Abstract

fundo e Aponte

expressão alterada de microRNAs (miRNAs) características muitos tipos de câncer. O estudo das associações de perfil de expressão miRNA e fenótipo câncer poderia ajudar a identificar as ligações entre a desregulação da expressão de miRNA e as vias oncogênicas.

Métodos

Expression profiling de 866 miRNAs humanos em 19 colorretal e 17 cancros pancreáticos e em tecidos normais adjacentes emparelhados foi investigada. Clássica teste t emparelhado e florestais análises aleatórias foram aplicados para identificar miARNs associados a tumores específicos de tecidos. Foi realizada análise de rede com base em uma abordagem computacional para associações de minas entre tipos e miRNAs cancerosas.

Resultados

A fusão entre os dois métodos estatísticos utilizados para cruzar os miRNAs diferencialmente expressos no cólon e pancreáticos cancros permitiu a identificação de alterações de miARN específicos do cancro. Pela análise miRNA-rede, padrões de tecidos específicos de miRNA desregulamentação foram traçadas: os miRNAs de condução foram

miR-195, miR-1280,

miR-140-3p e

miR-1246 em tumores colorretais, e

miR-103, miR-23a

e

miR-15b

no pâncreas.

Conclusão

perfis de expressão miRNA pode identificar o câncer assinaturas espec�icos e biomarcadores potencialmente úteis para o diagnóstico de câncer específicos de tecidos. miRNA-rede análise ajudar a identificar alterado miRNA redes de regulação que poderiam desempenhar um papel na patogênese do tumor

Citation:. Piepoli A, Tavano F, Copetti M, Mazza T, Palumbo O, Panza A, et al. Perfis (2012) Mirna Expressão Identificar Drivers no colo e pancreáticos cancros. PLoS ONE 7 (3): e33663. doi: 10.1371 /journal.pone.0033663

editor: Alfons Navarro, da Universidade de Barcelona, ​​Espanha |

Recebido: 17 de novembro de 2011; Aceito: 14 de fevereiro de 2012; Publicado: 30 Março 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Piepoli et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Saúde italiano concede RC0903GA51, RC1003GA52, RC1103GA47, RC0903CH47, RC1003CH50, RC1103CH46, RC1003BS14 e RC1102BS45 através da Unidade de Pesquisas de Gastroenterologia, Unidade de Pesquisa de Cirurgia e Unidade de Bioestatística; e Casa Alívio do Sofrimento (IRCCS), San Giovanni Rotondo (FG), Itália. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

MicroRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA não-codificantes de proteína que regulam a expressão de genes, principalmente ao nível da síntese de proteínas [1]. Eles representam um sistema altamente conservada evolutiva que controla os processos celulares importantes, tais como o desenvolvimento, diferenciação, proliferação, apoptose, metabolismo e [2]. expressão aberrante de miRNAs podem surgir de exclusão, mutação, e metilação dos genes codificadores de miRNA, muitos dos quais localizados em locais ou regiões vulneráveis ​​genômicas frequentemente apagados ou amplificados no câncer [3]. Com base nessas premissas, eles foram provados para interagir com potenciais oncogenes ou supressores de tumor [4]. Muitos miARNs são expressas de um modo específico do tecido, com perfis diferencialmente expressos em tecidos normais e neoplásicas, quer, e em tumores com propriedades biológicas distintas. Além disso, algumas evidências indicam perfis de miRNA para permitir a identificação confiável da origem das células-of-de tumores [5].

Classicamente, a expressão diferencial de miRNAs foi avaliado, como contribuição única ou como assinatura preditiva [6 ], [7]. No entanto, muito do esforço científico é gasto actualmente para elucidar as suas funções: controlo maioria miARNs, pelo menos, um ARNm, e a maioria dos mRNAs são controlados por mais do que um [8] miARN. A complexidade deste mecanismo por trás sofisticado pode ser parcialmente aliviado por o conhecimento dos níveis de cada miARN de conservação. Na verdade, alto valor de conservação através de distâncias filogenéticas largas ajuda a restringir a gama de funções que um miRNA pode jogar para regular o controle do desenvolvimento das espécies e fisiologia.

