Abstract

Fundo

A análise de amostras tumorais de mutações está se tornando cada vez mais importante na condução de terapia personalizada no câncer. Como terapias mais específicas são desenvolvidas, as opções para o levantamento mutações em vários genes numa amostra de tumor único se torne cada vez mais atraente e deverão tornar-se o esteio de diagnóstico molecular no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) no futuro.

Materiais e Métodos

238 cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) amostras de tumor foram analisados ​​por meio de um painel personalizado de 82 ensaios de mutação em 14 oncogenes incluindo

KRAS Comprar e

EGFR

usando Sequenom Iplex Matrix Assisted Laser dessorção /ionização Time of Flight Espectrometria de Massa (MALDI-TOF). Foram comparados os dados gerados para

KRAS

mutações para os detectados pelos Amplification Refractory Mutation System (ARMS) com base DxS TheraScreen K-RAS Mutation Kit.

Resultados

Os braços detectado mutações em 46/238 amostras tumorais. Para amostras com mutações detectadas por ambas as abordagens, observou-se 99,1% de concordância geral. O método MALDI-TOF detectado um adicional de 6 amostras como

KRAS

dados positivos e também forneceu mutação no mutações concomitantes incluindo

PIK3CA

e

TP53

.

conclusões

O método Sequenom MALDI-TOF fornece uma abordagem baseada no painel sensível que faz uso eficiente de amostras de diagnóstico dos pacientes. Esta tecnologia pode proporcionar uma oportunidade para um rastreio abrangente de biomarcadores relevantes para a clínica mais cedo na gestão da doença, sem a necessidade de repetição de biópsia e permitir a análise a jusante adicional no NSCLC onde o tecido disponível pode ter sido esgotado.

Citation : Sherwood JL, Müller S, Orr MCM, Ratcliffe MJ, Walker J (2014) Painel Based MALDI-TOF tumor Profiling é um método sensível para a detecção de mutações em clínica não pequenas células Lung Cancer tumor. PLoS ONE 9 (6): e100566. doi: 10.1371 /journal.pone.0100566

editor: Anthony WI. Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 21 de março, 2014; Aceito: 23 de maio de 2014; Publicação: 23 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Sherwood et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Os dados estão disponíveis em números do manuscrito e do quadro suplementar

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela AstraZeneca. O financiador prestou apoio nos ofmsalaries de formulário para autores JLS, MCMO, MJR, e JW e Sequenom GmbH por autor SM, mas não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados ou análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Conflito de interesses: JLS, MCMO, MJR, e JW são funcionários da e manter acções de AstraZeneca, cuja empresa financiou este estudo. SM é um funcionário da Sequenom GmbH. As patentes relativas à selumetinib são como se segue: patenttitle patentid, US200903005, 8, tosilato de sal de cloridrato de 6- (4-br0m0-2-chl0r0phenylamin0) -7-fluoro-N- (2-hidroxietoxi) dazole -3-metil-3H-benzimi – 5 – carboxamida, inibidor MEK úteis no tratamento do cancro, US200924627, 4 farmacêutica composição US201013051 271, 9 terapia de combinação compreendendo AZD2171 e AZD6244 ou MEK-inibidor. II, US200323286, 9 N3 derivados de benzimidazole alquilados como inibidores da MEK, us7842816 derivados de benzimidazole alquilados N3, tal como inibidores de MEK, derivados de benzimidazole US7777050 N3 alquilados como inibidores da MEK, derivados de benzimidazole US7576114 N3 alquilados como inibidores da MEK, US8193229, método de tratamento utilizando derivados de benzimidazole alquilados N3 como inibidores de MEK, US8193230, composições que compreendem os derivados de benzimidazole alquilados N3, tal como inibidores de MEK e métodos de utilização dos mesmos, us7235537, N3 derivados de benzimidazole alquilados como inibidores da MEK, US7973170, N3 derivados de benzimidazole alquilados como inibidores da MEK, US8003805, N3 derivados de benzimidazole alquilados como inibidores da MEK , US7425637, N3 alquilados derivados de benzimidazole como inibidores de MEK, US8178693, N3 alquilados derivados de benzimidazole como inibidores de MEK. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

NSCLC representa cerca de 85% de todos os cânceres de pulmão [1]. Cerca de 20% dos caucasianos com NSCLC, subindo para mais de 26% das pessoas com adenocarcinomas (ADC) têm mutações ativadoras no

KRAS

[2]. populações asiáticas têm um

KRAS

ocorrência de mutação de 11% na ADC. Mutações no

EGFR

estão presentes em 48% dos asiáticos NSCLC ADC contra 19% no ADC caucasiana.

