Abstract

A maioria do câncer de próstata (PCA) doente a receber terapia de ablação do andrógeno, eventualmente, desenvolver câncer de próstata resistente à castração (CRPC). Nós relatado anteriormente que o tratamento do andrógeno suprime Skp2 e c-Myc através do receptor de andrógeno (AR) e interrupção do ciclo celular G1 induzida em células 104-R2 andrógeno-independente LNCaP, um modelo de linha de células estágio CRPC tarde. No entanto, o mecanismo de regulação de Skp2 androgénica em células CRPC não foi totalmente compreendido. Neste estudo, foi investigada a regulação androgênica do Skp2 em dois modelos de linhas celulares CRPC AR-positivas, o LNCaP 104-R1 e PC-3

Células AR. O primeiro é um células LNCaP andrógeno-independente da fase inicial, enquanto a posterior é células PC-3 re-expressar qualquer tipo AR selvagem ou AR LNCaP mutante. Proliferação de LNCaP 104-R 1 e PC-3

sup células RA não é dependente mas é suprimida por androgénio. Observou-se neste estudo que o tratamento de androgénio reduzida a expressão da proteína de Cdk2, CDK7, ciclina A, ciclina H, Skp2, c-Myc, e E2F-1; diminuiu a fosforilação de Thr14, Tyr15, e Thr160 em Cdk2; diminuição da actividade de Cdk2; nível de proteína induzida de p27

KIP1; e causou a parada do ciclo celular G1 em LNCaP 104-R1 células e PC-3

células AR. Superexpressão da proteína Skp2 em PC-3

células AR LNCaP 104-R1 ou parcialmente bloqueada acúmulo de p27

KIP1 e aumento da atividade Cdk2 em tratamento de andrógeno, que bloqueou parcialmente os efeitos de supressão androgênica sobre a proliferação e ciclo celular. Análise dos dados de matriz de gene sobre-linha de 214 amostras normais e PCA indicaram que a expressão do gene de Skp2, Cdk2 e ciclina A correlaciona-se positivamente uma à outra, enquanto CDK7 correlaciona negativamente a esses genes. Estas observações sugeriram que o andrógeno suprime a proliferação de células CRPC parcialmente através da inibição da ciclina A, Cdk2, e Skp2

citação:. Kokontis JM, Lin HP, Jiang SS, Lin CY, J Fukuchi, Hiipakka RA, et ai. (2014) andrógeno Suprime a Proliferação de andrógeno receptor-positivo resistente à castração células cancerosas da próstata através da inibição da Cdk2, CyclinA e Skp2. PLoS ONE 9 (10): e109170. doi: 10.1371 /journal.pone.0109170

editor: Allen Gao, UC Davis Comprehensive Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de julho de 2014; Aceito: 28 de agosto de 2014; Publicação: 01 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kokontis et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por CA58073 e AT00850 do Instituto Nacional de Saúde em U.S.A. para SL; CS-103-PP-14 (National Health Research Institutes), CA-103-SP-01 (Ministério da Saúde e Bem-estar), a maioria 103-2325-B-400-001 (Ministério da Ciência e Tecnologia) em Taiwan por CPC e Programa de Instalação Nacional de Núcleo de Biotecnologia de Taiwan (NSC 102-2319-B-400-001). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. O autor correspondente Dr. Chih-Pin Chuu é membro do Conselho Editorial PLOS ONE, No entanto, os autores confirmam que isso não altera a adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Em 1941, Charles Huggins relataram que a terapia de ablação de androgénios causou a regressão do ensino primário e cancro de próstata dependente de androgénios metastático (PCA) [1]. terapia de ablação do andrógeno, usando agonistas luteinizante hormona libertadora de hormona (LH-RH) ou orquiectomia bilateral, tornou-se um tratamento primário para câncer de próstata metastático [2]. A maioria dos pacientes apresentam um rápido declínio inicial na PSA seguido por um declínio mais lento para o nadir [2]. Contudo, 80-90% dos doentes desenvolvem eventualmente cancro da próstata resistente à castração (CRPC) 12-33 meses após a terapia de ablação de androgénio com uma sobrevivência média geral de 12-24 meses [3]. receptor de androgénio (AR) desempenha um papel importante no desenvolvimento, progressão e metástase de câncer de próstata [4]. Aumento de ARNm de AR e a proteína é observada em tumores CRPC em comparação com os tumores da próstata primários [5], [6].