Neste estudo, nós investigamos os padrões de miRNAs em colorectal expressão (CRC) e câncer pancreático (PC) com a intenção de identificar miRNA redes reguladoras provavelmente envolvidas em vias oncogênicas avaliando assinaturas específicas do cancro através da análise da relação entre miRNA perfil de expressão e de câncer de linhagens.

Materiais e Métodos

Amostras Seleção e Extração de RNA

O tumor primário e tecidos não tumorais vizinhas foram obtidos a partir de duas coortes de treinamento de 19 pacientes CRC e 17 pacientes de PC, e de duas coortes de validação de 14 CRC e 21 pacientes de PC .. o estudo foi realizado com a aprovação dos comités científicos e éticos do IRCCS “Casa Alívio do Sofrimento” Institute, San Giovanni Rotondo, FG (Itália). Os pacientes deram consentimento informado por escrito de acordo com a lei italiana sobre a privacidade (que prevê a protecção dos dados pessoais), de modo que os indivíduos não podem ser identificados a partir de dados ou imagens incluídas nesta publicação, e aprovado pelas comissões científicos e éticos do IRCCS ” Casa Alívio do Sofrimento “Institute. Todos os exames clínicos foram realizados de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki.

Os dados dos pacientes clínicos, localização do tumor e estadiamento são apresentados na Tabela S1. As amostras de tecidos foram rapidamente congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até a extracção de ácidos nucleicos. Cerca de 150-200 mg de tecidos congelados frescos foram usadas para isolar o ARN total por extracção com fenol (TRIzol Reagent, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA). concentração e pureza RNA eram controladas por Nano Gota Specthophotometer. O Agilent Bioanalyzer 2100 foi utilizado para medir a quantidade, a integridade e a pureza de pequenos RNAs e o ARN total, e apenas ARN não degradado caracterizado por um número de integridade do ARN 7, sem sinais de contaminação de ADN foi processado

miARN. microarrays

perfil de expressão miRNA foi determinada utilizando GeneChip® miRNA array (www.affymetrix.com). Esta matriz contém 46,228 sondas compreendendo 7.815 conjuntos de sondas, incluindo os controles, e abrange 71 organismos, tais como humano, rato, ratos e cães. O conteúdo é derivado da base de dados V.11 Sanger miRBase miARN (15 de Abril, 2008, https://microrna.sanger.ac.uk). conjuntos de sondas de segmentação snoRNAs humanos e scaRNAs são derivadas do snoRNABase (www.snorna.biotoul.fr/coordinates.php) e os arquivos ENSEMBL (www.ensembl.org/biomart/martview~~number=plural), Resumidamente, 1,5 ug de ARN total foi marcado usando a matriz 3DNA Kit de Detecção de FlashTag ™ RNA Labeling (https://www.genisphere.com), de acordo com as recomendações do fabricante. Em primeiro lugar, o poli (A) cauda foi realizada a 37 ° C durante 15 minutos num volume de 15 ml de mistura de reacção, que continha Tampão de Reacção 1X, 1,5 mL de MgCl2 [25 mM], 1 ul de ATP mistura diluída e 1 1:500 enzima PAP ul. Em segundo lugar, Flash tag A ligação foi realizada à temperatura ambiente durante 30 min pela adição de 4 ul de 5X mistura de ligadura Flash tag de biotina e 2 ul de T4 ADN-ligase em 15 jil de mistura de reacção. Para parar a reacção, adicionou-se 2,5 ul de solução de paragem. As amostras foram hibridizados, lavados e digitalizada com um scanner Affymetrix.