EML4-ALK

mutações estão presentes em 6% de caucasianos NSCLC ADC e 5% de ADC asiática [2]. A análise molecular de aberrações em

EGFR

e

ALK

está bem estabelecida e utilizada para identificar os pacientes adequados para terapias-alvo, como os inibidores de EGFR de tirosina quinase (TKI) gefitinib, erlotinib e afatinib, e

ALK

inibidores tais como crizotinib [3].

KRAS

é um importante marcador emergentes no NSCLC. O valor clínico de estabelecer

KRAS

estado de mutação pode aumentar se o desenvolvimento de inibidores de MEK em NSCLC com KRAS mutante entregar resultados risco-benefício positivo para os pacientes. MEK é conhecido por ser um efector a jusante de

sinalização KRAS

e tem sido implicada na proliferação de células e o crescimento do tumor. Selumetinib (AZD6244, ARRY-142886) é um potente e selectivo não-competitivo do ATP-MEK1 inibidor, /2 [4]. A fase II do ensaio clínico recente (NCT00890825) comparou a eficácia da selumetinib em combinação com docetaxel em comparação com o docetaxel isoladamente em pacientes pré-tratados com

KRAS

cancro do pulmão mutação-positivo localmente avançado ou metastático de não pequenas células. A sobrevivência mediana global foi de 9,4 meses (6.8-13.6) no grupo selumetinib e 5,2 meses (CI de 95% de 3,8-não calculável) no grupo de placebo (taxa de risco (RR) para a morte was0 · 80, 80% CI · 0 56 -1 · 14; unilateral p = 0,21). sobrevida livre de progressão mediana foi de 5 · 3 meses (4 · 6-6 · 4) no grupo selumetinib e 2,1 meses (IC 95% 1,4-3,7) no grupo placebo (HR para a progressão 0,58, IC 80% 0,42-0,79 ; p unilateral = 0,014) [5]. A eficácia da selumetinib no tipo selvagem

KRAS

NSCLC ainda não foi estabelecida. Outros inibidores de MEK em desenvolvimento incluem cobimetinib (GDC-0973, XL-518) e trametinib. Este último foi recentemente aprovado para uso pela FDA em

BRAF V600E

mutado melanoma. Demonstração de um benefício clínico clara em um

KRAS

população NSCLC mutação-positiva levando a droga aprovação iria conduzir a necessidade de identificar relevantes

KRAS

mutações em pacientes com NSCLC no momento do diagnóstico, além de

EGFR

e

ALK

aberrações, para informar as decisões de tratamento.

no ensaio NCT00890825 as Armas baseado DxS TheraScreen K-RAS Mutation Kit foi utilizado para identificar prospectivamente

KRAS

pacientes mutação-positiva elegíveis para randomização e tratamento. BRAÇOS metodologia foi seleccionado, uma vez que fornece a sensibilidade e especificidade superiores em parafina e fixado em formalina incorporado (FFPE) material, quando comparado com a sequenciação directa [6], [7]. No ensaio clínico definir este método baseado qPCR pode ser realizada com uma volta rápida em torno do tempo em pequenos números de pacientes que as amostras foram recebidas.

Em outro recente julgamento de selumetinib no melanoma cutâneo, NCT00936221 [8], as amostras foram analisados ​​utilizando uma combinação de armas e metodologias de sequenciamento para testar a

BRAF

mutações no códon V600.

