Sumário
O isotiocianato (ITC) sulforafano (SFN) foi mostrado em níveis baixos (1-5 uM) para promover a proliferação de células de 120-143% dos controlos em uma série de linhas de células humanas, enquanto que em níveis elevados (10-40 uM) inibiu a proliferação de células tais. foram observadas respostas dose semelhante para a migração celular, ou seja, SFN em 2,5 mM aumento da migração celular em células de câncer de bexiga T24 a 128%, enquanto que níveis elevados inibiu a migração celular. Esta acção hormetic também foi encontrado em um ensaio de angiogénese, onde SFN a 2,5 uM promoveu a formação do tubo endotelial (118% do controlo), ao passo que a 10-20 uM causou inibição significativa. O mecanismo exacto pelo qual a influencia do SFN promoção do crescimento das células e a migração não é conhecido, mas provavelmente envolve a activação de autofagia uma vez que um inibidor autofagia, 3-metiladenina, aboliu o efeito de SFN sobre a migração celular. Além disso, doses baixas de SFN oferecido um efeito de protecção contra a morte celular mediada por radicais livres, um efeito que foi aumentada por co-tratamento com selénio. Estes resultados sugerem que o SFN pode prevenir ou promover o crescimento de células tumorais, dependendo da dose e da natureza das células alvo. Em células normais, a promoção do crescimento celular pode ser benéfica, mas em células de cancro transformadas ou pode ser um factor de risco indesejável. Em resumo, as ITC ter um efeito bifásico sobre o crescimento das células e a migração. Os benefícios e os riscos de TIC não são apenas determinadas pelas doses, mas são afetados por interações com o SE eo indicador determinado
Citação:. Bao Y, Wang W, Zhou Z, Sun C (2014) Benefícios e riscos dos efeitos Hormetic de dietéticos isotiocianatos na prevenção do câncer. PLoS ONE 9 (12): e114764. doi: 10.1371 /journal.pone.0114764
editor: Daotai Nie, Faculdade de Medicina da Universidade de Southern Illinois, Estados Unidos da América
Recebido: 01 de abril de 2014; Aceito: 13 de novembro de 2014; Publicação: 22 de dezembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Bao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte por uma bolsa da National Natural Science Foundation da China (NSFC No. 81.128.011) e um prêmio do Cancer Prevention Research Trust, Reino Reino. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O termo “hormesis” é muitas vezes utilizado por toxicologistas para se referir a uma ‘resposta a dosagem bifásica de um agente ambiental caracterizado por estimulação de dose baixa e alta inibidora por dose ou efeito tóxico »[1], [2]. O conceito hormesis é a relação dose-resposta mais fundamental na biomédica, nutrição e ciências toxicológicos [1]. Numa revisão global, Calabrese fornecida evidência de que mais do que uma centena de agentes anti-tumor melhorada a proliferação de células de tumores humanos com doses baixas de um modo totalmente consistente com a relação dose-resposta hormetic [2]. Uma das características interessantes de tais dose-resposta foi que ocorreu na maioria dos tipos de células de tumor e foram independentes de órgão. Descobertas recentes sugerem que alguns fitoquímicos apresentam respostas a dosagem bifásica em células com doses baixas activar as vias de sinalização que resultam num aumento da expressão de genes que codificam proteínas e enzimas antioxidantes citoprotectores [3]. Os compostos hormetic alimentares identificados até agora incluem o resveratrol, epigalocatequina galato (EGCG), curcumina, quercetina, alicina, capsaicina, ácido carnósico e sulforafano (SFN) [4] – [8]. De uma perspectiva evolucionária, as propriedades nocivas de fitoquímicos tem um papel protetor importante para dissuadir insetos e fungos de plantas prejudiciais. No entanto, as doses relativamente pequenas de fitoquímicos ingeridos por seres humanos que consomem estas plantas não são tóxicos e não induzem respostas de stress celulares leves. Este fenómeno tem sido amplamente descrito como “hormesis” ou dose-resposta adaptativa nas áreas da biologia e da medicina [4], [9], [10].