LNCaP é uma linha celular vulgarmente utilizada estabelecida a partir de um nó de linfa lesão metastática de adenocarcinoma prostático humano. células LNCaP expressam o receptor de androgénio (AR) e antigénio específico da próstata (PSA) [7], [8]. Anteriormente, foi desenvolvido um modelo de progressão CaP usando células LNCaP. LNCaP 104-S de células dependentes de androgénio foram cultivadas em condições empobrecido-andrógenos para imitar os pacientes que recebem terapia de ablação de androgénio [9] – [11]. Uma pequena população de células resistente à castração chamada LNCaP 104-R1 surgiu depois de 10 meses [9] – [11]. Após a cultura adicional 8 meses em meio depletado de androgénio, as células LNCaP 104-R1 deu origem a células LNCaP 104-R2, que proliferavam muito mais rapidamente do que 104-R1 células [10]. A proliferação de células LNCaP 104-R2-R1 e 104 é independente de androgénios, mas é suprimida por concentrações fisiológicas de androgénio [9], [10], [12], [13]. LNCaP-104 104 células R2-R1 e imitar precoces e tardios células CRPC, respectivamente [14]. Após o tratamento de andrógeno, as maiorias de LNCaP 104-R1 e 104-R2 células foram submetidos a pilha pilhas G1 prender e morreu eventualmente, com apenas uma pequena população de células sobreviveram e voltou a crescer, com o nome R1Ad [10] e R2Ad [15], respectivamente. No entanto, a proliferação de células R1Ad é dependente de androgénio e podem ser controlados por terapia de ablação de androgénios [12], enquanto que a proliferação de células R2Ad androgénio é-insensíveis e não responde a terapia adicional hormona [15]. Portanto, pacientes com tumores CRPC fase inicial, pode beneficiar de um tratamento de andrógeno. Nós anteriormente relatado que o tratamento de androgénio suprime a fase-S de proteína associada-quinase 2 (Skp2) e c-Myc através de AR nas células LNCaP 104-R2, induzindo assim a paragem do ciclo celular em G1 e a inibição do crescimento [15]. actividade oncogénica e regulação androgênica do c-Myc têm sido estudadas intensamente. No entanto, a regulação androgênica do Skp2 em células CRPC é menos compreendida.

Skp2, uma proteína F-box, e seu co-fator Cks1 são as subunidades de metas de substrato da (proteína Skp1 /Cul1 /F-box) SCF complexo de ubiquitina ligase. SCF é um complexo de ubiquitina ligase E3, que regula a entrada na fase S de células através da indução da degradação de p21 a inibidores de cinase dependente de ciclina

Cip1 e p27

KIP1 [16], [17]. metas Skp2 p27

KIP1 por fosforilação p27

KIP1 a T187 para ubiquitinação e degradação [18] – [20]. Skp2 forma um complexo estável com a ciclina A dependente de ciclina-cinase 2 (Cdk2) [20]. Skp2 é fosforilada por Cdk2 na Ser64 [20] e por Akt na Ser72 [21]. A fosforilação de Ser64 e Ser72 em Skp2 contribui para a estabilização de Skp2, impedindo a sua associação com a APC /CCdh1 [17], [18], [20], [21]. Ambos luminal e células epiteliais basais normais da próstata em exposição níveis muito baixos Skp2, no entanto, os níveis de Skp2 aumentar drasticamente em ambos os neoplasia intra-epitelial prostática (PIN) e CaP [22], [23]. Aumento da regulação do Skp2 correlaciona para abaixar p27

expressão Kip, maior pontuação de Gleason e estágio patológico mais avançado do CaP [22], [24]. Aumento da regulação do Skp2 em CaP também está associada de forma independente com um maior risco de CaP recorrência após a cirurgia [22], [24]. Skp2 sobreexpressão em células CaP estimula a proliferação de células APC e aumenta a tumorigénese no modelo de tumor de xenoenxerto [25].

Cdk2 é um membro da família da cinase dependente de ciclina de proteína-quinases Ser /Thr [26]. Complexo de E-Cdk2 ciclina é necessário para a transição de células da fase G1 para a fase S, enquanto que a ligação entre Cdk2 e ciclina A é obrigada a progredir através da fase S [26]. Activação de complexos de Cdk2 requer desfosforilação de Thr14 e Tyr15 em Cdk2 por fosfatase cdc25 e fosforilação de Thr160 na Cdk2 [26], [27], que é mediada por CAK, um complexo de cdk7 e ciclina H [28]. A ciclina A é um membro da família da ciclina, um grupo de proteínas que funcionam na regulação da progressão através do ciclo celular. A transcrição de ciclina A é fortemente regulada e sincronizado com a progressão do ciclo celular por o factor de transcrição E2F num loop de feedback negativo [29].

células LNCaP expressar um AR mutante (T877A) que exibe especificidade de ligação ao ligando relaxado [30 ], [31 PC-3 células], que assim gerado AR-positivas por superexpressão qualquer tipo selvagem AR (PC-3

AR) ou LNCaP AR mutante (PC-3

LNCaP-AR) na AR-negativo células como outras garantias celulares CRPC PC-3. Utilizou-se LNCaP células 104-R1, um modelo imita fase precoce CRPC, assim como PC-3

AR e PC-3

células LNCaP-AR para analisar a regulação androgénica de Skp2 e quinases dependentes de ciclina relacionados ( CDKs), bem como a proliferação celular nestas células CRPC.

