Sumário

A alteração de fenótipo de células de cancro para mesenquimais tem sido mostrado para potenciar a agressividade do tumor, aumentando a metástase de células de cancro. Relata-se o efeito de triclosan, um agente antibacteriano amplamente utilizado encontrada em muitos produtos diários, no reforço da transição epitelial-a-mesenquimal (EMT) em células de câncer de pulmão anoikis agressiva resistentes H460 humano. EMT tem sido conhecido para aumentar a capacidade das células para aumentar a migração, invasão e sobrevivência no sistema de circulação. Este estudo demonstra que o tratamento das células cancerosas com o triclosan nas concentrações fisiologicamente relacionados aumentou significativamente o número de colónias de células cancerosas avaliadas por ensaio de formação de tumores. Além disso, a morfologia mesenquimal-like e diminuição na adesão célula-a-célula foram observadas nas células tratadas com triclosan. Importante, análise de Western blot revelou que as células tratadas com triclosan exibiu diminuição da E-caderina, enquanto que os níveis de marcadores de EMT, nomeadamente N-caderina, vimentina, caracol e lesma foram encontrados para ser significativamente regulada para cima. Além disso, EMT induzida por tratamento triclosan foi acompanhada pela activação da quinase de adesão focal /ATP tirosina quinase dependente (FAK /Akt) e relacionadas com ras C3 substrato de toxina botulínica 1 (Rac1), o que aumentou a capacidade das células para migrar e invadem . Em conclusão, foi demonstrado pela primeira vez que o triclosan pode potenciar a sobrevivência em células cancerosas condição individual e motilidade por meio do processo de EMT. Como são necessários recursos mencionados para o sucesso na metástase, o presente estudo fornece a novela informações toxicológicas e incentiva a sensibilização para a utilização triclosan em pacientes com câncer

Citation:. Winitthana T, Lawanprasert S, Chanvorachote P (2014) Triclosan Potencializa epitelial-To-mesenquimais transição em anoikis-resistentes células do cancro do pulmão humano. PLoS ONE 9 (10): e110851. doi: 10.1371 /journal.pone.0110851

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de julho de 2014; Aceito: 24 de setembro de 2014; Publicação: 16 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Winitthana et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada pelo Fundo Tailândia Research (para PC) (https://www.trf.or.th), Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, da Universidade de Chulalongkorn ( RES560530132-HR), o 90º aniversário do Fundo Universidade Chulalongkorn (Ratchadapiseksomphot Endowment Fund), ea Universidade bolsa Chulalongkorn graduação para comemorar o aniversário 72 de Sua Majestade o Rei Bhumibol Adulyadej (https://www.grad.chula.ac.th/eng /bolsas). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O agente de largo espectro anti-bacteriano o triclosan bem conhecido (2,4,4 ‘-trichloro-2’-hidroxidifenílico éter; TCS) (Figura 1A) foi utilizado comercialmente numa variedade de produtos para inibir o crescimento de bactérias, fungos, e bolor [1], [2]. TCS tem sido utilizado ao abrigo do regulamento da Food and Drug Administration (em cosméticos, desodorantes, sabonetes, creme dental), bem como a Environmental Protection Agency (em materiais de preservação incorporados em plástico de uso doméstico e têxteis) [2], [3]. As concentrações utilizadas da TCS em diferentes produtos podem variar; Contudo, os seus níveis na maioria dos produtos para cuidados pessoais variam 0,1-2% [1], [3]. O facto de que os níveis significativos de TCS são detectáveis ​​no plasma de humano TCS-expostos a uma concentração variando entre 0,02 e 20 ug /ml (0,069 e 69 ^ M) leva à concepção possível que este agente pode, possivelmente, um impacto fisiologia humana [4 ].