O Pro tecnologia MALDI-TOF Sequenom Iplex permite múltiplas mutações em amostras de FFPE a ser analisado em um reações individuais de investigação, usando PCR multiplex [9]. A tecnologia utiliza pequenos (~ 80 pares de bases) amplificação por PCR do produto que é óptima para a amplificação de moldes de ADN fragmentados, tais como os extraídos das amostras tumorais FFPE. A seguir à amplificação, um único passo de extensão do par de bases é realizada no local da base mutada de interesse com uma massa modificada ddNTP mistura de terminação. A vantagem desta abordagem é a capacidade de resolver os quatro bases nos espectros. O fragmento resultante, com base modificada no local da mutação, são então analisados ​​usando o espectrómetro de massa Sequenom MassARRAY que é concebido e optimizado especificamente para a detecção de ácido nucleico. Uma clara vantagem deste sistema é a capacidade de identificar qualquer base mutante na posição determinada significando um ensaio abrange todas as três alterações de bases possíveis sem a necessidade de um ensaio separado para cada mutação potencial. Por exemplo a mutação Gly12Cys em

KRAS

é causada por um G T transversão na posição 34. Sequenom Iplex Pro irá detectar qualquer mutação nesta posição de base, incluindo as mutações Gly12Arg e Gly12Ser causadas pelo L transição C e G a Transversão respectivamente. Isso reduz a necessidade de DNA molde e, portanto, minimiza a demanda de tecidos.

Aqui nós relatamos como o método MALDI-TOF compara às armas como um método para detectar

KRAS Comprar e

BRAF

mutações em amostras clínicas e como o uso de um painel multiplex nos permitiu avaliar a prevalência de mutações menos comuns em nossa coorte NSCLC.

Materiais e Métodos

Análise tumor Amostra

as 238 amostras de doentes com NSCLC veio do estudo NCT00890825 [5].

177 amostras de melanoma a partir do estudo NCT00936221 [8] também foram recolhidas e processadas como descrito no Robert et ai [8].

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com a Declaração de Helsinki (1964, alterado em 1975, 1983, 1989, 1996 e 2000) da Associação médica Mundial e todas as amostras de doentes submetidos para análise foram feito com o consentimento informado completo do pacientes

Patologia

pacientes nesta coorte NSCLC forneceram uma amostra de tumor que data de histologicamente entre maio de 2007 e maio de 2010. As amostras foram confirmadas ou citologia como estágio IIIB-IV NSCLC seguinte H e. coloração por um histopathologist qualificada na Labcorp Centro de Biologia Molecular e Patologia (CMBP), Research Triangle Park, NC, EUA.

ácido nucleico extração

extração do ácido

nucleico foi realizado em Labcorp CMBP, Research Triangle park, NC, EUA, a partir de 4 x 5 mm de FFPE, com remoção de parafina por fusão.

extracção de ADN foi realizada utilizando o kit Qiagen QIAamp DNA Mini (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha), de acordo para a inserção de kit. Eluição foi em 100 mL de água.

DNA foi quantificada utilizando o kit TaqMan RNase P Detecção de Reagentes e TaqMan Universal PCR Mastermix (Applied Biosystems, Carlsbad, Califórnia, EUA) para estabelecer o rendimento amplificável.

KRAS

mutation Análise de status

amostras de tumor foram avaliados prospectivamente para

KRAS

estado de mutação usando o TheraScreen K-RAS ARMS mutation Kit (QIAGEN Manchester [anteriormente DxS Ltd], Manchester, UK).

Quantitative Reação em Cadeia da polimerase (qPCR) foi realizada utilizando um sistema de 7900 qPCR ABI Prism (Applied Biosystems).

KRAS

análise de mutações foi realizada por Labcorp CMBP, Research Triangle Park, NC, EUA.

Uma alíquota do DNA restante foi fornecido para Sequenom GmbH, Hamburgo para análise usando Sequenom Iplex química e MALDI-TOF.

Sequenom Iplex Pro Ensaio Design by

a Tabela 1 mostra o painel personalizado de ensaios de mutação que foi projetado para mutações em 14 oncogenes ou seja,

BRAF, CDNK2A, CTNNB1, EGFR, ErbB2 FGFR, HRAS, KRAS, STK11, MET, as ARN, TP53, PIK3CA

e

PTEN

. As mutações foram seleccionados com base na freqüência conhecida em NSCLC ou melanoma, significado biológico ou a presença de quaisquer “hotspots” significativos prestando-se a ensaios direcionados [2], [10] – [13].