Todos os dados de microarranjos são Miame complacente e os dados em bruto foi depositado em ArrayExpress (número de acesso E-MTAB-752 para perfis de expressão do cancro do cólon miRNA e E- MTAB-753 para câncer de pâncreas perfis de expressão de miRNA).

estimativa quantitativa do miRNA por transcrição reversa PCR em tempo real ensaio

quantitativo em tempo real reação em cadeia da polimerase (qPCR) de miRNAs foi realizada utilizando Ensaio TaqMan MicroRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) com ABI-Prism 7700 Sequence Detection System. Um protocolo de dois passos requer a transcrição inversa com um iniciador específico do miARN, seguido por um PCR em tempo real com sondas TaqMan. Os ensaios alvo apenas miRNAs maduros, e não os seus precursores. Em breve, inverter reacções de transcriptase continha 10 ng de amostras de ARN, 50 nM stemloop iniciador de RT, tampão 10X RT, 0,25 mM de cada um dos dNTP, 3,33 U /uL MultiScribe TA e 0,25 U /de inibidor de RNase uL (todos adquiridos a partir de cDNA Archive kit de Applied Biosystems) foram realizadas em volume final de 15 uL e incubaram-se em ciclizador térmico durante 30 min a 16 ° C, 30 min a 42 ° C, 5 min a 85 ° C e depois mantida a 4 ° C. A mistura de reacção de PCR de 20 uL incluído 1,3 ul produto de RT (1:15 diluição), 10 ul de 2X TaqMan Universal PCR Master Mix (NoUmpErase UNG) e 1 ul de 20X MicroRNA TaqMan Ensaio (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) . As reacções foram incubadas numa placa óptica de 96 poços a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 10 min. Todos os ensaios foram realizados em triplicado.

Análise Estatística

características basais dos pacientes foram relatados como média desvio ± padrão (SD) ou frequências e percentuais para variáveis ​​contínuas e categóricas, respectivamente.

Para cada um dos dois grupos de treinamento, dados do chip de microRNA foram normalizadas usando o algoritmo Robust multi-gama média (RMA) [9]. A fim de identificar miARNs diferencialmente expressos entre tecidos normais e tumorais emparelhados, duas abordagens foram seguidos. Em primeiro lugar, um teste t pareado clássica controlando para a taxa de descoberta de falsas (FDR) promoveram uma classificação miRNAs de acordo com os seus valores de p. Em segundo lugar, foi aplicada floresta aleatório (RF) de análise [10] para detectar miRNAs com a melhor capacidade em discriminar tumor de tecidos normais emparelhados. A RF é um classificador que consiste em um conjunto de classificadores estrutura de árvore. De acordo com esta técnica, 100.000 árvores foram construídos para classificar os tecidos. O conjunto de aprendizagem usado para crescer cada árvore era um .632+ resample inicialização das observações. Árvores foram autorizados a crescer ao seu tamanho completo sem poda. A melhor dividir em cada nó foi selecionado a partir de um subconjunto aleatório de miRNAs. As observações deixaram-out (ou seja, “fora de bolsa” observações) foram, em seguida, previsto para obter a taxa de erro de classificação da árvore considerada. capacidade preditiva do classificador foi avaliada agregação das taxas de erro de árvores individuais. Além disso, a estrutura da floresta aleatório permitiu estimar a importância de uma variável por olhar para o quanto o erro aumenta de classificação quando “fora de bolsa” de dados para essa variável são permutados, enquanto todos os outros são mantidos inalterados. A métrica importância utilizada foi a diminuição média na Precisão (MDA). O MDA é construído permutando os valores de cada variável do conjunto de teste, registrando a previsão e comparando-a com a previsão conjunto de teste permutada-un da variável. Portanto, é o aumento da percentagem de vezes que um conjunto de teste é misclassified quando a variável é permutada. Seguimos Strobl et al. [11] para evitar um possível viés na seleção de variáveis: árvores de classificação individuais foram construídos usando subsampling sem substituição e adotando um esquema de permutação condicional [12]. Obtivemos um ranking miRNAs de acordo com a medida importância variável. Finalmente, os dois rankings miRNA, um da análise clássica e um da análise de RF, foram fundidas para obter uma lista de miRNAs diferencialmente expressos. As correlações entre a expressão miRNA foram estimados por meio do coeficiente de Spearman. Um valor de p 0,05 foi considerado para significância estatística. Todas as análises foram realizadas utilizando SAS Lançamento 9.1 (SAS Institute, Cary, NC, EUA) e R para a floresta aleatória análises (