Materiais e Métodos

Materiais

androgénio sintético R1881 e antiandrogénio Casodex (bicalutamida) foram obtidos de Perkin Elmer (Boston , MA, EUA) e a AstraZeneca (Wilmington, DE, EUA), respectivamente. [A-

32P] dCTP (3000 Ci /mmol) e [g-

32P] ATP (5000 Ci /mmol) era da Amersham (Arlington Heights, IL, E.U.A.). Peptídeos foram sintetizados pela Universidade de Chicago Cancer Research Center facilidade de síntese de oligopeptídeos.

cultura celular

células LNCaP 104-R1 e PC-3 sublinhas foram presentes de Dr. Shutsung Liao (The University of Chicago, IL, EUA). células LNCaP 104-R1 foram derivados a partir de células LNCaP 104-S parentais dependentes de androgénio, que foram gerados a partir do clone de LNCaP FGC (ATCC CRL-1740). As células LNCaP 104-R1 e PC-3 sublinhas foram descritos em publicações anteriores [10] – [13], [15], [32] – [34]. LNCaP 104-R1, PC-3, PC-3

AR, e PC-3

LNCaPAR células foram manter em DMEM com FBS 10% de carvão-despojado (CS-FBS).

Western borrando análise

células LNCaP 104-R1 ou PC-3 sublinhas foram lavadas com PBS e lisadas em 2 × tampão Laemmli sem corante azul de bromofenol. A concentração de proteína dos lisados ​​celulares foi determinada com o reagente de Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, E.U.A.). Anticorpo para Skp2 e p21

cip1 /WAF1 eram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, E.U.A.). Anticorpos para a ciclina E, Cdk2 e fosfo-Cdk2 Thr160 eram de sinalização celular (Danvers, MA, EUA). A ciclina A e anticorpos de E2F-1 eram da Millipore (Billerica, MA, E.U.A.). O anticorpo p27

KIP1 era de BD Transdução Laboratories (Lexington, KY, EUA). Os anticorpos fosfo-Tyr15 Cdk2 e fosfo-Cdk2 Thr14 foram adquiridos a Epitomics (Burlingame, CA, E.U.A.). Cdk7 e ciclina H eram de Abnova (Taipei, Taiwan). Detecção de α-tubulina (Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.) ou β-actina (Novus, Littleton, CO, EUA) foi utilizado como controlo de carga. Por SDS-PAGE de Cdk2 e ajustamento do pH do tampão de gel de separação a 8,5 foi necessário para a resolução da isoforma de migração mais rápida. Intensidade das bandas de diferentes proteínas foi quantificada com EPSON TX130 stylus usando UN-SCAN-IT gel 6,1 software.

A proliferação celular ensaio

LNCaP células 104-R1 ou PC-3 sublinhas foram semeadas a uma densidade de 3 x 10

3 células /cavidade em placas de 96 poços com 100 ul de meio DMEM contendo 10% de CS-FBS. Os ensaios de proliferação foram realizados como descrito anteriormente [13], [15], [33] – [39]. Todas as leituras foram normalizados para a média da condição de controlo em cada experiência individual. A experiência foi repetida três vezes. Dez poços foram utilizados para cada condição. A média eo desvio-padrão representou a média e desvio padrão, respectivamente, dos resultados de todos os 30 poços nos três experimentos.