(A) A estrutura química da TCS. (B) a agregação multicelular de anoikis resistentes H460 células. barra de escala é de 1.000 mm. (C-D) Após o tratamento com a TCS (0-10 uM), durante 24 h, a percentagem de viabilidade celular foi determinada pelo ensaio do MTT e a percentagem de células apoptóticas foi detectado por coloração com Hoechst33342, respectivamente. Os valores são médias de três amostras em triplicado ± SE independentes. *

P Art controle 0,05 versus não-tratada. (E) Depois do tratamento indicado, a morfologia nuclear das células foi detectada por ensaio /IP co-coloração Hoechst33342 e visualizados sob um microscópio de fluorescência. barra de escala é de 50 mm. (F) As células foram tratadas com a TCS (0-7,5 mM) durante 24, 48 ou 72 h. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT. Os dados representam as médias de três amostras em triplicado ± SE independentes. *

P

0,05 versus não tratados de controlo em cada tempo indicado. (L-H) As células foram tratadas com a TCS (0-7,5 M) durante 48 h. ciclo celular das células tratadas com TCS foi determinada por coloração com PI e citometria de fluxo. *

P

. 0,05 versus controlo não tratado

Concentrando-se em câncer, up-to-date informações salientou que TCS tem efeitos insignificantes sobre a carcinogênese e mutação genética direta [2], [5], [6]. No entanto, considerando que a TCS é uma substância que as pessoas podem ser expostas ao longo de um período na vida, é importante compreender os possíveis efeitos deste agente, não só na carcinogénese, mas também o possível impacto sobre os comportamentos de células de cancro. Estudos recentes indicaram que a transição de fenótipo celular epitelial para mesenquimal de chamada epitelial-mesenquimal-a transição (EMT) é um factor crítico no sentido de facilitar a metástase de muitos cancros [7] – [9]. EMT tem recebido considerável atenção em pesquisas relacionadas ao câncer e EMT tem sido reconhecida como uma marca do stemness cancro, bem como a agressividade [10]. EMT processo resultou na alteração de comportamentos da célula que, na maioria dos casos, aumenta a capacidade de metastizar, incluindo a migração potenciada das células a partir do seu tumor primário, e um aumento da resistência à apoptose [11] – [13].

maior parte das evidências sugerem que a subpopulação de células cancerosas que exibem propriedades resistentes anoikis é a maioria das células em metástases bem sucedida [14] – [18]. células resistentes anoikis também são conhecidas como células de tumor (CTCs) [19] circulante. Na prática clínica, CTC ter sido considerada como um biomarcador potencial que reflecte cancro agressividade de muitos tipos de cancro incluindo cancro da mama, da próstata, colo-rectal, da bexiga, gástrico, fígado e pulmão [20] – [24]. A presença e quantidade de CTC no sangue periférico são mostrados para correlacionar bem com prognóstico pobre em doentes com cancro [19], [20]. A população de CTCs apresentam fenótipos celulares heterogêneos, incluindo epitelial, mesenquimal, e esses fenótipos em um estado de transição a partir do epitélio para mesenquimais [20], [24] – [27]. Como o processo de EMT resultou nos fenótipos mesenquimais com potências aumento metástases incluindo resistência anoikis e capacidade invasiva de células [14], [20], [23], factores ou estímulos que facilitam esta EMT no CTC pode alterar o fenótipo de população CTC e afectar o potencial de metástases das células. Como CTC são encontrados na circulação sistémica [19], [24], [28], as células são susceptíveis de ser exposto a vários produtos químicos existentes no sangue. Com base em tal preocupação, vários compostos foram investigados e relatado como tendo uma propriedade de indução de EMT, tais como TGF-β [29], [30], o factor de crescimento epidérmico [31], [32], o celecoxib [33] gefitinib [ ,,,0],34] e cromo hexavalente [35].

Embora a presença de determinadas concentrações de TCS tem sido relatada em circulações humanos, a informação sobre os efeitos de um tal agente no processo de EMT de CTCs ainda é em grande parte desconhecido. O presente estudo tem como objetivo investigar os efeitos, bem como os possíveis efeitos deste composto sobre a população agressivo de células de câncer de pulmão. Melhores entendimentos obtidos neste estudo podem contribuir para a utilização mais segura da TCS e proporcionar nova avaliação se aproxima de toxicidade relacionada ao câncer.