O isotiocianato (ITC), SFN (4-methylsulfinylbutylisothiocyanate ), foi isolado pela primeira vez a partir da vulgarmente consumido-crucíferas vegetal, brócolos e é um dos mais potentes indutores que ocorrem naturalmente do Kelch-como proteína associada a uma ECH (Keap1) -nuclear factor de 2-eritróide relacionados factor de 2 (Nrf2) elementos de resposta -antioxidant (ARE) via [11]. A indução de Nrf2 protege as células normais do stress oxidativo mediado por radicais livres através de regulação positiva de genes quimioprotectores, e a acção de SFN é baseada na sua capacidade para induzir uma redutase-driven Nrf2 enzima quinona (NQO1) [12]. Nos 20 anos seguintes à sua descoberta, os efeitos protectores do SFN tem sido demonstrado em vários sistemas de cultura de células e em modelos animais, com o resultado de que SFN é de longe o mais extensivamente estudado ITC de vegetais crucíferos. Os mecanismos anti-cancerígenos de TIC também têm sido bem documentadas, incluindo up-regulação da fase II enzimas de desintoxicação, anti-inflamação, promoção da paragem do ciclo celular e apoptose [13] – [17]. Durante a última década, Keap1-Nrf2-ARE tem sido considerado como um caminho crítico anti-cancro em quimioprevenção [18] – [20]. No entanto, mais recentemente, tem havido alguns relatórios de Nrf2 deletérios, incluindo a promoção do crescimento de células tumorais e quimiorresistência [21] – [25]. A fim de sobreviver, as células cancerígenas podem sequestrar a via Nrf2 que regula positivamente a uma bateria de enzimas antioxidantes, mantendo assim um equilíbrio redox favorável a fim de adquirir propriedades malignas [26]. A sobre-expressão de Nrf2 poderia melhorar a proliferação celular e causar resistência a intervenções quimioterapêuticos, em alguns tipos de cancro, incluindo cancros do pulmão humano e pancreáticas [27], [28]. Algumas investigações anteriores mostraram que o SFN exibe um efeito dependente da dose sobre a proliferação celular em linhas celulares de tumor em cultura e as células normais, incluindo células estaminais mesenquimais humanas [29] – [31]. No presente estudo, mostrou que SFN exibiram uma resposta de dose hormetic sobre o crescimento celular, a migração e a angiogénese. Se o efeito hormetic é benéfico ou prejudicial depende do ponto de extremidade seleccionado e /ou a natureza das células (normal ou de tumor). Embora o hormesis termo é empregado por toxicologistas para descrever uma resposta à dose em forma de sino, caracterizado por um efeito benéfico em doses baixas e uma actividade tóxica (ou inibidora) em doses elevadas, esta expressão de benefício de dose baixa pode não ser verdadeiro para o efeito das TIC em quimioprevenção do câncer. Desde hormesis mostra pouca selectividade, os efeitos biológicos de ITC sobre as células normais e as células tumorais irão diferir. Deste ponto de vista, um efeito dose baixa de ITC na promoção da proliferação de células tumorais e de migração em modelos animais deve ser avaliado com prudência. Assim, uma estratégia precisa, que visa optimizar os efeitos benéficos e minimizar o risco das ITC deve ser desenvolvido com cuidado em relação à prevenção e tratamento do câncer.
Resultados
Efeitos de TIC no crescimento celular
Devido à natureza da resposta à dose hormetic, não há nenhuma selectividade das ITC no crescimento celular, por isso, é provável que as ITC pode promover o crescimento de células de tumor em doses baixas. Em vários
in vitro
estudos de cultura de células, baixas concentrações de SFN foram mostrados para promover o crescimento de células tumorais, mas nenhuma discussão detalhada ou sugestões para estudos de acompanhamento para investigar os mecanismos foram fornecidos [32] – [34 ]. Em baixas concentrações, as ITC foram mostrados para induzir a proliferação e /ou a proteger as células contra um agente tóxico, H
2O
2, em células Caco-2 [30] e nos hepatócitos [29]. FIG. 1A mostra os efeitos do SFN sobre o crescimento celular, com doses mais baixas (1-5 uM) que promovem o crescimento das células (20-43% maior do que o controlo) e doses altas (10-40 uM) que inibem o crescimento de células num número de células de tumor linhas, ou seja, T24 cancro da bexiga, HepG2 de hepatoma, e câncer de cólon Caco-2. efeitos dose-resposta semelhantes foram encontrados em linhas de células normais, incluindo hepatócitos imortalizado HHL-5, CCD841 epiteliais do cólon e linhas celulares CCD-1092SK fibroblastos da pele (Fig. 1B).