Fluxo de análise de citometria de

As células foram semeadas a uma densidade de 5 x 10

5 as células em placas de 6 cm. ensaio de citometria de fluxo foi realizada como descrito anteriormente [13], [15], [35] -. [37], [39]

Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction

O RNA total foi isolado utilizando o Reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) e foi tratado com DNase I (isenta de ADN; Ambion, Austin, TX). A transcrição reversa foi realizada com hexâmeros aleatórios e transcriptase reversa de Moloney de murino o vírus da leucemia (Omniscript; Qiagen, Valência, CA). A TaqMan iniciador /sonda foi concebida utilizando Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA). A extremidade 5 ‘da sonda foi marcada com FAM corante repórter fluorescente. A extremidade 3 ‘da sonda foi marcada com corante extintor TAMRA. As sequências dos iniciadores CDKN1B, 5’-CCGGTGGACCACGAAGAGT-3 ‘e 5′-GCTCGCCTCTTCCATGTCTC-3′; sonda CDKN1B, 5’-AACCCGGGACTTGGAGAAGCACTGC-3 ‘. PCR em tempo real foi realizada em um sistema ABI Prism 7700 (Applied Biosystems) usando o protocolo QuantiTect sonda de PCR (Qiagen). O kit de controlo de rRNA (Applied Biosystems) foi utilizado para normalizar os níveis de transcritos de entre as amostras.

Isolamento de ADNc Skp2

Um ADNc Skp2 foi isolado por amplificação por PCR a partir de um LNCaP 104-R1 Lambda Zap- biblioteca de ADNc II, utilizando os seguintes iniciadores derivados da sequência Skp2: 5′-CAGCTCTGCAAGTTTAATGC-3 ‘e 5′-AAGAAGAGACACCATCCTGC-3’. O programa seguinte foi utilizado: pré-amplificação a 94 ° C 5 min, 55 ° C 2 min, 30 ciclos de 72 ° C 2 min, 94 ° C, 0,5 min, 55 ° C 0,5 min, seguido por 7 min a 72 ° C. Pfu (Stratagene) foi utilizado como ADN-polimerase e dimetil-sulfóxido na concentração final de 10% foi utilizado na reacção de amplificação. Um produto de amplificação de 1345 pb foi inserido no vector digerido com EcoRV-pBluescript II por análise de sequência didesoxi automáticas. Um clone Skp2 foi escolhido para a verificação da sequência e foi utilizada em todas as experiências subsequentes. O cDNA Skp2 foi transferido a partir deste clone pBluescript com o vector retroviral pMV7 para a expressão constitutiva em LNCaP células 104-R1.

infecção retroviral estável de Skp2

células 104-R1 foram infectados com retrovírus pMV7 contendo inserções Skp2 que foi gerado na ΦNX-Ampho células utilizando procedimentos descritos anteriormente embalagens [10]. A linha celular de empacotamento ΦNX-Ampho foi fornecida por Garry Nolan da Universidade de Stanford. Estavelmente células infectadas foram seleccionadas por G418.

A expressão de GST-Skp2 proteína

fragmentos

Smal-HindIII de Skp2 ADNc foram inseridos em Smal-HindIII de corte pGEX-KG [40]. Os plasmídeos foram transfectados para E. coli células BL-21-CodonPlus-RIL (Stratagene) para isopropílico expressão induzida por tiogalact�ido de transferase glutationa enxofre proteínas (GST) -Skp2 fusão.

In Vitro

ensaio da actividade de CDK2

os lisados ​​celulares foram feitas a partir de células LNCaP 104-R1 infectadas com vírus vazio MV7 e células LNCaP 104 que sobre-expressam R1-Skp2 cultivadas durante 3 dias na presença ou ausência de 10 nM R1881. Ensaio da actividade de CDK2 utilizando a histona H1 como substrato foi descrito anteriormente [10]. Para Cdk2 fosforilação de um péptido sintético Skp2, dois péptidos 12 resíduos (GHPESPPRKRLK e GHPEAPPRKRLK) correspondentes às posições 60 a 71 da proteína Skp2 de tipo selvagem e foi utilizado como substratos em reacções de quinase Cdk2 com imunoprecipitado. Os lisados ​​celulares foram feitas a partir de células LNCaP 104-R1 cultivadas durante 4 dias na presença ou ausência de 10 nM R1881. Alíquotas de lisado (1 mg de proteína total), preparado tal como descrito anteriormente [10] foram incubados com 2 mg de Cdk2 anticorpo ligado a esferas de proteína G-agarose. Depois de lavar 3 vezes em tampão de lise e 2 vezes em tampão de quinase (50 mM de HEPES pH 7,5; MgCl2 10 mM, DTT 0,5 mM e 0,02% de Triton X-100), as esferas foram incubadas com 10 mCi de ATP [g-32P] e 20 péptido mM num volume total de 25 ml durante 30 min a 30 ° C. As reacções foram terminadas pela adição de 3 ml de EDTA 0,5 M e 10 ml de aliquotas foram manchados em filtros de discos P-81 de 2,5 cm (Whatman). Os discos foram lavadas 5 vezes com 0,5% de H3PO4 e uma vez com 50% de etanol /0,05% de H3PO4 para remover o ATP não incorporado. marcador incorporado foi determinada por espectrofotometria de cintilação líquida. Blanks consistiu de reacções de quinase utilizando esferas de agarose carregadas com anticorpos não incubadas com lisado celular. As reacções foram realizadas em quadruplicado.