Floresta aleatória

pacote)

Quantitative PCR em tempo real ensaio. (QPCR) foi usado em coortes de validação externa para confirmar os resultados de matriz de microRNA, que foram avaliados pelo método e padrão configurações de limite de ciclo Threshold comparativo (CT). expressões relativas de miRNA foram computados por 2

-ΔΔCt fórmula [13] usando U6 RNA nuclear pequeno (RNU6B) como controle de normalização. Desde a 2

-ΔΔCt valores transformados não foram distribuídos normalmente, as comparações foram feitas usando o Wilcoxon não paramétrico assinado teste de classificação, a fim de avaliar a significância estatística do regulamento cima ou para baixo. Para as análises de validação qPCR, considerou-se um tamanho de amostra de 14 indivíduos para proporcionar uma força de 90% (com um alfa de dois lados = 0,05) para detectar um aumento da regulação de pelo menos 2 ou uma sub-regulação de, no máximo 0,5 de a expressão de cada miRNA em termos de 2

-ΔΔCt usando o Wilcoxon não paramétrico assinado teste de classificação e 1 como a hipótese nula.

a análise de redes

Para cada um dos dois formação coortes um rede sem direção e ponderado foi construído, onde nós e arestas representam miRNAs e suas correlações (quando significativo), respectivamente. Assim, as bordas não estão orientados desde correlação é simétrica, e ponderados com o coeficiente de Spearman. A espessura das bordas espelha a magnitude dos pesos. A fim de cavar nós críticos de ambas as redes CRC e PC, nós emprestamos alguns métodos das ciências sociais, e avaliados os seguintes

centralidade

medidas:

grau

,

betweenness

e

coeficiente de agrupamento

[14], [15] para cada rede. Finalmente, miRNAs foram classificados de acordo.

Todas estas medidas (ou métricas) são baseadas na enumeração de links ou caminhos mais curtos. Em detalhes, vamos definir um caminho de a, com o conjunto de nós, como uma sequência alternada de nós e arestas, começando com e terminando com, de modo que cada aresta conecta a sua anterior com o vértice seguinte. Nós definimos o comprimento de um caminho a ser a soma dos pesos inversos dos seus bordos. A ideia é que miRNAs altamente correlacionadas minimizar a distância entre nós ou, de outra perspectiva, os mais próximos dois nós são mais eles estão correlacionados. Por isso, calcular a distância entre dois nós e, escritos, como o comprimento mínimo de qualquer caminho de ligação e no. Por definição, para cada.

Grau

centralidade é baseada na ideia de que nós importantes são aqueles com o maior número de ligações com outros nós no gráfico. Muitas vezes, é interpretada em termos de o envolvimento imediato de nodos nas relações estabelecidas através da rede. Vamos ser o peso da aresta, que liga o nó com o nó, a central grau de um nó é, com o conjunto de arestas, de acordo com a qual a é o valor mais alto grau, o mais importante (globalmente correlacionada) é o nó .

betweenness

centralidade mede a influência de um nó tem sobre a correlação indireta entre não nós vizinhos. Betweenness, na sua versão básica, é calculado como a fracção de caminhos mais curtos entre os pares de nós que passam através do nó de interesse. Sua expressão matemática é, onde é o número de caminhos mais curtos de a, e é o número de caminhos mais curtos de a que passe através de um vértice. Vértices que ocorrem em muitos caminhos mais curtos entre outros vértices têm maior betweenness, e em seguida maior relevância nas correlações indiretas.