Quando as células cresceu para 70-80% de confluência, uma gama de doses de SFN (0-160 uM) foram adicionados ao meio de cultura de células durante 24-48 h. As células de controlo foram tratadas com DMSO (0,1%), e a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de proliferação celular do MTT (viabilidade de células CCD-1092SK foi determinada por ensaio de WST-1 de acordo com as instruções do fabricante [88]). Cada ponto de dados representa a média ± SD de pelo menos 5 repetições. A significância estatística a partir do controle, * p 0,05, ou ** p 0,01. A: resultados de T24 cancro da bexiga, HepG2 de hepatoma e células cancerígenas do cólon Caco-2. B:. Os resultados do hepatócito imortalizado HHL-5, CCD841 epiteliais do cólon e linhas de células de fibroblastos da pele CCD-1092SK
Efeitos do SFN sobre migração celular
Fig. 2A mostra uma resposta à dose em forma de sino do SFN sobre a migração de células de câncer de bexiga T24. SFN em 2,5 e 3,75 mM aumento da migração de células tumorais a 128 e 133%, em comparação com os controles correspondentes. Tal migração celular induzida SFN está associada com a capacidade de SFN para activar autofagia. Quando um inibidor autofagia, 3-metiladenina (3-MA), foi utilizado aliviava SFN (2,5 uM) a migração de células induzida por 128-26%, embora tenha menos efeito inibitório sobre tratamentos SFN em 5 ou 10 uM (Fig 2B. ). Além disso, 3-MA também diminuiu a migração de não-tratados SFN células para 12% do controlo
A:. Após jejum durante a noite, as células T24 de cancro da bexiga foram tratados com SFN nas concentrações indicadas, durante 24 h, migração celular foi medida por um ensaio de migração de células usando as inserções de cultura de células ThinCert (Greiner Bio-One Ltd.). Cada barra representa a média ± DP de 3 replicados. B: Efeito do pré-tratamento de 3-MA sobre a migração celular. DMSO (0,1% foi utilizada como um controlo). A significância estatística a partir do controle, * p 0,05, ou ** p 0,01
TIC e ativação do Nrf2
SFN é um ativador de Nrf2, através do qual ele pode up-. regular a mais de uma centena de genes protectores, incluindo a maioria antioxidante e enzimas quimiopreventivos [11], [35]. Não há dúvida de que a sobre-regulação de Nrf2-ARE via é benéfico em células normais, isto é, a activação de Nrf2 e os seus enzimas citoprotectores accionado podem ser protectora contra o dano oxidativo e tem sido sugerido que a activação da via de sinalização do Nrf2 podem, assim, ser um estratégia promissora na prevenção do câncer [36]. Mas, as ITC não têm seletividade para a utilização de células normais ou tumorais em relação à activação do Nrf2. Nrf2 pode ser sequestrado por células tumorais [26] e um relatório recente sugere que Nrf2 é um proto-oncogene que modula o crescimento de células tumorais [37]. Nas células transformadas, Nrf2 podem promover o crescimento celular ou a causa quimiorresistência [38]. Neste estudo, SFN (2,5-10? M) induziu níveis semelhantes de translocação de Nrf2 para o núcleo de hepatócitos humanos normais HHL-5 (4,1-7,1 vezes), e células de hepatoma HepG2 (4,1-5,9 vezes) (Fig. 3) .