AR e Skp2 sobreexpressão em células PC-3

PC-3 foram transfectadas com LNCX-2 contendo plasmídeo de tipo selvagem mutante células AR ou LNCaP humanas ‘ AR ADNc e seleccionados com G418 neomicina, como descrito anteriormente [32]. As células PC-3 com superexpressão do tipo selvagem AR ou LNCaP mutante AR foram então indicado como PC-3

AR ou PC-3

LNCaP-AR. PC-3

células AR ainda transfectadas com plasmídeo LPCX contendo Skp2 cDNA ou plasmídeo de controlo LPCX foram selecionadas com puromicina. colónias resistentes a antibióticos foram expandidas e selecionados para o aumento da expressão da proteína alvo por análise de Western blot.

dados de domínio público

perfis de expressão de genes selectivos de conjuntos de dados contendo tumor e tecidos normais adjacentes de pacientes APC, incluindo GSE6919 [41], que contém 23, próstata normal e 89 tecidos do carcinoma da próstata, próstata e conjuntos de dados Singh [42], que contém 50 amostras de próstata normais e 52 amostras de carcinoma da próstata, foram transferidos a partir Oncomine (http: //www.oncomine .com), sem processamento adicional.

Análise de dados

os dados são apresentados como a média +/- SD de pelo menos três experiências ou são representativos de experiências repetidas pelo menos três vezes. O teste t de Student (bicaudal, emparelhado) foi utilizado para avaliar a significância estatística dos resultados das experiências de ensaio de proliferação.

Resultados

tratamento de andrógeno proliferação suprimida da AR-rica células CRPC

O tratamento com andrógeno sintético proliferação celular dependente da dose suprimiu R1881 de AR-rica LNCaP 104-R1, PC-3 superexpressão tipo selvagem AR (PC-3

AR) e PC-3 superexpressão LNCaP AR mutante (PC -3

LNCaPAR) células, mas não abrangem as células PC-3 AR-negativo (PC-3

LNCX-2) (Fig. 1A). Antiandrogénio Casodex bloqueou a supressão androgénica, confirmando que a inibição sobre a proliferação celular androgénica foi através de AR (Fig. 1A). O tratamento com 10 nM R1881 diminuiu percentagem de população de células em fase S e interrupção do ciclo celular fase G1 induzida em LNCaP 104-R1, PC-3

AR, e PC-3

LNCaPAR células, mas não controla PC-3

LNCX-2 (Fig. 1B, 1C).

(A) LNCaP 104-R1 células, PC-3 células com plasmídeo de controlo LNCX-2 (PC-3

LNCX-2) , as células PC-3 que sobre-expressam tipo selvagem AR (PC-3

AR) e células PC-3 que sobre-expressam LNCaP AR (PC-3

LNCaP-AR) foram tratados com o aumento da concentração de androgénio sintético R1881 ou Casodex antiandrogénio durante 96 horas. número relativo de células foi determinado pelo ensaio fluorimétrico de DNA descrito em Materiais e Métodos e foi normalizado ao número de células das células de controlo (sem tratamento). LNCaP 104-R1, PC-3

LNCX-2, PC-3

AR, e-3 PC

células LNCaP-AR foram tratados com ou sem 10 nM R1881 por 96 h. Percentagem da população celular de LNCaP 104-R1, PC-3

LNCX-2, PC-3

AR, e PC-3

células LNCaP-AR em fase S (B) e fase G1 (C ) foi determinada pelo fluxo de PI-coloração de citometria. Os valores representam o erro médio +/- padrão derivado de 5 experiências independentes. Asterisco *, **, *** denotam a diferença significativa

p Art 0,05,

p Art 0,01,

p Art 0,001, respectivamente, do células tratadas em comparação com células de controlo.

tratamento de andrógeno afeta reguladoras do ciclo celular proteínas em células CRPC

tratamento de andrógeno aumentaram ligeiramente expressão AR, mas aumentou dramaticamente p27 inibidor do ciclo celular

KIP1 em LNCaP 104-R1,

AR PC-3, PC-3 e as células

LNCaPAR (Fig. 2). No oposto, o tratamento de androgénio a diminuição da expressão da proteína de Skp2, Cdk2, fosfo-Cdk2 Tyr15, fosfo-Cdk2 Thr14, fosfo-Cdk2 Thr160, CDK7, ciclina A, ciclina H, e c-Myc em LNCaP 104-R 1, PC-3