Materiais e Métodos

1. Células e reagentes

NCI-H460 foi obtida a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). As células cancerígenas foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 UI /ml de penicilina, e 100 ug /mL de estreptomicina (Life Technologies, MD, USA) em 37 ° C com 5% de CO

2 incubadora humidificada. O triclosan foi obtido a partir de Sigma (St. Louis, MO, EUA). TCS foi diluído com meio estéril para atingir as concentrações de trabalho com 0,1% de DMSO na solução final. No que se refere as fontes de reagentes, Hoechst33342, iodeto de propídio (PI), faloidina tetrametilrodamina B isotiocianato, albumina de soro bovino (BSA) e dimetilsulf óxido (DMSO) foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO, EUA). 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) foram adquiridos de Gibco (Life Technologies, MD, USA). Matrigel foi obtido a partir de BD Biosciences, Inc. (Woburn, MA, EUA). kit de ensaio BCA e Supersignal quimioluminescente Pico oeste foi obtido a partir de Thermo Scientific, Inc. (Rockford, IL, EUA). Os anticorpos de coelho monoclonais para E-caderina, N-caderina, vimentina, lesma, caracol, Akt, fosforilado Akt (S473), quinase de adesão focal (FAK), fosforilado a FAK (Y397), β-actina, conjugado com peroxidase anti-IgG de coelho e peroxidase de IgG anti-ratinho conjugado foram obtidos a partir de Cell Signaling (Denvers, MA, EUA). Os anticorpos monoclonais de ratinho para o Active Rac1-GTP activo e Rho-GTP foram obtidos a partir de NewEast Biosciences (Malvern, PA, EUA). Immobilon substrato de HRP quimioluminescente ocidental foi obtida da Millipore, Corp (Billerica, MA, EUA) e Thermo Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL, EUA).

2. células resistentes anoikis

cultura de células resistentes

anoikis foi realizada de acordo com o método de Sakuma et al. [36] e Khongmanee et ai. [37] com pequenas modificações. Em resumo, as células associadas foram tripsinizadas H460 quando as células atingiram 80-90% de confluência com 0,05% de tripsina /0,02% de EDTA. Em seguida, as células foram cultivadas em anexo ultrabaixo placa de 6 poços (Corning Costar, MA, EUA) em meio RPMI-1640, enquanto outras foram mantidas condições que as descritas para a cultura de fixação. As células foram cultivadas a uma densidade de 2 × 10

5 células /ml durante 48 h. As células em suspensão foram então recolhidas e preparadas para uma suspensão de células individuais por tratamento 1 mM de EDTA. Em seguida, as células foram lavadas com meio RPMI-1640 completo. A viabilidade celular foi medida utilizando um contador de células automatizado. As células viáveis ​​foram utilizados para novas experiências.

3. ensaio de viabilidade celular e a proliferação de células de ensaio

viabilidade das células foi determinada por ensaio MTT. As células foram semeadas a uma densidade de 1 × 10

4 células /poço em placas de 96 poços durante a noite. Depois disso, eles foram tratados com várias concentrações de TCS durante 24 h. Seguindo o tratamento, o meio foi então substituído com uma solução de MTT (5,0 mg /ml em PBS) e incubada a 37 ° C durante 4 h. Em seguida, o meio foi substituído por 100 ul de DMSO para solubilizar o produto formazan e a intensidade do produto de formazan foi medida a 570 nm utilizando um leitor de microplacas (Anthros, Durham, NC, EUA). A viabilidade celular foi expressa como a percentagem calculada a partir da densidade óptica das células tratadas em relação ao das células controladas. Enquanto isso, foi determinada utilizando o ensaio MTT também efeito proliferativo celular. As células foram semeadas a uma densidade de 2 × 10

3 células /cavidade em placas de 96 poços e incubadas durante a noite. Depois disso, as células foram tratadas com várias concentrações de TCS durante 0, 24, 48, e 72 h. A proliferação celular foi medida por ensaio MTT como descrito na avaliação de viabilidade celular.