A mutação a análise foi realizada a Sequenom GmbH (Hamburgo) e consistiu em 10 multiplex contendo 82 ensaios para detectar mais de 160 mutações diferentes. O protocolo padrão do fabricante foi seguido [9]. Em suma, 2 ul de DNA genómico modelo foi amplificado por PCR em multiplex para estender de tipo selvagem (WT) e mutantes de ADN, seguido por um tratamento de camarão-fosfatase alcalina para remover os nucleótidos em excesso. Em seguida, uma reacção de extensão do iniciador (Iplex Pro) foi realizada com os nucleótidos terminadores modificados em série, e os produtos foram manchados em um SpectroCHIP (Sequenom). As massas distintas foram determinadas por MALDI-TOF espectrometria de massa. Os dados foram analisados ​​usando o software MassARRAY Tipos Analyser (Sequenom) [9].

Resultados

Análise Taxas de Sucesso

yield DNA variou de -10 cópias genómicas por mL de ~30,000 cópias por mL com uma média de 1837 exemplares por mL (5,9 ng /mL). Onze amostras com número muito baixo de cópia (≤ 10 cópias por mL) falhou análise utilizando o kit ARMS. Todas as amostras foram analisadas com sucesso utilizando o painel de MALDI-TOF.

Comparação entre MALDI-TOF Painel e Kit ARMS para

KRAS

em NSCLC

238 amostras foram analisadas utilizando os ARMS kit que foi concebido para detectar o seguinte 7

KRAS

mutações: G12C /R /S /V /a /D e G13D. 46/238 (19%) amostras de pacientes foram classificados como

KRAS mutante

positivo pelo teste ARMS. O método de MALDI-TOF cobre G12C /R /S /V /A /D, G13D /V /A /E e Q61L /R /P /E /K /h. 53/238 (22%) amostras foram classificadas como

KRAS

positiva por MALDI-TOF, com um paciente que tem duas mutações separados, um no códon 12 e um no códon 61.

A

KRAS

ensaio de mutação A146 foi incluído no painel de MALDI-TOF e não há mutações foram detectados, consistente com relatórios anteriores que sugerem essa mutação particular, embora relevante no cancro colo-rectal, não é importante em NSCLC [12], [14] .

Concordância de MALDI-TOF método com Kit ARMS

a concordância entre as duas plataformas foi determinada usando dados de amostras que foram avaliados por ambos os métodos (ou seja, excluímos as 11 amostras que falharam por ARMS Método). O método MALDI-TOF detectado 6 (13%) mais

KRAS

mutações no total, em parte devido à cobertura alargada (Tabela 2 3). Para essas mutações detectáveis ​​por ambas as plataformas do acordo percentual positivo (PPA) entre o método braços e método MALDI-TOF foi de 97,8% (Tabela 4) e o acordo percentagem global (OPA) foi de 99,1%. A especificidade da plataforma Sequenom em amostras que tipo selvagem por ARMS foi de 98,3% (acordo percentagem negativa).

As duas amostras discordantes incluiu uma amostra em que MALDI-TOF detectada uma mutação G12D com o resultado do ensaio BRAÇOS excedendo os critérios descritos no folheto informativo do kit para um resultado positivo. Na segunda amostra, MALDI-TOF gerado nenhum sinal detectável, enquanto ARMS detectou um G12C. A explicação mais provável para isto é que a elevada proporção de ADN do tipo selvagem pode ter excedido a sensibilidade analítica do padrão Pro Iplex química. Foi demonstrado por este grupo (dados não publicados) que este painel foi capaz de detectar mutações de forma robusta para baixo a 5% (limite da nossa análise) usando misturas de linhas celulares.

Portanto, a plataforma Sequenom MassARRAY executa no menos tão bem em (OPA = 99,1%) a avaliação

KRAS

estado de mutação em amostras de NSCLC FFPE disponíveis clinicamente como a plataforma oS BRAÇOS (Tabela 4), com sensibilidade analítica melhorada (Tabela 3).

prevalência de outras mutações em NCT00890825 NSCLC Cohort

Os dados MALDI-TOF foi gerado em mutações adicionais, incluindo códon 12, 13 e 61 em

HRAS

e

ARN

e códon 600 em

BRAF

. 107 das 238 amostras (45%) foram positivos para pelo menos uma mutação (ver Tabela S1). 52/238 (22%) dos pacientes tinham mutações em

KRAS

, consistente com prevalência esperada em NSCLC [2] (Tabela 5).