AR, e PC-3

LNCaPAR células (Fig. 2). nível de proteína de p27

KIP1 foi inversa-correlacionada com Skp2 nestas células CRPC, que era consistente com o fato de que Skp2 alvo p27

KIP1 para ubiquitinação e degradação [18] – [20]. Abundância de p21

Cip1 foi ligeiramente reduzida em células LNCaP 104-R1, mas foi aumentado no PC-3

AR e PC-3

LNCaPAR células por andrógeno. Abundância de E2F-1 foi ligeiramente reduzida em células LNCaP 104-R1, mas foi drasticamente reduzida nos PC-3

AR e PC-3

LNCaPAR células por andrógeno. Abundância da ciclina E não foi significativamente afetada pelo tratamento de andrógeno. Activação de complexos de Cdk2 requer desfosforilação de Thr14 e Tyr15 em Cdk2 por fosfatase cdc25 e fosforilação de Thr160 na Cdk2 [26], [27], que é mediada por CAK, um complexo de cdk7 e ciclina H [28]. Embora a fosforilação de Thr14 e Tyr15 foi ligeiramente reduzida por tratamento de androgénio, a fosforilação de Thr160 foi dramaticamente suprimida pelo tratamento de androgénio, possivelmente devido à redução de cdk7 e ciclina H expressão de proteína (Fig. 2). tratamento de andrógeno aumentaram p27

KIP1, ciclina A, e c-Myc, enquanto p21 diminuiu

Cip1 e Skp2 em células de comando AR-negativas PC-3

LNCX-2. Desde andrógeno não afectar a progressão do ciclo celular e a proliferação de PC-3

LNCX-2 células, as funções destas proteínas em PC-3

células LNCX-2 não foi claro. metas Skp2 p27

KIP1 para ubiquitinação e degradação [18] – [20]. No entanto, sob tratamento de 0,1 e 10 nM R1881, o nível de expressão do gene de CDKN1B (p27

KIP1) aumentou 1,3 e 1,7 vezes, respectivamente (Fig. 3A). Tal como c-Myc foi reportado para reprimir a transcrição mediada por FOXO3a de CDKN1B [43], a redução de c-Myc causada por tratamento de androgénio pode contribuiu para o aumento da expressão do gene CDKN1B (Fig. 2). Cremos, portanto, que a redução da degradação de proteínas e aumento da transcrição de genes tanto contribuiu para o aumento da p27

nível de proteína KIP1, o que pode, portanto, induzir a paragem do ciclo celular em células G1 CRPC.

A expressão de proteína de AR, Skp2, Cdk2, fosfo-Cdk2 Tyr15, fosfo-Cdk2 Thr14, fosfo-Cdk2 Thr160, CDK7, ciclina e, cyclinA, a ciclina H, p21

CIP, p27

Kip, c-Myc e E2F-1 foi determinada por ensaio Western blot em LNCaP 104-R1, PC-3

LNCX-2, PC-3

AR, e PC-3

células LNCaP-AR tratados com diferentes concentrações de R1881 por 96 h. abundância de proteína α-tubulina foi utilizada como controlo de carga.

(A) A expressão de genes de CDKN1B foi determinada em LNCaP 104-R1 células tratadas com 0, 0,1, ou 10 nM R1881 durante 96 h usando qRT-PCR. células LNCaP 104-R1 tratadas com 10 nm R1881 na presença ou na ausência de 5 uM de anti-androgénio Casodex durante 96 h. Asterisco * indica diferença significativa

p Art 0,05 das células tratadas, em comparação com células de controlo. (B) número relativo de células foi determinado pelo ensaio de ADN fluorométrico. (C) Percentagem de população de células em fase S foi determinado por análise de citometria de fluxo. Asterisco * indica uma diferença significativa (

p Art 0,05) das células tratadas, em comparação com células de controlo. (D) A histona H1 fosforilação foi ensaiada utilizando Cdk2 imunoprecipitada a partir de lisado celular contendo 2 mg de proteína. radioactividade relativa foi determinada pela digitalização com uma tempestade 860 phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, EUA). nível de expressão de proteína de Cdk2, p27

KIP1, e β-actina foram determinados por Western blotting de lisados ​​celulares das mesmas. A abundância de proteína β-actina foi utilizado como controlo de carga.