4. ensaio de coloração nuclear

apoptose ou morte celular por necrose foram determinadas por Hoechst33342 e co-coloração PI. As células foram semeadas a uma densidade de 1 × 10

4 células /poço em placas de 96 poços e incubadas durante a noite. As células foram então tratadas com TCS durante 24 h. Após os tratamentos específicos, as células foram incubadas com 10 ug /ml de Hoechst33342 e 5 ug /ml de PI durante 30 min a 37 ° C. As células em apoptose ter condensado cromatina e /ou núcleos fragmentados e células necróticas PI-positivos foram visualizados e marcou sob um microscópio de fluorescência (Olympus IX51 com DP70, Olypus America Inc., vale Center, PA, EUA).

5. Análise do ciclo celular

Após o tratamento das células com TCS durante 48 h, as células foram tripsinizadas e fixadas com 70% de etanol absoluto a -20 ° C durante a noite. as células foram então lavadas com PBS frio e incubaram-se em solução PI contendo 0,1% de Triton-X, 1 ug /ml de RNase e 1 mg /ml de iodeto de propídio a 37 ° C durante 30 min. ADN em células inteiras foram coradas com PI e perfil do ciclo celular foi analisada utilizando citometria de fluxo (FACSort, Becton Dickinson, Rutherford, NJ, EUA).

6. Colónia ensaio de formação de

Após o tratamento com a TCS, o crescimento independente da ancoragem foi examinada por meio de ensaio de formação de colónias de acordo com o método de Koleske et ai. [38] com pequenas modificações. Resumidamente, as células foram tratadas com a TCS a concentrações não-tóxicas, durante 24 h e, em seguida, tratada com EDTA 1 mM, para preparar a suspensão de células individuais. As células foram suspensas em RPMI-1640 contendo 10% de FBS e 0,33% de agarose, em seguida, 250 ul contendo 1 × 10

3 células foram incorporados como uma segunda camada de uma placa de 24 poços sobre uma camada 500 de base ul contendo 10% FBS e 0,5% de agarose. As células foram alimentadas a cada 3 dias por adição de 250 ul de meio completo. Após 7 e 10 dias, as colónias resultantes foram fotografadas em × 4 ampliação. número de colónias e tamanho da colônia foram determinados com 10

º dia de cultura.

7. Filopodia caracterização

filopodia foi caracterizado por ensaio de coloração com faloidina com rodamina, como descrito em Kowitdamrong et ai. [39]. As células foram tratadas com a TCS a concentrações não-tóxicas durante 24 h em condição de separação e semeadas a uma densidade de 2 × 10

3 células /poço em placas de 96 poços, durante 4 h. As células foram então lavadas com PBS, fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS durante 10 min a 37 ° C, permeabilizadas com 0,1% de Triton-X100 em PBS durante 4 minutos, e bloqueadas com BSA a 0,2% durante 30 min. Em seguida, as células foram incubadas com 1:100 faloidina com rodamina em PBS durante 15 min e lavadas com PBS 3 vezes. Filopódios foi então fotografada por um microscópio de fluorescência (Olympus IX51 com DP70).

8. Ensaio de Migração

Migração foi determinada por ensaio de câmara de Boyden conforme anteriormente tal como descrito no Kowitdamrong et ai. [39]. As células foram pré-tratadas com TCS em concentrações não tóxicas por 24 h em condição individual. Em seguida, as células foram semeadas a uma densidade de 5 x 10

4 células /poço numa placa de 24-Transwell superior do filtro Transwell (8-de poro) no meio contendo 0,1% de soro e 500 ul de meio completo foi adicionada à câmara inferior. Após 24 h, as células que não migraram na membrana upperside foram removidas por raspagem algodão-cotonete. As células que migraram para o lado inferior da membrana foram coradas com 10 ug /ml Hoechst33342 durante 30 min. As células foram então visualizadas e marcou sob um microscópio de fluorescência (Olympus IX51 com DP70).

