Sumário

Objectivo

Para investigar o efeito inibitório do ácido B pseudolaric em xenoenxertos subcutâneos de adenocarcinoma gástrico humano e os mecanismos moleculares subjacentes envolvidos na sua resistência a múltiplas drogas.

métodos

células adenocarcinoma gástrico SGC7901 humanos e células SGC7901 /ADR resistentes a drogas foram injetadas em ratos nus para estabelecer um modelo de xenoenxerto subcutâneo. Os efeitos do ácido B pseudolaric com ou sem tratamento com a adriamicina foram comparadas através da determinação do tamanho e peso do tumor. A ciclo-oxigenase-2, proteína níveis de expressão de P-glicoproteína kinaseC-α e foram determinados por imunohistoquímica e western blot.

Resultados

Pseudolaric ácido B suprimiu significativamente o crescimento do tumor induzida por SGC7901 células e células SGC7901 /ADR. A combinação de ácido B pseudolaric e adriamicina a quimioterapia tradicional droga exibiu efeitos inibidores mais potentes sobre o crescimento de cancro gástrico in vivo do que o tratamento quer com ácido B pseudolaric ou adriamicina sozinha. níveis de ciclo-oxigenase-2 a expressão da proteína, a proteína kinaseC-α e glicoproteína-P foram inibidos pelo ácido pseudolaric sozinho ou em combinação com adriamicina em xenoenxertos de células SGC7901 /ADR B.

Conclusão

ácido Pseudolaric B tem um efeito inibidor significativo e um efeito inibitório aditivo em combinação com adriamicina sobre o crescimento do cancro gástrico, in vivo, o que inverte a resistência a múltiplos fármacos de neoplasia gástrica à quimioterapia por regulação negativa da Cox-2 /PKC-α /P- gp /MDR1 via de sinalização

Citation:. Sun Q, Li Y (2014) O Efeito Inibidor de Pseudolaric ácido B sobre Câncer gástrico e multirresistência via Cox-2 /PKC-α /P-gp caminho. PLoS ONE 9 (9): e107830. doi: 10.1371 /journal.pone.0107830

editor: Soumitro Pal, do Hospital Infantil de Boston Harvard Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de maio de 2014; Aceito: 20 de agosto de 2014; Publicação: 24 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Sun, Li. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Science Foundation Programa de Ciência Municipal Shenyang e Bureau Tecnologia (1091136-9-02). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é um dos cancros mais comuns do mundo [1], e quimioterapia é uma importante estratégia contra câncer gástrico [2]. Uma vez que vários fármacos quimioterapêuticos de classes diferentes são usados ​​para tratar o cancro gástrico, a sensibilidade de drogas anticancro para o cancro gástrico diminui gradualmente, e resistência a muitos fármacos diferentes com diferentes estruturas químicas e diferentes mecanismos de acção pode ocorrer. Este tipo de resistência é chamado resistência a múltiplas drogas (MDR) e diminui significativamente a eficiência da terapia de cancro gástrico. MDR está se tornando um grande problema para o tratamento do câncer de sucesso [3]. Foi descoberto que a razão principal para MDR no cancro é a sobre-expressão de P-glicoproteína (P-gp), um produto do gene MDR1 humano. P-gp é uma bomba de efluxo dependentes de ATP, que pode diminuir a acumulação de drogas em células de cancro. Propõe-se que a P-gp, um biomarcador bem aceite de MDR, também deve ser considerado como um alvo molecular no cancro resistente a múltiplas drogas [4]. Estudos recentes têm demonstrado que em células de cancro com MDR, os níveis de expressão de ciclo-oxigenase-2 (COX-2) e uma isoforma de proteína kinaseC (PKC-α) são ambos regulados positivamente, e a sua inibição pode inverter neoplásica MDR [5] – [10].

ácido Pseudolaric B (PAB, Figura 1), um ácido diterpeno isolado da raiz e tronco casca da árvore

pseudolarix kaempferi

Gordon (Pinaceae), é usado em medicina tradicional chinesa para o seu amplo espectro de características biológicas, tais como efeitos anti-fúngicos e efeitos anti-fertilidade. Além disso, os seus efeitos anti-angiogénicos também têm sido gradualmente reconhecido nos últimos anos [11], [12]. Estudos recentes têm demonstrado que PAB induz a inibição do crescimento, a paragem do ciclo celular e apoptose. Além disso, PAB inverte a multirresistência de células de câncer [13], [14]. PAB suprime o crescimento da linha celular neoplásica AGS gástrica e induz a sua apoptose [15]. Nossas pesquisas anteriores demonstraram que PAB também tem um efeito inibitório sobre as células dramática SGC7901 cancro gástrico humano in vitro [16]. No entanto, estudos in vitro do efeito anticancerígeno do PAB são raros, e nem a eficácia in vivo deste novo composto de ervas contra tumores nem seu mecanismo molecular preciso contra a MDR foi totalmente investigado.

O objetivo do presente estudo é avaliar o efeito anti-neoplásico de PAB in vivo, incluindo a reversão da MDR, utilizando um modelo de xenoenxerto em ratinhos nus e explorar se mecanismo molecular subjacente de PAB é relacionada com a inibição da MDR através da Cox-2 /PKC-α /via de P-gp.