actividade de Cdk2 tratamento andrógeno suprimida

Cdk2 é uma cinase de histona H1 responsável pela fosforilação da histona durante a transição a partir do ciclo celular G1 para a fase S [44] – [46]. A fim de confirmar que a actividade de Cdk2 foi suprimido por tratamento de androgénio, utilizou-se histona H1 como substrato para o ensaio de actividade de quinase. Redução da proliferação de células (Fig. 3B) e a diminuição da população de células da fase S (Fig. 3C) em células LNCaP 104-R1 causados ​​pelo tratamento de androgénio estavam intimamente associados com a diminuição da actividade de CDK2, como detectado pela redução da fosforilação da histona H1, a diminuição de uma forma de migração mais rápida de Cdk2, e um aumento da p27 inibidor de Cdk

KIP1 abundância (Fig. 3D). A Cdk2 de migração mais rápida foi anteriormente identificada como uma forma activa de Cdk2 que é fosforilada em Thr160 [47]. tratamento antiandrogénio Casodex bloqueou os efeitos do androgénio sobre a proliferação celular, o ciclo celular, a fosforilação da histona H1, e a actividade de Cdk2 (Fig. 3B, C, D).

A sobre-expressão de Skp2 bloqueado supressão androgénica em LNCaP 104- células R1

Skp2 é fosforilada e activada por Cdk2 [20], assim como forma um complexo estável com a ciclina a e Cdk2 [20]. Nós relatado anteriormente que a sobre-expressão de Skp2 bloqueou parcialmente a proliferação das células LNCaP 104-R2 [15]. Neste estudo, determinou-se a relação entre a sobre-expressão e actividade Skp2 Cdk2. Superexpressão de Skp2 em células LNCaP 104-R1 aliviado repressão androgênica da atividade Cdk2 como ensaiado de

in vitro

fosforilação da histona H1 imunoprecipitadas com Cdk2 (Fig. 4A). Medição da actividade de quinase em imunoprecipitados Cdk4 preparados a partir destas células não mostraram diferença (dados não mostrados). A sobre-expressão de Skp2 em células LNCaP 104-R1 parcialmente reduzido da indução de p27

KIP1 (Fig. 4A), a inibição do crescimento (Fig. 4B), e a paragem do ciclo celular G1 (Fig. 4C) causada por tratamento de androgénio. O nível basal de p27

KIP1 em células 104-R1 Skp2-sobre-expressos foi muito menos em relação ao controle 104-R1 células (Fig. 4a). Isto pode explicar porque as células 104-R1 com superexpressão Skp2 proliferaram 1,42 vezes mais rápido do que o controle 104-R1 células (Fig. 4B).

(A) nível de expressão de proteína de Skp2 e p27

KIP1 em LNCaP 104-R1 células infectadas com retrovírus pMV7 vazio (controlo) ou contendo retrovírus pMV7 Skp2 foi determinada por Western blotting. As células foram cultivadas durante 3 dias na presença ou ausência de 10 nM R1881. atividade Cdk2 foi medida por

in vitro

fosforilação da histona H1 usando imunoprecipitados Cdk2. A abundância de proteína β-actina foi utilizado como controlo de carga. (B) A proliferação celular de células LNCaP 104-R1 infectadas com pMV7 retrovírus vazio (controlo) ou retrovírus pMV7 contendo Skp2 tratadas com ou sem 10 nM de R1881 durante 96 horas foi determinada utilizando o ensaio de ADN fluorimétrico e foi normalizada para o número de células de controlo grupo (sem tratamento). (C) Percentagem de células LNCaP 104-R1 na fase S foi determinado por citometria de fluxo. As células foram cultivadas durante 3 dias na presença ou ausência de 10 nM R1881. Asterisco indica uma diferença significativa (

P

0,05) a partir de células de controlo. células (D) LNCaP 104-R1 foram tratadas com ou sem 10 nM de R1881 durante 3 dias. As proteínas de fusão GST de controlo (pistas 1-3) e em bactérias GST-expressas-Skp2 (pistas 4-6) ligada a esferas de glutationa-agarose foram incubados com 200? g de lisados ​​de células inteiras a partir de células não tratadas e tratadas com 104 de androgénio-R1 na presença de 10 uCi de [

32P] -ATP durante 30 min à temperatura ambiente. “NL” representa como não ligado. As proteínas fosforiladas foram eluídas em tampão de carregamento de gel de Laemmli e separados num gel de SDS-PAGE a 10% que foi, em seguida, secos e expostos a filme Kodak X OMAT AR durante 3 dias. células (E) 104-R 1 foram tratadas com ou sem 10 nM de R1881 durante 3 dias. A fosforilação de GST eluída (pistas 1-3) e GST-Skp2 (pistas 4-6) proteínas de fusão foi determinada por Cdk2 imunoprecipitado. Cdk2 foi imunoprecipitada a partir de alíquotas de lisado contendo 1 mg de proteína preparados a partir de não tratadas (pistas 2, 5 e 8) ou R1881-tratadas (pistas 3, 6 e 9) células 104-R1. faixas de controlo (pistas 1, 4 e 7) marcado “ni” não indicou Cdk2 imunoprecipitado. actividade de CDK2 foi determinada por meio de métodos descritos em Materiais e Métodos.