9. Invasão ensaio

O ensaio de invasão foi realizada utilizando câmaras Transwell-24 como previamente descrito em Kowitdamrong et ai. [39]. Transwells foram revestidas com 50 ul de 0,5% de matrigel sobre a superfície superior da câmara e incubou-se durante a noite a 37 ° C numa incubadora humidif içada. Após o tratamento com a TCS a concentrações não-tóxicas durante 24 h em condição individual, as células foram semeadas a uma densidade de 5 x 10

4 células /poço para a câmara superior em meio contendo 0,1% de soro e 500 ul de meio completo foi adicionada à câmara inferior. Após 24 h, as células não invadidos no lado de cima da membrana foram removidas por raspagem algodão-cotonete. células invadidas no lado basolateral da membrana foram fixadas com metanol absoluto frio durante 10 minutos e coradas com 10 ug /mL Hoechst33342 durante 30 min. As células foram então visualizadas e marcou sob um microscópio de fluorescência (Olympus IX51 com DP70).

10. A análise Western blot

Depois de tratamentos específicos, as células foram incubadas num tampão de lise contendo Tris-HCl 20 (pH 7,5), 1,5% de Triton X-100, cloreto de sódio 150 mM, 10% de glicerol, 1 mM de sódio ortovanadato, 50 mM de fluoreto de sódio, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, e uma mistura de inibidor de protease comercial (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, EUA) durante 2 horas em gelo. Os lisados ​​celulares foram recolhidos e o teor de proteína foi determinada usando o método Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Quantidades iguais de proteína de cada amostra foram desnaturadas por aquecimento a 95 ° C durante 5 min com tampão de carga e, subsequentemente, carregou-se uma electroforese em gel de SDS-poliacrilamida a 7,5% para a detecção de marcadores de EMT e expressão de E-caderina ou 10% SDS-poliacrilamida electroforese em gel para a detecção da expressão da proteína-migratório relacionados. Após separação, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose de 0,45 um. As membranas transferidas foram bloqueadas em leite em pó a 5% não gordo em TBST (25 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 125 mM, 0,05% de Tween 20) durante 1 h, e depois incubadas com um anticorpo primário específico (1: 1000 de diluição) durante a noite a 4 ° C. As membranas foram lavadas três vezes com TBST, durante 5 minutos e incubadas com anticorpos de rábano acoplada com peroxidase específico do isotipo secundárias (1:2,000 diluição) durante 2 h à temperatura ambiente. As membranas foram lavadas três vezes com TBST, durante 5 min e os complexos imunitários foram detectados por reforço com um substrato quimioluminescente e quantificados usando software Analyst /PC densitometria (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA).

11. A análise estatística

Os dados foram obtidos a partir de três experimentos independentes e apresentados como médias ± erro padrão (SE). As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se ANOVA e teste post hoc (teste de Tukey) a um nível de significância de

P

-Valores 0,05. SPSS 17.0 foi utilizado para todas as análises estatísticas.

Resultados

1. Efeitos de TCS em anoikis células H460 resistentes

células cancerosas resistentes a anoikis foram usadas como um modelo para estudar CTC [36], [37], [40]. células de cancro de pulmão resistente a anoikis foram criadas tal como descrito em Materiais e Métodos. Verificou-se que as células isoladas H460 formado espontaneamente agregados multicelulares Depois da cultura durante 48 h (Figura 1B). Para elucidar o possível efeito de TCS em células de cancro de pulmão CTC, o efeito citotóxico do composto sobre as células foi caracterizado pela primeira vez. TCS nas concentrações que variam de 0,069 a 69 pM foi encontrado no plasma de sujeitos expostos a TCS-[4]. Portanto, os anoikis células resistentes foram incubadas com TCS nas concentrações de 0-10 uM durante 24 horas e a viabilidade celular foi avaliada por um ensaio MTT. A Figura 1C mostra que o tratamento TCS diminuiu significativamente a sobrevivência celular, na dose de 10 uM, com cerca de 80% de células viáveis ​​restantes, enquanto que o tratamento das células com a TCS a 0-7,5? M causou nenhum efeito tóxico significativo. ensaio de coloração /PI Hoechst33342 confirmou que a apoptose e necrose não foram detectáveis ​​nas células tratadas com a TCS a 0-7,5? M. As células apoptóticas com núcleos fragmentados ou condensados ​​foram detectadas apenas nas células tratadas com 10 pM TCS (Figuras 1D e E). Por isso, foram utilizadas as concentrações de TCS em 0-7,5 M para experiências seguintes.

