáveis; barras cinzentas escuras representam células que sofrem apoptose precoce e tardia, bem como aqueles que estão mortos. Bares que não compartilham uma carta ou designação número são significativamente diferentes (

p Art 0,05)

CGZ e TGZ causa interrupção do ciclo celular

Em um. tentativa de esclarecer a razão subjacente a diminuição na proliferação, os efeitos da TZD na progressão do ciclo celular foram também avaliadas. Um aumento significativo em células em G

0 /L

1 fase foi observado após tratamento com TGZ e CGZ (Figura 7A). CGZ administração resultou numa diminuição significativa na fase G2 /M do ciclo celular (Figura 7B), enquanto que não há alterações na fase S foram vistos em células tratadas com CGZ ou TGZ (Figura 7C). As células tratadas com Rosi ou Pio não mostraram qualquer alteração na distribuição do ciclo celular em comparação com o controlo (dados não apresentados).

células OVCAR3 foram privadas de soro durante 24 horas e tratou-se durante mais 24 horas com o controlo de veículo (DMSO ) ou 10 mM de CGZ ou TGZ. (A) L

0 /L

1, (B) L

2, (C) a fase S. Os resultados são a média ± SEM para, pelo menos, 3 medições a partir de três experiências individuais. Bares que não compartilham uma carta ou designação número são significativamente diferentes (

p Art 0,05).

Efeitos de TZDs sobre a atividade de luciferase PPRE

Para esclarecer se os efeitos de prisão antiproliferativa e do ciclo celular vistos com determinados TZDs são um efeito direto da PPAR transativação, nós transitoriamente células com um plasmídeo 3XPPRE-MTK-pGL3-repórter transfectadas. Duas construções adicionais foram co-transfectadas, isto é, uma forma de PPARy DN e uma sobre-expressão (OE) de uma construção de tipo selvagem PPARy. As células foram então tratadas durante 24 horas com 10? M de Rosi, CGZ, TGZ, ou Pio. Nenhum dos tratamentos por si só aumentou a actividade TZD PPRE (Figura 8). No entanto, as células transfectadas com DN mostraram uma diminuição de aproximadamente 40% na actividade mediada PPRE em ambas as células tratadas não tratados e TZD. Além disso, o aumento da expressão do tipo selvagem PPARy mostrou um aumento na actividade de luciferase quando as células foram tratadas com qualquer dos quatro TZDs diferentes em comparação com as células que só foram tratadas com TZDs (Figura 8A-8D).

OVCAR3 as células foram duplamente transfectadas com uma construção PPRE e uma das seguintes opções: vetor vazio, DN, ou OE PPAR. Após as transfecções duplas, as células foram tratadas durante 24 horas com o controlo de veículo (DMSO) ou de 10 uM de (A) CGZ, (B) TGZ, (C) Rosi, (D) ou Pio. Os resultados são a média ± SEM para, pelo menos, 3 medições a partir de três experiências individuais. Bares que não compartilham a designação de letra são significativamente diferentes (

p Art 0,05).

Análise de TZD mediada acções dependentes e independentes PPAR

A fim para determinar se os efeitos das TZDs são dependentes de PPARy, as células foram tratadas com 10? M TZDs na ausência ou na presença de antagonistas de PPAR (GW9662, T007). O ensaio MTS foi realizado a fim de determinar se a presença de antagonistas pode inverter os efeitos da TZD na proliferação de células de cancro do ovário. Os resultados mostraram que havia um “salvamento” parcial quando as células foram tratadas com o GW9662 (Figura 9A) ou os compostos em combinação com CGZ ou TGZ T007 (Figura 9B). No entanto, o padrão de acção era inconsistente entre os dois antagonistas e mesmo com o mesmo antagonista na presença de diferentes TZD. Por exemplo, T007 foi capaz de bloquear completamente os efeitos da CGZ sobre a proliferação celular, mas não teve nenhum efeito sobre a diminuição mediada TGZ em proliferação. Além disso, a utilização do GW9662 ou compostos T007 por si só não afectou a proliferação por si próprios, como era esperado. Isto pode ser devido ao facto de que estes antagonistas podem ser misturados ou não agonistas PPARy específica [9], [26]. Estas descobertas indicam que a utilização de uma abordagem farmacológica empregando antagonistas PPARy relatados por si só não responder à questão de saber se o efeito de as TZDs agir através de PPARy. Isso nos levou a usar uma abordagem molecular utilizando DN ou OE PPAR constrói para investigar se os efeitos observados sobre a proliferação celular e ciclo celular foram PPAR dependentes ou independentes.