O

coeficiente de agrupamento

é uma medida do grau em que nós em um gráfico tendem a aglomerado em conjunto, ou em outros termos, quantifica nós por causa da extensão em que seus vizinhos estão a ser um

clique

(grafo completo) com ele. O coeficiente de agrupamento de um nó é dada pela proporção de ligações entre os nós dentro de sua vizinhança, dividido pelo número de links que poderia existir entre eles. Sucintamente, é expressa como, se define imediatamente os vizinhos ligados conjunto de e. Sua formulação “ponderada” baseia-se nos pesos da

triângulos

centrada nos nós de uma rede. É definido por Horvath e Zhang [16] onde, como é o peso sobre a borda, e, assim, o produto dos pesos das arestas que formam um triângulo fechado de nós. A partir da definição local do coeficiente de agrupamento, relatamos a sua formulação em média por Schank e Wagner [17] para toda a rede como a razão entre a soma dos produtos dos coeficientes de agrupamento e uma função do peso geral e a função do peso próprio , ou seja, onde é a função de peso geral. A função de peso é geralmente escolhido entre as métricas que capturam melhor a topologia da rede em análise. A menor

Média ponderada coeficiente de agrupamento

medida indica um nó mais importante na relação com a robustez da rede.

Networks foram elaborados e analisados ​​por uma ferramenta autônoma personalizado escrito em C # e construído sobre a biblioteca NodeXL 1.0.1.174 [18].

Resultados

expressão miRNA alterada em pacientes com CRC e PC

Foram comparados os perfis de miRNA de 36 pares de tumores sólidos e tecidos não tumorais adjacentes nas coortes de formação (19 CRC e 17 PC) por meio de microarrays de microRNA. miRNAs humanos (

tem-miR-

) e tecidos foram agrupadas por uma análise de agrupamento hierárquico (Figura 1). Cada sonda plotados foi codificado por cores para igualar o nível de expressão do miRNA em relação ao seu nível de expressão média entre os amostras de tecido todo o conjunto (azul, baixo; vermelho, alto). (Figura 1)

perfis de miRNA de 36 emparelhado amostras de tecido de 19 cancro colorectal (caixa de laranja) e 17 do cancro do pâncreas (caixa verde) pacientes foram agrupados. As 36 amostras pareadas estão em filas (barras coloridas) e os 866 miRNAs estão em colunas. T, tecido de tumor; . N, tecido normal adjacente

diferencialmente expressos miRNA no CRC e PC

A fim de identificar os miRNAs diferencialmente expressos em tecidos normais e tumorais pareadas, duas abordagens foram seguidas: a emparelhado clássica teste t de controlar para a taxa de falsa descoberta (FDR) e uma análise RF. Na primeira análise, 42 miARNs foram diferencialmente expressos em CRC (Tabela 1). Vinte e cinco deles foram sobre-expressos, com

HSA-miR1246

mostrando o valor fold-change mais elevada (12,0 vezes). No PC, 128 miRNAs foram diferencialmente expressos (ver Tabela S2). Em particular, de 34 miRNAs com um p 0,01, 30 apresentaram maiores níveis de expressão no tecido tumoral, com

hsa-miR-23a

exibindo o valor mais alto fold-change (9,3 vezes), enquanto mais 4 miRNAs foram regulados negativamente (Tabela 2).

para averiguar a eventual existência de ortólogos em outras espécies, e usá-los como controle metodológico interno, os miRNAs humanos encontrados alterados nos dois sólida os tumores foram verificadas em 71 outros organismos presentes na matriz: todos os ortólogos de-regulada de miRNAs humanos (de agora em diante,

tem-miR-

será referido como

miR-

) mostrou uma expressão diferencial significativa com semelhante fold-change nestes organismos (Tabela S3).

Para verificar a precisão da RF, performances de classificação em tumor exigentes do tecido normal foram relatados em escalonamento multidimensional das parcelas matriz de proximidade estimados (Figura 2) que apresentam semelhanças ou diferenças nos dados. Para cada tipo de tumor, as fileiras dos miRNAs mais importantes, de acordo com MDA, foram derivados (Figura 3, painéis A e B).

matrizes de proximidade de análise Floresta aleatória, onde

X-

e

y

eixos são coordena o escalonamento multidimensional. Indivíduos com expressões miARN semelhantes são representados por pontos próximos um ao outro, enquanto que indivíduos com expressões miARN dissimilares são representados por pontos separados. Vermelho = tecido tumoral, Preto = tecido normal adjacente.

a redução média de Precisão (MDA) como uma medida de miRNA importância na classificação tecidos tumorais dos normais estimados por análise de floresta aleatória. Os primeiros 42 miRNAs mais importantes no câncer colorretal (painel A) e 50 miRNAs em câncer pancreático (painel B) são mostrados.