Nrf2 foi detectada em extractos nucleares a partir de células expostas a SFN (0, 2,5, 5 e 10 uM) durante 24 h, utilizando um ensaio de Western blot. As células de controlo foram tratadas com DMSO (0,1%). A: hepatócitos humanos imortalizados HHL-5; B:. Células HepG2 heptoma humana
papel protetor da baixa dose de tratamento ITC contra danos oxidativos
Nos campos da biologia e da medicina, hormesis é definida como uma resposta adaptativa das células e organismos a um estresse moderado. Um stress moderado induz a activação de vias de sinalização, tais como Nrf2, NF-kB, Sirtuin, FOXO, factor de indutível por hipoxia (HIF), conduzindo assim a alterações intrínsecas (por exemplo, indução de enzimas antioxidantes) que podem conferir resistência a tensões mais grave [4 ], [6]. FIG. 4A e 4B mostram que o tratamento prévio de HHL-5 e células MCF-7 com 5 uM SFN ofereceu protecção contra H
2O
2-morte celular induzida, isto é, a viabilidade celular aumentada 36,6-63,9%; e 50,3-83,7%, com 400? M H
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2 tratamentos, respectivamente. Além disso, o efeito protector do pré-tratamento com SFN (2 uM) em H
2O
2-induzida morte celular pode ser aumentada por co-tratamento com selénio (Se) em HHL-5 células (FIG. 4C), ou seja, H
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2 diminuiu a viabilidade celular de 34,8% em células de HHL-5, mas quando as células foram pré-tratadas com SFN (2 uM), ou se (0,1 uM) durante 24 h, a viabilidade celular aumentada para 41,7 e 51%, respectivamente, e o co-tratamento e SFN si só aumentou a viabilidade celular de 65,5%. Este efeito de protecção pode ser envolvido em qualquer quimioprotecção ou quimiorresistência, dependendo da natureza das células.
As células foram cultivadas em placas de 96 poços. Quando elas atingiram 70-80% de confluência, as células foram pré-tratadas com SFN (5 uM) durante 24 h (HHL-5, A) ou 48 h (MCF-7, B). O meio de cultura celular foi substituído com H
2O
2 em concentrações indicadas durante mais 24 h. C: HHL-5 de células foram pré-tratadas com SFN (2 uM) e Se (0,1 uM) durante 24 h antes da exposição ao H
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2 (400 pM) durante mais 24 h. A viabilidade celular foi medida utilizando um ensaio MTT. A significância estatística dos controles correspondentes: * p 0,05; ** P . 0,01
efeitos bifásicos de SFN sobre a angiogênese
A angiogênese (o crescimento dos vasos de sangue novo) é crucial para o desenvolvimento e propagação de uma variedade de cancros humanos. É, portanto, importante para examinar os efeitos anti-angiogénicos de potenciais agentes anti-cancro. Em contraste, o fornecimento inadequado de sangue para o coração e outros tecidos, resultantes do crescimento de vasos sanguíneos novos insuficiente, é uma característica de muitas doenças cardiovasculares. SFN tem sido mostrado para inibir angiogénese em concentrações elevadas [39]. Neste estudo, SFN a 2,5 uM formação do tubo promovido a 118% do controlo, ou seja, o comprimento total do tubo era 4,78 mm /mm
2 no controle e 5,65 mm /mm
2 em SFN (2,5 uM), as células tratadas (Fig. 5). SFN em 5 pM mostrou uma promoção menos significativo (111% relativamente ao controlo), enquanto que 10 e 20 uM inibiu a formação do tubo SFN significativamente (diminuiu para 61 e 20% do controlo, respectivamente). SFN em dose baixa promoveu a formação de uma membrana basal contínua em torno de tubos endoteliais; ao passo que a altas doses de SFN, membranas basais fragmentadas foram encontrados (Fig. 5A). Estes dados sugerem que para anti-angiogénese uma dose relativamente elevada de SFN deve ser usado uma vez que uma dose mais baixa possam promover a angiogénese. No entanto, o efeito estimulante de doses baixas de nova formação de vasos sanguíneos pode ser benéfica em pacientes com doenças cardiovasculares.