As células foram tratadas com GW9662 (A) ou T007 (B ) durante 24 h e a proliferação celular foi avaliada. Os resultados são a média ± SEM para, pelo menos, 4 medições. Bares que não compartilham a designação de letra são significativamente diferentes (

p Art 0,05).

transfecção de células com DN ou OE formas de PPAR sem a presença de ligantes não mudou a proliferação de células, tal como indicado por ensaios de BrdU (Figura 10). Mais importante ainda, os efeitos de CGZ TGZ e sobre a proliferação não foram superados pela presença da forma DN de PPARy (Figura 10). Os ensaios de luciferase foram executados em amostras nas mesmas placas, a fim de assegurar que as células estavam a ser transfectada e expressão do DN causou o decréscimo esperado, enquanto a sobre-expressão de PPARy tipo selvagem aumentou actividade PPRE, respectivamente (dados não mostrados). Em concordância com os ensaios de BrdU, os dados do ciclo celular também indicam que o efeito de CGZ TGZ e não são dependentes de PPARy (dados não mostrados).

células OVCAR3 foram duplamente transfectadas, privadas de soro durante 24 horas e tratou-se para uma adicional de 24 horas com o controlo de veículo (DMSO) OR10 uM de CGZ ou TGZ. A proliferação celular foi avaliada com um ensaio BrdU. Os resultados são a média ± SEM para pelo menos 9 medições a partir de três experiências individuais. Bares que não compartilham a designação de letra são significativamente diferentes dentro de um grupo de tratamento (

p Art 0,05).

Discussão

TZDs foram mostrados para ter uma ampla variedade de efeitos sobre as células cancerosas. O alvo presumida de TZD, PPARy, é sobre-expresso numa variedade de cancros, incluindo o da mama, do pulmão, do cólon, da próstata e dos ovários [2], [27], [28], [29]. Embora, os exatos TZDs função e PPAR jogar no câncer de ovário ainda é desconhecida, este estudo demonstra que CGZ e TGZ têm ações anti-proliferativa em três linhas celulares de cancro do ovário, enquanto que Rosi e Pio não têm nenhum efeito. O facto de estas acções anti-proliferativos são vistos em todas as três linhas de células sugere que este é um fenómeno comum e não se limita a uma única linha de células de cancro do ovário. Os experimentos aqui descritos demonstram também que os quatro TZDs têm acções distintas em células de cancro do ovário, possivelmente, tanto através de PPARy dependentes, bem como vias independentes. Embora vários relatórios indicam que diferentes linhagens celulares respondem diferentemente a TZDs, [30], [31], [32], [33], a nosso conhecimento, uma comparação directa entre estes quatro TZDs em câncer de ovário e delineando se estes efeitos são PPAR dependente usando abordagens moleculares, fisiológicos e farmacológicos não foi investigada.

no presente estudo, 10 uM de CGZ TGZ e diminuição da proliferação de células em todas as três linhas de células de cancro do ovário estudados. Estas observações estão em concordância com outros estudos que utilizam células de cancro do ovário, bem como outras linhas de células em que CGZ e /ou diminuição da actividade TGZ MTT [20], [21], [34]. No entanto, os nossos resultados estão em contraste com as linhas de células de cancro a partir de outros tecidos, tais como cancro da mama, da tiróide, da bexiga e outros que geralmente requerem concentrações muito mais elevadas de TZD para induzir uma resposta biológica. Na verdade, em doses não superiores a 100 um, que excedem as concentrações específicas do ligando relatada de 10 uM ou menos [12], pode ser necessária antes de uma inibição da proliferação é visto [35], [36], [37], [38] , [39]. No entanto, estas diferenças podem ser devido, em parte, com a utilização de diferentes linhas de células ou diferenças nas condições de cultura de células, onde, por exemplo, os investigadores têm utilizado FBS a 1% [39], FBS a 5% [35], [36], [37 ], [38], [39] ou FBS a 10% [21]. Os presentes resultados demonstram que esta diminuição na proliferação é devido a um aumento na paragem do ciclo celular em vez de um aumento da apoptose. Da mesma forma, outros relatórios demonstraram que TZDs levar à degradação da ciclina D1 no cancro da próstata [40], o que provoca a paragem do ciclo celular, e uma diminuição na proliferação de células tumorais. Do mesmo modo, em células de cancro do ovário A2780, CGZ diminui ciclina D1 juntamente com outros factores de sobrevivência pro-resultando na paragem do ciclo celular [21]. Yang e seus colegas [20] relatou que CGZ e TGZ tratamento da ES-2 e PA-1 células de cancro do ovário resultou na interrupção do ciclo celular; No entanto, esta mudança na cinética do ciclo celular foi associada com níveis aumentados de apoptose. Embora os nossos estudos apoiam as conclusões anteriores em diferentes células de cancro do ovário que as tiazolidinedionas diminuir a proliferação celular por células prender na fase G0 /G1 do ciclo celular, existe a possibilidade de que as mais elevadas concentrações de TZDs utilizados nestes estudos resultados anteriores na indução da apoptose [20].