Comparação de métodos de detecção de assinatura miRNA

Quando os resultados com o t-teste e RF foram fundidas, uma sobreposição significativa entre os miRNAs detectadas em qualquer CRC e tecidos de PC foi encontrado. Intersectando os miARNs com p 0,001 pelo teste t de análise (Tabela 1) com aqueles com a maior MDA a Rf análise (Figura 3A), a expressão de 24 miARNs foi significativamente alterada em CRC (Figura 4). Por uma abordagem analítica semelhante (Tabela S2, e Figura 3B), 23 miRNAs foram significativamente alteradas em PC (Figura 4).

Para ambos os tecidos uma sobreposição significativa entre os miRNAs detectados foi encontrado através da fusão t-teste e RF resultados. Um grupo de 24 miARNs, cuja expressão foi significativamente alterada nos tumores colorectais, foram obtidos intersecta a lista dos primeiros 42 miARNs com melhores valores de p, a partir de análise de teste-t, com que estão em maior MDA, a partir da análise de RF. Da mesma forma, com 23 miARNs expressão alterada foram seleccionados em tumores pancreáticos. * P 0,001; § RF 4,3; ** P 0,05; # RF . 0,94

Como se mostra na Figura 4, a expressão de miARN foi fortemente tecido específico; na verdade, a maioria dos miRNAs com expressão alterada no CRC não foram differentiallly expresso no tecido tumoral de pâncreas. A expressão alterada de apenas dois miRNA foi partilhada pelo CRC e PC:

miR-145

apareceu 2,2 vezes regulada para baixo (p 0,001) no CRC, e 5,7 vezes sobre-regulada (p 0,01) no PC, enquanto que

miR-1280

foi de 2,1 vezes sobre-regulada (p 0,001) e 2,3 vezes regulada para baixo (p 0,05) nos cancros anteriores e posteriores, respectivamente (ver Tabela 1, tabela 2 e tabela S2).

correlações miRNA e câncer-miR rede

em seguida, procurou-se verificar a inter-relação dos miRNAs selecionados anteriormente expresso em tecidos CRC e PC por meio do Spearman método de coeficiente de correlação

para CRC, diferentes

graus

de correlação foram encontrados para os 24 miRNAs exibem expressão alterada:.

miR-106a

não se correlacionou em tudo, enquanto

miR-195

exibiu o maior número de laços e foi levado como um nó de raiz com 9 bordas (

grau

15,86); 8 ligações foram detectados por

miR-28-3p (

grau

15.66), e 7 ligações para

miR-1280 (

grau

13,79) ,

miR-1246 (

grau

13.05), e

miR-140-3p (

grau

12,12) (Figura 5, painel A) . Os últimos 3 nós também foram interligados com

miR-28-3p, que mostrou um alto valor de intermediação. Para esta última medida, observou-se o maior valor para

miR-1246

nó em que ocorrem muitos caminhos mais curtos entre outros vértices (Tabela S4). Outro nó importante foi representado pelo

miR-18a

com 6 relações, 3 deles estabeleceu com vários miRNAs pertencentes ao

Conjunto de miRNA 17-92a

. Quando medimos o grau de agrupamento nodal (c

abrilhantamento coeficiente

), o

miR-378, miR-10b

e

miR-31

parecia ser um

cliqu

e com vértice no

em> miR-28-3p. Para verificar a robustez da rede, foi calculado o

média ponderada agrupamento coeficiente

, e avaliou a contribuição de um miRNA à compacidade global da rede. Foram observadas as pontuações mais baixas para

miR-1280, miR-195

e

miR-140-3p quais eram os vértices do grafo completo (Figuras 5, painel A e Tabela S4).

pontos verdes representam os nós correspondentes a 24 miRNAs de rede CRC e 23 miRNAs de rede do PC. As bordas caracterizar as correlações significativas, cuja espessura reflete coeficientes de correlação de Spearman (azul e bordas verdes são utilizadas para correlações positivas e negativas, respectivamente). Na rede CRC, como mostrado no painel A, m

IR-195, miR-28-3p, miR-1280, miR-18a

e

miR-1246

exibem o mais alto

ponderada classificação

grau. Nenhuma correlação é encontrado em

miR-106a

.