O meio de cultura suplementado com SFN (0-40 ^ M) foi adicionado ao topo de géis de colagénio 3-D e depois trocado a cada 24 horas, com frescos SFN acrescentou. géis 3-D foram fixados no dia 5, histoquímica com CD31 (vermelho) e colágeno tipo IV (verde) e contrastadas com DAPI (azul). (A): baixa ampliação imagens foram colhidas em cinco campos aleatórios de cada amostra e calculada para o comprimento médio do tubo. (B) imagens representativos são mostrados na coloração tripla com maior ampliação. Os dados são expressos como média ± SD (n = 5) (C). * P 0,05; ** P 0,01 em comparação com a ausência de tratamento
Discussão
efeito Hormetic das TIC no crescimento celular, migração e angiogênese
As concentrações zona hormetic (aproximadamente 1. -5 uM) de ITC que são adicionados em cultura de células pode ser prontamente conseguido em plasma humano após o consumo de uma refeição rica em vegetais crucíferos, ou a partir de extractos ou suplementos [40] – [44]. A Tabela 1 mostra os níveis plasmáticos de ITC medidos em vários estudos em seres humanos (ver também a referência [45]). SFN é derivado a partir da acção da enzima endógena, mirosinase no glucosinolatos, glucorafanina que é encontrado em vegetais crucíferos. O conteúdo em glucosinolatos de Brassica comum estão disponíveis a partir de um banco de dados desenvolvido pela McNaughton e Marks [46]. O valor mais alto de glicosinolatos foi de agrião (389 mg /100 g de peso fresco), enquanto o menor valor foi de couve chinesa (20 mg /100 g de peso fresco), embora tipo de cultivar e condições de crescimento tanto influência desses números. Bróculos contém 61,7 mg /100 g (19,3-127,5 mg glucoraphinin /100 g) [46], o que é equivalente a 141,3 umol SFN /100 g (44,2-292,1 umol /100 g de peso fresco), se a conversão é de 100% eficiente. condições de processamento de alimentos e cozinhar são factores cruciais a influenciar a actividade de mirosinase, e subsequente formação das TIC [47]. A principal influência sobre a produção que se seguiu de TIC
in vivo
é como os vegetais brassica ter sido preparados [48]. Amplos estudos de SFN apresentaram provas convincentes de que SFN é um agente quimiopreventivo [49], [50]; e os mecanismos de sua ação envolve a indução de enzimas de fase II, a parada do ciclo celular e apoptose [16], [51].
Em geral, os resultados de estudos epidemiológicos sobre a associação entre a ingestão de vegetais e o risco de câncer são inconsistentes. Um consumo elevado de vegetais crucíferos tem, no entanto, foi demonstrado para diminuir o risco de vários tipos de cancro, incluindo os de cólon e pulmão [52], [53]. Se os efeitos hormetic de TIC estão envolvidos no crescimento do câncer, o impacto biológico global de vegetais crucíferos no risco de câncer torna-se muito mais complicado. No entanto, se uma dose baixa de TIC promove o crescimento de células de câncer pode ajudar a explicar por que estudos epidemiológicos não mostram uma associação consistente entre o consumo de vegetais crucíferos e o risco de câncer. Portanto, é crucial para compreender os mecanismos de ação dos efeitos hormetic de TIC. Em
In vitro
culturas de células, os mecanismos pelos quais a baixas doses de SFN promovem o crescimento celular pode estar relacionado com o efeito do SFN tem sobre a activação de moléculas de factores de crescimento (tais como HER2, RAS, RAF, MEK, ERK , PI3K, AKT e mTOR), vias de transdução de sinal, tais como NF-kB, FOXO, HIF, Nrf2, autofagia e receptores [54] – [56].
autophagy envolve a formação de vesículas de dupla membranados ( autofagossomas), que encapsulam o citoplasma e organelas e se fundem com os lisossomas, levando a degradação do conteúdo da vesícula [57]. SFN é conhecida por ser um indutor da autofagia [58], mas não é claro como a indução de autofagia está associada à supressão da migração celular. Outros alvos potenciais do SFN pode incluir metaloproteinases de matriz (MMP), microtúbulos, colágenos e integrinas, survivina e dedo de zinco de ligação E-box homeobox 1 (ZEB1) [59]. Um estudo recente sugere que a activação de autofagia está associada com quimiorresistência, e que desacetilase de histona (HDAC) 10 protege as células de neuroblastoma de agentes citotóxicos mediando autofagia [55]. Este trabalho indica que co-tratamento com inibidor HDAC10 e um fármaco quimioterápico (doxorrubicina) é um caminho promissor para melhorar a resposta ao tratamento. Outro estudo sugere que a ativação Notch é em grande parte dispensável para a inibição SFN mediada da migração celular em cancros da próstata humanos [60], e isso pode ser uma vantagem terapêutica como a ativação Notch é comum em cancros da próstata humanos. níveis constitutivos altos de Nrf2 ocorrer em muitos tumores, enquanto que a sobre-expressão de Nrf2 em células cancerosas protege-los contra os efeitos citotóxicos de terapias anti-cancro, resultando na quimiorresistência [22], [61]. Existem interações entre TIC e SE no up-regulação da tioredoxina redutase (TR-1) e glutationa peroxidase 2 (GPX2) [30] e é claro que as ITC e SE exibem uma infinidade de efeitos multi-alvo em quimioprevenção do câncer. Curiosamente, Se também promove a migração e invasão de células de câncer de próstata PC3 [62].