ARN

mutações foram detectadas em 5 pacientes (2,1%), incluindo 3 Q61 mutações, um G12 e uma mutação G13. Havia 3

BRAF V600E

amostras mutantes e 2

HRAS

amostras mutantes nos códons Q61 e G12.

Um número de conhecidos

TP53

mutações foram investigada e verificou-se estar presente em 23/238 (10%) dos pacientes. Deve-se notar que o ensaio de MALDI-TOF única interrogado 10/480 (2%) de substituições que têm sido relatados em pulmão por telas sistemáticas no banco de dados CÓSMICA [13], apesar de serem as 10 bases mutadas mais comuns aí reportados ( tabela 5).

EGFR

mutações foram detectadas em 20/238 (8,8%) de nossas amostras. Este é um pouco menor do que o esperado a partir de relatórios anteriores que sugerem

EGFR

mutações estão presentes de 10% a 15% em caucasianos com NSCLC [15]. Uma série de fatores podem ter contribuído para a baixa prevalência de

EGFR

mutações em nosso estudo. Em primeiro lugar 9% de nossas amostras eram carcinoma de células escamosas, que têm muito menor incidência de

EGFR

mutações do que ADC. Em segundo lugar, não podemos descartar a pré-selecção local dos pacientes para o nosso estudo, devido ao conhecimento do

seropositividade KRAS

depois dos testes local,

EGFR

assuntos positivos sendo desviada para terapia de TKI ou aumento da proporção de indivíduos com história de tabagismo, o que seria menos provável que tenha

EGFR

mutações [2], [12].

concomitância de mutações em NSCLC

10/52 (19%) dos pacientes com

KRAS

mutações tinham mutações concomitantes, o mais comum dos quais eram

TP53

,

PIK3CA

e

CDNK2A

. A Figura 1a. mostra a possibilidade da ocorrência de mutações em cada amostra de tumor que continham pelo menos uma mutação, n = 107.

B).

KRAS

amostras mutantes em NCT00890825 com mutações concomitante.

Figura 1B. mostra as 10 amostras que foram

KRAS

positivos e tinham mutações concomitantes. Quatro amostras tinham

TP53

mutações que eram ou no

TP53

R282 ou o DNA R175 ligação mutações no domínio. Ambas estas mutações estão no top 6 mais frequente

TP53

mutações encontradas no cancro e são prejudiciais para a função TP53 [16].

Duas amostras tinham um

KRAS

mutação G12D co-ocorreram com uma activação

PIK3CA

mutação. Concomitância destas mutações foi observado anteriormente [12]. Uma amostra continha uma mutação R248C no

FGFR

domínio extra-celular que foi coincidência com o

KRAS

G12C.

FGFR3

mutações estão presentes em cerca de 3% no câncer de pulmão [17] e a mutação R248C é conhecido por dirigir a formação do tumor em modelos de xenotransplante que foram inibidas por ponatinibe inibidor da multi-quinase.

One amostra com um

KRAS

mutação mostrou uma mutação concomitante com um

EGFR

T790M mutação.

KRAS Comprar e

EGFR

mutações ativadoras são geralmente considerados de ser mutuamente exclusivos [18] no entanto, eles têm sido observadas em frequências muito baixas [19], [20]. A mutação T790M é conhecido para conferir resistência a

EGFR TKI de

. Excepcionalmente, esta amostra também continha um

KRAS

mutação dupla e uma

PTEN

mutação. Deve notar-se que a concentração de ADN foi extremamente baixa na amostra e posterior confirmação por sequenciação não era possível.