MiR-1246

tem também o mais elevado

betweenness

rank. Na rede de PC, como mostrado no painel B,

miR-103, miR-23a

e

miR-15b

têm a maior

graus

e estão todos ligados a

miR-199-3p

, bem como uns aos outros formando um quatro nós

clique

. Além disso, a remoção desses nós faz com que a queda mais profunda da classificação média coeficiente de agrupamento.

miR-384

apresenta a maior medida betweenness centralidade.

Vinte de 23 miRNAs com uma desregulamentação significativa em tecidos de PC estavam ligados a outros vértices da rede por um número de arestas variando de um a cinco (

grau

: 8,88-1,92); por apenas 3 miRNAs (ou seja,

miR-30d *, miR-1280 Comprar e

miR-493 *

) não foi observada correlação significativa (

grau

: 0), ( A Figura 5, painel B). Em particular, o número máximo de ligações foi encontrada para

miR-103

(

grau

: 8,88),

miR-23a

(

grau

: 8,84) e

miR-15b

(

grau

: 8,38). Estes 3 nós principais foram todos ligados a

miR-199-3p

(grau: 6,03) e estes quatro miRNA apareceu inter-cruzados para constituir um grupo exclusivo de quatro nós. Observou-se a medida de maior betweenness centralidade para

miR-384

(

betweenness

: 0,31), encontrado para ser posicionado de forma crítica entre (assim, responsáveis ​​de muitos) correlações de médio alcance. Verificamos a essencialidade do quatro nós

clique

medindo a robustez global da rede (em termos de caminhos de redundância) após a sua remoção. Nós calculamos o

média ponderada coeficiente de agrupamento Compra de toda a rede através da remoção, por sua vez um nó. Em particular, depois de excluir os nós do

clique

(

miR-103, miR-15b, miR-199-3p

e

miR-23a

) os níveis mais baixos , ou seja, 5.78, 5.85, 6.05 e 6.14 foram obtidos, respectivamente. Esta constatação aponta para esses nós como constituinte funcionalmente relevantes e como considerável da coesão da rede (Figura 5, painel B e na Tabela S4).

Validação qPCR

Entre miRNAs significativamente desregulados em o estudo microarray, 18 foram selecionados para posterior validação por quantitativa PCR em tempo real (qPCR). A selecção destes miARNs baseou-se em dois critérios: o resultado da análise de intersecção anteriormente descrito, e /ou o seu envolvimento na tumorigénese cólon ou pâncreas (de acordo com os dados da literatura). Quantitative PCR foi aplicada para analisar a expressão alterada dos miARNs seleccionados, bem como a do controlo RNAU6, no tumor e tecidos normais feita a partir de uma nova coortes de validação de 14 pacientes com CCR e 21 pacientes de PC.

em comparação com o tecido normal com um perfil de expressão normalizada como 1, em amostras de tumor de 14 pacientes de CRC observou-se um aumento da regulação significativa durante 3 miARNs (

miR-31, o miR-21

e

miR- 708

), e sob a expressão em outras 7 (

miR-145, miR-139-5p, miR-486-5p, miR-378, miR-140-3p, miR-143

e

miR-30c

) (Tabela 3). Os restantes 8 miRNAs (

miR-151-5p, miR-155 *, miR-17, miR-199-5p, miR-23a, miR-30a-5p, miR-455-3p e miR-let- 7i

) não apresentaram expressão alterada significativamente.

na coorte de 21 pacientes de PC, 13 de 18 miRNAs foram analisadas por qPCR no tecido tumoral em comparação com amostras normais. Down-expressão foi observada somente para

miR-21

, ao passo que a sobre-expressão foi observada em 12 miRNA (

miR-143, miR-145, miR-151-5p, miR-155 *, miR -199a-5p, miR-23a, miR-30a, miR, 30c, miR-21, miR-455-3p, miR-708 Comprar e

miR-let-7i

) e apenas dois foram não desregulada de uma forma estatisticamente significativa (

miR-30a e

miR-30c) (Tabela 3).