Tendo mostrado o efeito tóxico da TCS em anoikis células resistentes, nós próxima investigaram os efeitos da TCS na proliferação celular e ciclo celular. As células foram tratadas com concentrações não tóxicas de TCS durante 0-72 h e proliferação de células foi determinada como descrito em Materiais e Métodos. resposta de proliferação de células resistentes a anoikis TCS foi mostrado na Figura 1F. células tratadas com TCS mostrou nenhuma diferença significativa em termos de proliferação celular em comparação com as células de controlo não-tratado. Estes resultados foram confirmados por análise de ciclo celular utilizando PI e citometria de fluxo. Os resultados indicaram que o tratamento TCS não causou efeitos significativos sobre o ciclo celular (Figuras 1G e 1H). Juntos, os resultados sugerem que a TCS não possuía efeito proliferativo em células H460 resistentes anoikis em condições normais de cultura.

2. TCS a promoção do crescimento celular independente de ancoragem em forma

Porque o crescimento independente de ancoragem das células de cancro foi mostrada para aumentar a metástase, nós próxima investigado o efeito de SCT no crescimento de células cancerígenas em tal condição. Ao fazer isso, as células resistentes anoikis H460 foram tratados com TCS durante 24 h antes de serem submetidas a ensaio de formação de colónia. As células foram então semeadas em agarose de camada para evitar a interacção célula-célula e a ligação. número de colónias e o tamanho das colónias foram obtidos por fotografia e depois contando as células foram cultivadas durante 7 e 10 dias. A formação de colónias foi mostrado na Figura 2A. número de colónias e tamanho das colónias de cada tratamento foram calculados como uma percentagem do grupo de controlo e mostrada na Figura 2B e C, respectivamente. Os resultados indicaram que a TCS nas concentrações de 5 e 7,5 uM aumentaram significativamente a formação de colónias de células H460 resistentes anoikis. No entanto, em ambas as concentrações TCS reduziu significativamente o tamanho das colónias, em comparação com a do grupo de controlo não-tratado. Estas observações indicaram que a TCS promovendo a sobrevivência independente de ancoragem das células, mas diminuiu a taxa de crescimento das células em condição individual. Os nossos resultados consiste com as descobertas anteriores de que o aumento da sobrevivência independente de ancoragem com capacidade proliferativa baixo foi observado nas células de cancro submetidos a EMT [11], [12], [41], [42].

(a) células foram pré-tratadas com a TCS (0-7,5 M) durante 24 h e submetida a ensaio de formação de colónia em agar mole, como descrito em “Materiais e Métodos”. campos representativos de três experiências independentes foram fotografadas após as células foram cultivadas durante 7 e 10 dias. barra de escala é de 1.000 mm. (B-C) Número Colony e colônia de tamanho foram determinados por analisador de imagem na 10

º dia de cultura. Os valores são médias de três amostras em triplicado ± SE independentes. *

P

. 0,05 versus não-tratados de controle

3. TCS inibir a interacção célula-célula

perda de adesão célula-célula foi encontrado nas células durante o processo de EMT como um resultado da caderina comutação [7], [8]. Para examinar o efeito da TCS na adesão célula-célula de anoikis resistentes H460 células, foi semeado as células em 24 poços de baixo anexar placa a uma densidade de 1,5 x 10

5 células /poço e tratou-os com concentrações não tóxicas de TCS. A interacção célula-célula foi observado na formação de agregação de células e fotografadas utilizando um microscópio de contraste de fase. tamanho e número de agregação foi determinada e calculada em relação ao controlo não tratado. A Figura 3A mostra que o tratamento TCS alterou significativamente o comportamento de agregação das células a suspensão de células individuais. A adição de TCS resultou na redução significativa do número e tamanho dos agregados multicelulares de um modo dependente da dose (Figura 3B e C). Estes resultados sugerem que a TCS promoveu perda de adesão célula-célula de células H460 resistentes anoikis que é uma característica dominante das células que sofrem EMT.