Materiais e Métodos

Materiais

RPMI-1640 e meio de cultura de soro fetal bovino (FBS) para cultura de células foram adquiridos a Gibco BRL, Gaithersburg, MD, EUA. anti-COX-2 monoclonal de anticorpo de coelho, rato anti-PKC-alfa e de murganho de anticorpos monoclonais anti-P-gp foram adquiridos a partir de Santa Cruz Corporation, CA, EUA. anticorpos secundários contra a anticorpos de coelho e de ratinho, estreptavidina-peroxidase (SP) kits, e 3,3′-diaminobenzidina (DAB) foram obtidos a partir de Pequim Zhongshan Biotecnologia, China. kits de ensaio da proteína BCA e SDS-PAGE kits de preparação de gel foram obtidas do Instituto de Biotecnologia Beyotime, Xangai, China. PAB foi comprado pelo Instituto Liaoning de Controle de Drogas, China No. 201003 (pureza: 98%). A adriamicina (ADR) foi obtido a partir de Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., China No. 120906. Tween80 e polietileno-glicol foram adquiridos da Sigma Chemical, St. Louis, MO, EUA.

cultura celular

células adenocarcinoma SGC7901 gástrico humano foram cultivadas no laboratório central do Shengjing Hospital Filiado à Universidade médica da China [16], e as células SGC7901 /ADR resistentes à adriamicina foram dotados de Instituto de Doenças digestivas em Xijing Hospital Filiado à Quarta Universidade médica Militar [17]. células de adenocarcinoma SGC7901 gástrico humano e células SGC7901 /ADR resistentes à adriamicina foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% FBS e antibióticos (penicilina 100 U /ml e estreptomicina) com 5% de CO

2 numa incubadora humidificada a 37 ° C. ADR (1 ug /ml) foi adicionado ao meio de cultura de células SGC7901 /ADR para ajudar a manter a sua MDR. As células na fase de crescimento logarítmico foram centrifugadas e diluída com meio RPMI-1640 para preparar suspensões de célula única com uma concentração de 2,5 × 10

6 /ml para a semeadura.

O estabelecimento de um modelo de xenoenxerto de murganhos glabros

O in vivo do efeito antitumoral de PAB foi examinada num modelo de xenoenxerto de murinos. Para o modelo, macho 4-6 semanas de idade e imunodeficientes fêmea BALB /c (nu /nu) ratos, pesando 18-22 g, foram adquiridos a partir de Pequim HFK Bioscience Co., Ltd. (China) e mantidos em instalações acreditados sob condições padrão para roedores (grau SPF) no Departamento de Ciência animal Laboratory. Cinquenta ratos foram seleccionados e aleatoriamente divididos em dois grupos (25 por grupo). Um total de 25 ratinhos foram injectados subcutaneamente com 2,5 × 10

6 /ml SGC7901 células em 0,2 ml de meio RPMI-1640 para a axila esquerda, e os outros 25 ratinhos foram injectados com células SGC7901 /ADR na região axilar direita sob condições livres de germes.

grupos experimentais e medicação

Sete dias após o implante celular, os tumores se tornaram palpáveis ​​(aproximadamente 3 mm x 3 mm de diâmetro) e, em seguida, os dois grupos injectados com dois tipos diferentes de células foram aleatoriamente divididos em cinco subgrupos (5 ratos por grupo): solução salina normal (NS) do grupo controle, grupo controle TWEEN, grupo ADR, grupo PAB, e PAB + grupo ADR. Para os grupos de PAB, Pab (25 mg /kg /d em 0,1 mL) dissolvido numa solução aquosa de polietileno glicol 6%, 3% de etanol, e 1% de Tween 80 foi administrada por via intraperitoneal (i.p.) diariamente durante 20 dias [13]. Um volume idêntico de solução aquosa ou NS foi injetado no grupo grupo controle TWEEN ou controlo NS, respectivamente. Para o grupo de ADR, ADR (1,25 mg /kg em 0,1 ml i.p.) diluído em solução fisiológica foi administrada por dia durante 20 dias [18]. ratinhos portadores de tumor foram administrados quer por via i.p. Pab (25 mg /kg /d) e ADR (1,25 mg /kg /dia) para o mesmo período no grupo PAB + ADR. Após o tratamento, os ratinhos de cada grupo foram sacrificados, e amostras de tumor de regiões axilares bilaterais foram pesados ​​e ressecado para imuno-histoquímica e análise de Western blot. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal do Shengjing Hospital Filiado à China Medical University (número de autorização: 2013PS144K). Os ratos foram sacrificados sob anestesia 10% de hidrato de cloral, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Medição e cálculo do volume do tumor e peso

O peso corporal foi monitorado a cada dia, e dois diâmetros perpendiculares (comprimento e largura em milímetros) de tumores foram medidos a cada dois dias com compassos de calibre ao longo do período de tratamento. Os volumes dos tumores foram calculados utilizando medições bidimensionais e calculada como se segue: volume do tumor (mm

3) = comprimento (mm) x largura

2 (mm) /2. O volume relativo do tumor (RTV) foi calculada como se segue: RTV = (volume médio de tumor durante o tratamento) /(volume médio de tumor no início da terapia). Os efeitos antitumorais de PAB e /ou ADR foram estimados com a taxa média de inibição (IR) do crescimento do tumor utilizando a seguinte equação: IV (%) = [(1-significativo RTV do grupo tratado com fármaco /média de RTV do grupo de controlo NS ) x 100] [19]. O peso corporal relativa de ratinhos foi calculada usando o W

t /W

0 índice, em que W

T era o peso do corpo no dia da medição, e W

0 é o peso corporal em o primeiro dia de tratamento. A alteração no peso corporal nos dias 1 e 20, que representam o início e final do experimento, respectivamente, foi utilizado para avaliar e analisar os efeitos das drogas sobre o peso do corpo [20].

coloração imuno-histoquímica para a expressão de Cox-2, PKC-alfa e P-gp

espécimes de tumor foram fixadas com paraformaldeído, processado rotineiramente pela inclusão em parafina, e, em seguida, cortada em secções de 4