Avaliação do efeito hormetic das ITC
O consumo de vegetais crucíferos não só proporcionaria TIC, mas também contribuem outra nutrientes e fitoquímicos, incluindo tocoferóis, flavonóides, ascorbato e SE. Esses componentes podem neutralizar /interagir com os pró-oxidantes /atividades antioxidantes do ITC. Com base na natureza hormetic das TIC, o consumo de uma quantidade de vegetais crucíferos que fornecem um nível hormetic das TIC no plasma pode ser um fator de risco para aqueles que têm células transformadas no corpo. Um diagrama esquemático para analisar os benefícios e riscos da ITC alimentares é proposto na Fig. 6. Para todos os componentes da dieta e substâncias tóxicas, “a dose faz o veneno” [redacção simplificada de “todas as coisas são veneno, e nada é sem veneno; única dose permite algo a não ser venenosa “(Paracelsus, 1493-1541)]. Para ITC alimentares, deve haver um “nível de efeito” antes da detecção de quaisquer efeitos biológicos. De facto, o nível de ITC no plasma da maioria da população é provável que seja muito mais baixa do que o sub-iM e não pode exercer quaisquer efeitos biológicos sobre células. No entanto, após aumento da ingestão, como nos ensaios listados na Tabela 1 ou para os indivíduos que tomam suplementos, o plasma níveis ITC poderia alcançar as concentrações zona hormetic. As características típicas da zona hormetic (dose de A-C) inclui baixas concentrações estimulantes e concentrações elevadas efeitos inibidores. Para SFN, a zona hormetic é encontrado para ser 1-5? M no
in vitro
experimentos de cultura de células, embora a dose de efeitos encontrados
in vitro
experiências não devem ser diretamente extrapolados para os humanos . É possível que a zona hormetic e Observado nível sem efeitos adversos (NOAEL, dose de C) em seres humanos é significativamente diferente. A fim de maximizar o efeito benéfico e minimizar o risco, ambos os factores genéticos e das interacções entre os componentes alimentares deve ser considerada. Por exemplo, polimorfismos genéticos de transferases de glutationa (GST) afetam SFN metabolismo e o risco de câncer [63]. Por outro lado, a suplementação com vegetais crucíferos aumento da atividade GSTA1 /2, o efeito sendo mais acentuada nos homens GSTM1 nulos /GSTT1 nulos [64]. Embora atualmente existam poucos estudos epidemiológicos que empregam genotipagem, a investigação desta natureza vai aumentar no futuro, e é provável que os nutrigenética irá fornecer uma base para a medicina personalizada e nutrição. Interações entre fitoquímicos bioativos e nutrientes pode contribuir para os benefícios e riscos da ITC, dependendo do estado de saúde dos indivíduos em geral. As induções de Nrf2 e enzimas antioxidantes, tais como TR-1 também pode ser de qualquer benefício ou risco, dependendo da natureza das células alvo (normal
vs
tumor).
Para todos os tipos de células , gama de dosagem 0-A é segura. Na maioria das dietas, os consumos de fitoquímicos hormetic tendem a cair dentro dessa faixa segura. No caso de células normais, a dose de B pode ser usado promover a formação de novos vasos sanguíneos ou promover a cicatrização de feridas; doses C são tóxicos. Para as células tumorais, doses entre A e C deve ser evitada; e doses C para D poderia ser usada para a quimioterapia
Onde estamos agora.? Como podemos maximizar os benefícios e minimizar os riscos?