Desempenho do Painel MS MALDI-TOF em amostras de melanoma

O mesmo MALDI painel -TOF MS também foi usado em um conjunto de 177 amostras de melanoma de ensaio clínico NCT00936221 que avaliou a eficácia de selumetinib em combinação com dacarbazina comparação com dacarbazina isoladamente em doentes de primeira linha com

BRAF

mutação cutâneo avançado positivo ou desconhecido melanoma primário [8]. 69/177 (39%) amostras foram

BRAF V600E

positiva utilizando MALDI-TOF. Esta comparação muito bem com os resultados de NCT00936221, que foi realizada utilizando uma combinação de testes baseados dois ramos diferentes e sequenciação de Sanger, que detectadas mutações BRAF V600E em 69/177 amostras. A grande maioria das amostras foram investigados usando os testes de armas. Duas amostras foram

BRAF

mutação positiva por MALDI-TOF e negativo em seqüenciamento Sanger. Os espectrógrafos MALDI-TOF indicaram que estas mutações estavam presentes abaixo da sensibilidade nominal de Sanger de sequenciação que pode ser tão alta como 20% do ADN mutante em fundo de tipo selvagem. Duas amostras foram negativas por MALDI-TOF, mas positivo por um teste baseado ARMS. O teste tinha uma sensibilidade BRAÇOS 2%, o que é melhor do que a sensibilidade 5% foi estabelecido para o painel de MALDI-TOF (dados não mostrados). Em geral 21/177 (12%) das amostras de melanoma falhou análise usando um teste de braços ou de Sanger de sequenciação, ao passo que o método MALDI-TOF foi bem sucedida em todos os casos.

ARN

mutações também foram detectados em amostras de 38/177 (22%) de melanoma usando o painel de MALDI-TOF. Como uma comparação directa com os dados gerados pelos braços e pelo sequenciamento coletivamente o MALDI-TOF do acordo global percentual foi de 97% (152/156).

Discussão

Neste estudo, nós investigamos a utilidade da plataforma Sequenom MassARRAY MALDI-TOF na detecção de mutações em NSCLC e melanoma, em comparação com a tecnologia de armas, que demonstrou uma sensibilidade superior do que a sequenciação directa em amostras FFPE. O método de MALDI-TOF teve uma maior taxa de sucesso análise em amostras com baixo rendimento de ADN, provavelmente devido ao tamanho do fragmento amplificado menor (~ 80 pb), bem abaixo do tamanho médio do fragmento de ADN obtidas a partir de amostras de FFPE (-200 pb). Estudos anteriores demonstraram a sensibilidade analítica da tecnologia de Espectrometria de Massa da Sequenom como 1-10% [21]. Estes dados mostram que a tecnologia MALDI-TOF da Sequenom é de sensibilidade e especificidade suficiente para ser usado para terapia direta para

KRAS

pacientes positivos mutação, em NSCLC.

A importância do teste de mutações no 3 códons (G12, G13 e Q61) em

KRAS

comumente mutado em NSCLC foi demonstrada pela detecção de 13% a mais do

KRAS

pacientes positivos nesta coorte clínica. Um ensaio clínico de fase III, SELECT-1, (NCT01933932) está em andamento para avaliar a eficácia e segurança de selumetinib em combinação com docetaxel em

KRAS

pacientes com NSCLC positivos mutação que recebem tratamento 2ª linha. Neste estudo, os pacientes estão sendo selecionados usando as cobas

KRAS

Teste de Mutação (CE /IVD), que é projetado para detectar 19 mutações nos códons 12, 13 e 61 [22].

Outro mutações no

HRAS

,

ARN

e

BRAF

também foram detectados. Uma vez que estas mutações têm sido associadas com a activação de MEK, pacientes que transportam estas mutações também podem ser candidatos para o tratamento com um inibidor da MEK, embora a significância destas mutações em NSCLC é desconhecido [23] – [25]. Para linhas de células de câncer de pulmão exemplo contendo

ARN

mutações foram mostrados para ser sensível ao selumetinib inibidor MEK [26].

Os dados gerados para

BRAF V600E

mutações em amostras de melanoma também mostrou concordância em 152/156 (97%) das amostras com os braços ou seqüenciamento Sanger, demonstrando a precisão do método MALDI-TOF MS em

BRAF V600E

mutações. amostras de melanoma cutâneo muitas vezes contêm altas concentrações de melanina que inibe a PCR. A análise bem-sucedida de amostras que falharam usando ARMS demonstrou a capacidade do método MALDI-TOF MS para produzir dados com sucesso em amostras de melanoma.