Discussão

miRNAs que são diferencialmente expressos em vários cancros podem participar em vias de regulação alterados comuns [19]. Assim, o conhecimento da sua rede interagindo pode fornecer uma perspectiva de miARNs alterados e o seu padrão de desregulação (isto é, a montante ou a infra-regulação). Neste estudo, nós perfilado miRNAs em dois tecidos de câncer de sólidos diferentes, o CRC e PC, para testar se quaisquer “assinaturas” plausíveis era detectável. Para este propósito, que inicialmente parecia para miARNs diferencialmente expressos em tumores e tecidos normais das duas linhagens diferentes, e subsequentemente identificado miARNs “específicos de tecido” usando uma abordagem estatística romance, isto é, o classificador de RF. Para cada tecido de cancro que foram capazes de gerar uma lista dos miARNs mais específicos e significativamente desregulados. Curiosamente, nas duas listas apenas dois miRNAs recorreram mas com padrões opostos de expressão:

miR-145

e

miR-1280

. No entanto, enquanto diferentes padrões de expressão de

miR-145

são reconhecidos [20], nada se sabe sobre

miR-1280

e seu comportamento no tumor sólido.

Uma análise abrangente das redes interactivas destes miRNAs mostrou que seus padrões de desregulamentação são tecidos específicos, como conexões diferentes (ou seja, diferentes padrões de correlação) foram observadas entre eles nas duas linhagens. Além disso, determinou-se os miRNAs mais críticos e verificou-se que eles eram diferentes na CRC e em redes de PC.

Para entender os mecanismos de regulação dos miRNAs ligadas com conexões significativas em ambas as redes, realizamos um de três etapas

in silico

análise. Primeiro, classificou nós por meio de índices de centralidade bem conhecidas: ponderada

grau

e

betweenness

. Enquanto o primeiro índice fornecido informações sobre o efeito directo exercido por cada nó para sua vizinhança (no nosso caso, sua correlação), este último identificado nós essenciais para correlações indiretas, ou seja, nós que se encontram em vias de correlação e que de alguma forma contribui para a de longo alcance correlações. Consequentemente, classificou os nós com o

coeficiente de agrupamento

índice, a fim de medir o seu grau de coesão com os vizinhos imediatos. O objetivo foi quantificar a robustez das redes, ao olhar para os nós que de outra forma perturbar a arquitetura de redes, quando não é levado em conta. Para este fim, nós calculado o coeficiente de cluster para toda a rede, removendo ciclicamente um nó com bordas correspondentes, e empregando o

ponderada grau

como função peso. Geralmente, as redes que faltam os nós essencial para a robustez global exibiu pontuações mais baixas.

Como último passo, nós validado a nossa

in silico

estimativas inspecionando manualmente genes-alvo e suas vias de sinalização. Com estas abordagens, observamos que a maioria dos miRNAs com os padrões de desregulamentação semelhantes foram associados com genes alvo ordinárias e /ou vias de regulação (ver Tabela S5). Em particular, no CRC foram encontrados três nós principais:

miR-195, miR-18a

e

miR-1246. O primeiro nó teve uma alta relação com miRNAs envolvidos na via de sinalização MAPK, como mostrado

in silico

análise usando DIANA-mirPath (https://diana.cslab.ece.ntua.gr/pathways/index_multiple .php), excepto

miR-31 e miR-28-3p

, que pertencem à via EGF. O segundo nó, o

miR-18a

, incluiu vários miRNAs (

miR-17, miR-19b,

miR-92a), pertencente ao mesmo grupo: o

miRNA 17- 92a

.