Trinta anos atrás, os pesquisadores focaram sobre as potenciais propriedades tóxicas (goitrogenic) de produtos de decomposição glucosinolatos [65]. Em 1992, foi isolado a partir de sulforafano brócolos e estudos anti-cancerígenos foram com base na sua actividade potente na indução de enzimas de fase II [12], [66]. Ao longo da última década, muitos indutores Nrf2 incluindo ITC, resveratrol, catequina, cucurmin, e a quercetina foram relatados [67], [68] com tanto quimiopreventivo e actividades oncogénicos [69] – [71]. Recentemente, dois inibidores de Nrf2, brusatol (a partir das sementes de
Brucea sumatrana
) e trigonelina (a partir de café) foram relatadas para melhorar a eficácia da terapia anti-cancro [72], [73]. Além disso, Nrf2 knockdown foi mostrado para inibir o crescimento tumoral, aumentar a eficácia da quimioterapia no cancro do colo do útero [74], e inibir a angiogénese de células endoteliais de rato micro-vasculares cardíacos sob condições hipóxicas [75]. Portanto, é claro que o papel do Nrf2 no desenvolvimento do câncer é um tema de controvérsia e ativadores Nrf2 como SFN e outras TIC podem contribuir ambos os benefícios e os riscos de desenvolvimento de câncer.
Uma compreensão da infinidade complexa e naturezas divergentes de TIC e outros ativadores Nrf2 alimentares e suas respostas à dose hormetic, combinados com um diagnóstico preciso (estágio do câncer), e análise genética pode, em um futuro não muito distante, iniciar o potencial significativo que a medicina personalizada pode ter. Novas técnicas de diagnóstico que exploram nanopartículas de ouro pode manchar tumoriformes tão pequeno quanto 5 mm no fígado [76]. As nanopartículas de ouro com um revestimento polieletrólito pode fazer tumores ainda menores visível através de imagem de dispersão de raios-X, permitindo assim o diagnóstico precoce. Uma vez que os tumores podem ser diagnosticados numa fase tão precoce, uma abordagem terapêutica potencial poderia ser o nanoencapsulação de fitoquímicos que combatem o câncer ou drogas através da entrega monitorada e orientada [77]. Mas, é preciso lembrar que as ITC em concentrações elevadas também são tóxicos para as células normais. Os efeitos adversos foram relatados em
in vitro
estudos utilizando 10-30 um SFN, incluindo indução de DNA, RNA e danos mitocondrial [78] – [80]. Além disso, houve também um relato de caso de toxicidade hepática em um indivíduo que consumiram 800 ml brócolis sopa por dia durante 4 semanas [81]. Os baixos níveis de TIC pode gerar espécies reativas de oxigênio (ROS), e ativar Nrf2-SÃO para ligar enzimas antioxidantes. Apesar de elevados níveis de ROS pode danificar lípidos, proteínas e ADN nas células, níveis baixos de ROS pode desempenhar um papel importante na defesa imunológica, acção antibacteriana, o tónus vascular, e de transdução de sinal [82]. Recentemente, James Watson hipótese de que diabetes, demências, doenças cardiovasculares e alguns tipos de câncer estão todos ligados a uma falha para gerar ROS suficiente [83]. O desafio é definir o balanço entre a geração de ROS e a capacidade antioxidante em cada tipo de células. Para TIC na dieta, é importante para definir a faixa ideal de ingestão de promoção da saúde. No entanto, mais estudos em humanos são necessários para estabelecer as doses ideais personalizado, segurança e perfis de eficácia utilizando biomarcadores mais sensíveis.
Materiais e Métodos
Materiais
O sulforafano foi comprado de Enzo Ciências da vida (RU). selenito de sódio, dimetilsulfóxido (DMSO), peróxido de hidrogénio, reagente de Bradford, brometo methylthiazolyldiphenyl-tetrazólio (MTT), fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), e todos os outros materiais e reagentes foram adquiridos de Sigma-Aldrich (Reino Unido). Coelho anticorpos primários policlonais para Nrf2, SAM68 e peroxidase de rábano (HRP) caprino conjugado anti-IgG de coelho como anticorpos secundários foram todos obtidos a partir de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Heidelberg, Alemanha). Anti-colagénio IV e CD31 anti-humano /PECAM-1 foram adquiridos a Millipore e BD Biosciences (Reino Unido), respectivamente. Os anticorpos secundários conjugados com Cy2 e Cy3 foram comprados a partir de Jackson Immuno Research (Reino Unido). inibidor de proteinase-Mini completa e reagente WST-1 foram adquiridos a partir de Roche Applied Sciences (UK). Electroforese e fornecimentos de Western blotting foram fornecidos pela Bio-Rad (Reino Unido). A quimioluminescência aumentada (ECL) kit foi comprado da GE Healthcare (UK).