(A) células foram tratadas com TCS (0-7,5 M) para 12 , 24 ou 48 h em destacada interação condição e célula-célula foi fotografado. barra de escala é de 1.000 mm. (B-C) Após o tratamento com TCS (0-7,5 M) durante 24 h em condição individual, tamanho do agregado e número total foram determinados por analisador de imagem. Os dados significa presentes das três amostras em triplicado independentes ± SE. *

P

. 0,05 versus não-tratados de controle

4. TCS aumento da expressão de marcadores EMT

A seguir, investigou o efeito do tratamento TCS em marcadores EMT incluindo N-caderina, vimentina, caracol e lesma. As células H460 resistentes anoikis foram tratados com concentrações não tóxicas de TCS durante 24 h e EMT marcadores foram avaliadas por transferência de Western. As Figuras 4A e B mostram que o nível de expressão de E-caderina foi significativamente diminuída em resposta ao tratamento da TCS de um modo dependente da concentração. Além disso, a TCS melhorado significativamente o aumento de N-caderina, vimentina, slug e caracol. A expressão de Snail foi significativamente aumentada por tratamento TCS em 5 e 7,5 uM de um modo dependente da dose, enquanto que a expressão de lesma só foi significativamente induzida pelo tratamento com a TCS a 7,5 uM. Estes resultados sugerem que a TCS aumento EMT fenótipos nestas células.

H460 células resistentes (A) foram tratados com anoikis TCS (0-7,5 M) durante 24 h em condição individual. O nível de N-caderina, E-caderina, vimentina, lesma e caracol foram determinados por Western blotting. As manchas foram sondado com β-actina para confirmar o carregamento igual. (B) Os sinais de imunotransferência foram quantificadas por densitometria e as médias dos dados de experiências independentes foram normalizados para os resultados. Os dados significa presentes das três amostras em triplicado independentes ± SE. *

P

. 0,05 versus não-tratados de controle

5. TCS-mediada EMT células reforço migração e invasão

Uma característica importante de células cancerígenas agressivas é a sua alta capacidade de migrar e invadir [43], [44]. EMT é reconhecido como um fator facilitador importante motilidade celular [12], [45]. As células foram tratadas com a TCS a concentrações não-tóxicas, durante 24 h e os comportamentos migração e invasão das células foram determinadas como descrito em Materiais e Métodos. Figura 5A indica que células tratadas com TCS apresentaram maior polaridade e filopódios. Filopodia das células tratadas com TCS foi corada com faloidina com rodamina, como mostrado na Figura 5B. TCS-células tratadas exibiram filopodia saliências que se acumulam na borda de células de uma forma dependente da dose. Além disso, a migração e a invasão de ensaio revelaram que a TCS aumento da migração celular e invasão (Figuras 5C e D). Os resultados acima sugerem que a indução EMT após tratamento TCS promoveu a formação filopódios e potenciado habilidades migratórias e invasivos de células H460 resistentes anoikis.

As células (A) foram tratados com TCS em 0-7,5 mM durante 24 horas e depois anexado em placas de cultura convencionais para 4 h. A morfologia celular foi detectado por microscopia de contraste de fase. barra de escala é de 25 mm. (B) Depois o tratamento indicado, filopodia e as células viáveis ​​foram detectados por faloidina com rodamina ou coloração Hoechst33342, respectivamente. As células foram visualizadas ao microscópio de fluorescência. filopodia saliências de cada tratamento foram indicados por setas. barra de escala é de 5 mm. (C) As células foram pré-tratadas com a TCS (0-7,5 M) durante 24 h. ensaio Transwell foi utilizado para investigar a migração celular. células migratórias no lado basolateral da membrana foram coradas com Hoechst33342 e visualizados sob microscopia de fluorescência. barra de escala é de 50 mm. Os números médios das células migratórias em cada campo no lado basolateral da membrana foram representados graficamente em relação ao grupo de controlo. Os valores são médias de três amostras em triplicado ± SE independentes. *