Um desafio futuro na clínica é a probabilidade de disponibilidade de tecidos reduzida devido ao aumento da demanda para o teste. reflexo testes sequencial de aberrações genéticas podem resultar na necessidade de procedimentos de biópsia mais invasivas que podem ser evitados, em alguns casos, por meio de testes para todos os marcadores informativos em paralelo quando o paciente em primeiro lugar apresenta-se com NSCLC.

O valor da Sequenom plataforma foi que ele usou menos amostra do que outros métodos; 2 vezes menos de ADN foi utilizado para genotipar 27 vezes mais loci (82 vs 3) em 14 genes, que foi utilizado para o ensaio de braços que se analisou apenas a um único gene. É concebível 2 × 5 uM secções eluída em 50 ul teria material suficiente para a caracterização molecular das amostras nesta coorte. Os dados do nosso estudo foi gerada em 1 dia útil, indicando a sua rastreabilidade na clínica em consideração a volta em torno requisitos.

Detectamos mutações concomitantes com

KRAS

em 10/52 (19%) dos casos. Duas amostras apresentaram

PIK3CA

mutações simultâneas com

KRAS

.

PIK3CA

mutações em combinação com

KRAS

foram mostrados para conferir resistência a inibidores de MEK

in-vivo

[27]. A capacidade de detectar mutações concomitantes poderia fornecer benefício clínico adicional e potencialmente oferecer uma visão sobre a combinação apropriada abordagens para a terapia. Os números de pacientes em NCT00890825 com mutações concomitantes eram muito pequenos para observar qualquer ligação com a resposta.

Nossa dados demonstram a utilidade potencial do painel de Sequenom MALDI-TOF em amostras de NSCLC clínicos.

A potencial factor limitativo para o uso de testes de painel, tais como Sequenom na definição de diagnóstico é o requisito das autoridades reguladoras para validação extensa detectáveis ​​de cada variante, que não é sempre para a frente, devido à disponibilidade de amostras para validação.

deve -se notar que o uso desta tecnologia para detectar mutações em genes supressores de tumor, tais como

TP53

e

CDNK2A

seria um uso pouco viável e eficiente do tecido devido ao número de bases que precisariam ser interrogado.

tecnologia

Next Generation Sequencing (NGS) também pode cobrir múltiplos genes. NGS é especialmente vantajoso quando o rastreio genes que têm padrões de mutação díspares tais como

TP53

, e pode detectar novas mutações, algo menos facilmente alcançado na plataforma MALDI-TOF. NGS painéis geralmente requerem uma entrada de ADN superior a este sistema para permitir a geração de bibliotecas de sequenciação utilizáveis, e sensibilidades pode ser limitado a cerca de 5%, dependendo dos requisitos de profundidade li e contexto de sequência. NGS também apresenta seus próprios desafios em volta em torno do tempo e os custos para a análise, curadoria e gestão de dados.

Em um cenário de diagnóstico, onde poucas mutações são de relevância conhecida a terapias específicas, como em NSCLC, Sequenom MALDI-TOF tem uma vantagem distinta sobre os métodos de sequenciação directa devido à sua utilidade comprovada em DNA FFPE derivada, volta rápida em torno do tempo, os requisitos de armazenamento de dados modestos e exigência mínima de análise do usuário.

em conclusão, a abordagem Sequenom MALDI-TOF à mutação profiling é um uso eficiente e informativo de amostras de doentes. Ela mostra a sensibilidade comparável e boa concordância com a bem estabelecida extremamente sensível

KRAS

teste braços quando utilizado em amostras de NSCLC, com a capacidade de identificar uma gama mais ampla de mutações, usando menos tecido. perfis de mutação concomitantes em amostras de NSCLC FFPE poderia informar a estratégia de tratamento que os médicos usam em uma base individual do paciente.

Informações de Apoio

Tabela S1.

Todas as mutações detectadas pelo painel MALDI-TOF personalizado, por exemplo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0100566.s001

(XLSX)