cultura celular
hepatócitos humanos imortalizadas (definidos como HHL-5) foram gentilmente fornecido pelo Dr. Arvind Patel, Investigação Médica Conselho (MRC) Unidade de Virologia (Glasgow, Reino Unido) [84]. Todas as outras linhas celulares foram adquiridas a partir da ATCC. As células foram rotineiramente cultivadas em meio DMEM suplementado com soro fetal de bovino (10%), glutamina 2 mM, penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 ug /ml), sob 5% de CO
2 no ar a 37 ° C.
proliferação celular ensaio
o ensaio de MTT a proliferação de células foi utilizado para detectar a toxicidade do SFN (1-160 fiM) em células de cultura. Quando as células estavam a cerca de 70-80% de confluência, as células foram expostas a várias concentrações de SFN para diferentes tempos utilizando DMSO (0,1%) como controlo. Depois de todos os tratamentos, o meio foi removido, 5 mg /ml de MTT foi adicionada, e incubada a 37 ° C durante 1 h para permitir que o MTT para ser metabolizado. Em seguida, o formazano produzido foi re-suspenso em 100 ul de DMSO por poço. A absorvância final nos poços foi registada utilizando um leitor de microplacas (BMG Labtech Ltd, UK) num comprimento de onda de 550 nm e um comprimento de onda de referência de 650 nm.
A migração celular ensaio
migração celular foi quantificada utilizando uma cultura de células ThinCert insere ensaio de migração de células (Greiner Bio-One Ltd.). Após jejum durante a noite em meio isento de soro, as células foram tratadas com várias concentrações de SFN durante 24 h, as células que migram através de uma membrana de PET foram marcadas por fluorescência com calceína-AM e quantificada por leitor de microplacas (BMG Labtech Ltd, Reino Unido) com um comprimento de onda de excitação de 485 nm e comprimento de onda de emissão de 525 nm.
extracção de proteínas e análise de Western blot
quanto à proteína total, HHL-5 as células foram lavadas duas vezes com PBS arrefecido em gelo, colhidas por raspagem em 20 Tris-HCl (pH 8), NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 10% de glicerol, 1% de Nonidet P40 (NP-40) contendo mini-completa inibidor de proteinase. As suspensões de células foram colocadas num banho de gelo durante 20 min e em seguida centrifugou-se a 12000 g durante 15 min a 4 ° C. O sobrenadante foi recolhido e a concentração de proteína determinada pelo Bradford Brilliant Blue G-ensaio de ligação de corante de utilizando BSA como um padrão. Para a proteína nuclear, a extracção foi realizada usando um kit de extracto nuclear (Activo motivo, Reino Unido), seguindo as instruções do fabricante.
Os extractos de proteína foram aquecidos a 95 ° C durante 5 min em tampão de carga e carregou-se géis de 10% SDS-poliacrilamida, juntamente com um marcador de peso molecular. Após a electroforese e a transferência de rotina, a membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) foi bloqueada com 5% de leite livre de gordura em PBST (Tween 20 a 0,05%) durante 1 h e incubou-se com um anticorpo primário específico em leite a 5% em PBST durante 1 h. A membrana foi lavada três vezes durante 45 min com PBST e depois incubadas com o anticorpo secundário diluído com leite a 5% em PBST durante 1 h. Após mais três lavagens de 45 min com PBST, a ligação do anticorpo foi determinada utilizando um kit ECL (GE Healthcare, Reino Unido) e densitometria foi medida por Fluor Chem Imager (Alpha Innotech, San Leandro, CA).
A angiogénese ensaio – formação de tubo em um modelo 3-D
células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e pericitos (PVC) foram co-cultivadas em colagénio do tipo I gel como descrito anteriormente [85]. SFN (0-40 ^ M) foi adicionado ao meio (topo do gel de colagénio de 3-D) e o meio foi trocado a cada 24 horas com SFN fresco adicionado. No dia 5, as amostras foram fixadas, histoquímica com CD31 e colágeno tipo IV e contrastadas com DAPI.