o presente estudo demonstra que cada uma das TZDs tem ações distintas sobre a proliferação de células de cancro do ovário. CGZ TGZ e provocar uma diminuição dramática na proliferação de células de cancro do ovário, enquanto Rosi e Pio teve nenhum efeito. Isto não é inesperado uma vez que cada TZD tem uma afinidade diferente e ligação a PPAR [7], [41], recruta coativadores diferentes [42] e pode eliciar respostas celulares distintas. Estas acções únicas levaram ao conceito de que as tiazolidinedionas são moduladores selectivos de PPAR e por conseguinte alvejar genes distintos resultando na selectividade do tecido [12], [42], [43], [44]. Além disso, TZDs têm diferentes especificidades para os PPARs. Por exemplo, Rosi e Pio são considerados os agonistas de PPAR mais potentes dos quatro TZDs utilizados neste estudo [11]. A descoberta de que estes agonistas PPARy potentes não inibem a proliferação de células de suporte ainda mais a nossa hipótese de que as acções da TZD pode ser independente de PPAR. Além disso, Rosi, CGZ TGZ e são específicos para o PPARy, enquanto Pio tem sido demonstrado que também activar o PPARa [45], [46]. Por isso, os nossos dados podem reflectir as diferenças na modulação selectiva de PPARy, as diferenças na especificidade para o PPARy, ou a activação de diferentes vias independentes de PPARy.

Para começar a compreender a modulação selectiva de PPARy por TZD em ovário células cancerosas, examinamos os perfis de mRNA e expressão de proteínas de PPAR e a ativação do promotor do PPAR após o tratamento TZD. Há um aumento dramático na expressão de mRNA de PPARy em células OVCAR3 foram tratados com TGZ e, em menor medida, com CGZ e Rosi. Em contraste, observou-se a expressão mais elevada da proteína de PPARy, quando as células foram tratadas com Rosi. Esta discordância entre a expressão de mRNA de PPARy e proteína após o tratamento TZD não foi observada nem analisou anteriormente, no entanto, os níveis de proteína de PPARy após o tratamento TZD têm mostrado ser altamente variável entre ES-2 e 1 Pa-células de cancro do ovário [ ,,,0],21]. Nós postulamos que o exame de um ponto de tempo de 24 horas estática pode não capturar com precisão a indução de mRNA e proteína PPAR. Portanto, avaliou o nível de mRNA de PPARy, bem como padrões de proteínas em diferentes momentos após o tratamento TZD e observou-se uma falta de correlação entre o ARNm e a expressão da proteína de PPARy em todos os pontos de tempo. Uma teoria alternativa para explicar esta discordância é que o aumento da expressão de mRNA de PPARy, quando as células são tratadas com TGZ pode aumentar o volume e a degradação de proteína PPARy reduzindo, assim, a expressão da proteína. Isto tem sido previamente demonstrado em outros sistemas onde foi mostrado que, com o aumento das doses de TZD, houve um aumento da degradação de proteínas de PPARy que resultou numa diminuição nos níveis em estado estacionário da proteína em células endoteliais [24], [25] . Esta é a hipótese de ocorrer porque TZDs mediar as alterações no estado de fosforilação de PPARy pela MEK que deixa PPARy susceptíveis à degradação [47]. À luz desta informação, os nossos dados de proteínas pode ser explicado pelo fato de que a degradação TZD causa diferencial de PPAR (após a activação e que a taxa de turn-over de PPAR (proteína nas células tratadas com TGZ é mais rápida do que a de CGZ e Rosi resultante numa diminuição dos níveis de proteína. Além disso, é possível que Rosi aumenta a estabilidade da proteína de PPAR (enquanto que os efeitos sobre a proliferação após tratamento com CGZ e TGZ são PPAR (independente. Alternativamente, TZDs pode causar alterações na própria proteína, tais como a fosforilação, a qual altera outras acções da proteína, em vez de apenas mudando a sua transactivação geral como recentemente foi mostrado por Choi et al. [48].

à luz dos nossos resultados mostraram que a falta de correlação entre os níveis de PPAR (ARNm e proteína após o tratamento TZD, explorámos as alterações na activação de um PPAR (repórter como um índice de PPAR (actividade após exposição TZD. Surpreendentemente, o PPAR (actividade não foi estimulada por qualquer um dos 4 TZDs após 24 h de tratamento, em contraste com relatos anteriores em outras linhas de células de cancro do ovário que CGZ 50 mM de aumento da actividade de luciferase repórter PPRE por 18 h [21]. Com base neste relatório anterior, nós especulamos que a ativação do promotor pode estar ocorrendo em momentos anteriores ou posteriores. Assim, testou-se o efeito de TZDs sobre a actividade do promotor em 4, 8, 24 e 32 horas. Verificaram-se aumentos modestos na actividade da luciferase em células tratadas com CGZ em 8 e 32 horas (dados não mostrados), que foram insuficientes para explicar as alterações na PPAR (expressão. A discordância entre os níveis de proteína e de PPAR (actividade tinha sido previamente observado no cancro da mama células cancerosas, mas o mecanismo exato subjacente a esta diferença permanece desconhecida [34]. no entanto, tal observação sugere que a análise de apenas os níveis da proteína PPAR pode equivocadamente ser usado para atribuir efeitos celulares ou capacidade de resposta aos tratamentos.

o TZDs fez não aumentar a actividade de PPAR endógeno nestas células, no entanto, o tratamento com o aumento da actividade de luciferase TZD quando PPARy foi sobre-expresso em células OVCAR3. Isto indica que estas células constitutivamente activar PPAR e, quando o receptor é altamente abundante, a activação adicional é possível. Esta activação não é