P Art controle 0,05 versus não-tratada. (D) Depois do tratamento com a TCS (0-7,5 M) durante 24 h, a invasão de células foi avaliada utilizando Transwell revestida com Matrigel, tal como descrito em “Materiais e Métodos”. células invadidas no lado basolateral da membrana foram coradas com Hoechst33342 e visualizados sob microscopia de fluorescência. barra de escala é de 50 mm. O número médio de células invadidas em cada campo através da membrana foram plotados em relação ao grupo controle. Os valores são médias de três amostras em triplicado ± SE independentes. *

P

. 0,05 contra controlo não-tratado

Além disso, as proteínas efectoras a jusante que são responsáveis ​​pela motilidade celular foram determinados utilizando Western blotting. As células foram tratadas com as concentrações indicadas de TCS durante 24 h e submetida a análise de Western blot. Os níveis de proteínas migratórias-relacionados de expressão incluindo activado FAK (FAK fosforilada, Tyr 397), FAK, activado Akt (fosforilada Akt, Ser 473), Akt, Rac1 activado (Rac1-GTP), e activado RhoA (RhoA-GTP) eram investigada. As Figuras 6A e B mostram que o tratamento TCS aumentou significativamente o nível de FAK fosforilada, Akt activado, e Rac1-GTP activo. No entanto, a TCS possuía nenhum efeito significativo no nível de RhoA activado. Estes resultados sugerem que induzido TCS EMT promoveu a motilidade de células resistentes anoikis H460 através da activação da FAK /Akt via de sinalização, bem como a activação Rac1.

H460 células resistentes (A) anoikis foram tratados com a TCS a 0 -7,5 uM durante 24 h em condição individual e, em seguida, ligado em placas de cultura convencionais durante 4 h. O nível de pFAK (Tyr 397), FAK, pAkt (Ser 473), Akt, Rac1 activado (Rac1-GTP) e RhoA activada (RhoA-GTP) foram determinados por Western blotting. As manchas foram sondado com β-actina para confirmar o carregamento igual. (B) Os sinais de imunotransferência foram quantificadas por densitometria e as médias dos dados de experiências independentes foram normalizados para os resultados. Os valores são médias das três amostras independentes em triplicado ± SE. *

P

. 0,05 versus controlo não tratado

Discussão

O cancro do pulmão tem atraído a maioria das atenções no campo de pesquisa do câncer uma vez que este tipo de cancros é considerado como uma das principais causas de cancro relacionados com a mortalidade [46]. Na verdade, a elevada taxa de metástases do cancro, de tal faz com que seja o mais e, na maioria dos casos de risco de vida metástase é detectada no momento do diagnóstico inicial [47]. Uma vez que a capacidade das células cancerosas a metástase pode ser aumentada pelo processo de EMT [9], [12], [48], a presente relatando o efeito regulador positivo da SCT no EMT de células cancerosas humanas estudo evidencia a possível toxicidade romance causada por este composto.

TCS tem sido amplamente utilizado há mais de 30 anos em produtos de cuidados de saúde, bem como em dispositivos médicos. TCS é rápida e completamente absorvido após a administração oral. TCS foi identificado na urina, plasma e leite da mama de seres humanos com uma ampla gama de teores dependendo da dose diária do indivíduo, a sua concentração nos produtos, bem como da via e frequência de administração [2], [3]. As concentrações altas e baixas de TCS em plasma humano foram relatados em 0.02 e 20 ug /ml (0,069 e 69 uM, respectivamente) [4]. Estudos anteriores relataram os possíveis efeitos da TCS na indução de formações de adenoma e carcinoma hepatocelular no modelo de roedor [2]. Recentemente, Ma et al. (2013) constataram que TCS reduzida metilação do DNA global (GDM) em células HepG2 e propôs a redução como o possível mecanismo de TCS indutor de tumores em roedores [49]. Uma vez que a hipometilação de DNA global está associado com a expressão do gene aberrante, perda de impressão, a instabilidade dos cromossomas e anomalias, foi demonstrado desempenhar um papel fundamental no controlo do cancro EMT e metástase [50].