andrógeno regula a fosforilação de Skp2 através Cdk2

Infelizmente, os anticorpos que detectam a fosforilação da Ser64 Ser72 ou em Skp2 não são comerciais disponíveis . Para determinar se o tratamento do andrógeno afecta a fosforilação de Skp2, Incubámos-bacterianamente expressa proteínas de fusão GST-Skp2 ligada a esferas de glutationa-agarose com lisados ​​de células inteiras a partir de células LNCaP 104-R1 não tratados e tratados de androgénios, na presença de [g-

32P] ATP. Descobrimos que lisado a partir de células 104-R1-tratada continha menos de androgénio actividade de quinase capaz de fosforilar as proteínas de fusão de 74 kDa GST-Skp2 em comparação com o lisado a partir de células não tratadas (Fig. 4D). Este resultado indicou que o tratamento reduziu a fosforilação de androgénio total da Skp2. Em seguida, investigou se Cdk2 realmente fosforilar Skp2. Quando as proteínas de fusão GST-Skp2 foram usadas como substratos em reacções de quinase Cdk2 com imunoprecipitadas a partir de lisados ​​celulares de LNCaP 104-R1, resultados semelhantes foram observados quanto que a partir da fig. 4D (Fig. 4E). Este resultado revelou que Cdk2 fosforilada Skp2 ea atividade de Cdk2 para fosforilar Skp2 foi suprimida pelo tratamento de andrógeno em células LNCaP 104-R1.

superexpressão do Skp2 bloqueou a supressão androgênica no PC-3

AR e PC- 3

células LNCaPAR

Semelhante a LNCaP 104-R1 células, superexpressão de Skp2 bloqueados parcialmente os efeitos dose-dependentes da inibição androgênica sobre a proliferação celular e progressão do ciclo celular de

células AR-3 PC ( Fig. 5).

(a) expressão das proteínas Skp2 foi analisada por Western blot em células PC-3 re-expressando células de tipo selvagem AR (PC-3

AR) e superexpressão qualquer vector de controlo ou Skp2 na ausência ou na presença de 10 nM de R1881 durante 96 h. Efeito do androgénio sobre a proliferação celular (B), ou a progressão do ciclo celular (C) destes clones tratados com o aumento da concentração de R1881 durante 96 horas foi determinada por ensaio de proliferação de 96 poços e fluxo de PI-coloração de citometria de análise, respectivamente. Asteriscos * e ** indicam uma diferença significativa

p Art 0,05 e

p

. 0,01, respectivamente, entre a células de controlo de tratamento e

correlação entre Skp2, Cdk2, ciclina a, e CDK7 em tumores CaP

de acordo com o facto de a expressão e actividade de Skp2 é regulada por Cdk2 e ciclina a em células APC e que Skp2, Cdk2 e ciclina a coordenadamente regular a proliferação celular em células APC, temos a hipótese de que o nível de Skp2 (Skp2), Cdk2 (CDK2), e ciclina a (CCNA2) a expressão do gene pode apresentar boa correlação positiva em tumores APC. Com efeito, a análise dos dados indicou que Oncomine nível de Skp2, CDK2 expressão do gene, e CCNA2 correlacionada positivamente bem em ambos GSE6919 [41] (Fig. 6A) e Singh conjuntos de dados de tumor da próstata [42] (Fig. 6B). À medida que a fosforilação de Thr160 na Cdk2 é mediada por CDK7 [28], determinou-se a expressão do gene de CDK7 correlacionada com Cdk2, Skp2, e CCNA2 em tumores APC. Surpreendentemente, a expressão do gene de CDK7 negativamente correlacionado com CDK2, Skp2 e CCNA2 em ambos os GSE6919 [41] conjuntos de dados de tumores de próstata (Fig. 7A) e Singh [42] (Fig. 7B).

Gráficos de dispersão mostrando correlação de genes indicados em GSE6919 (a) e os conjuntos de dados da próstata Singh (B). O valor r indicou coeficiente de correlação. Probe ID para CCNA2, CDK2 e Skp2 foram 40697_at, 1792_g_at e 1941_at em GSE6919 e 1943_at, 1792_at e 39449_at no conjunto de dados de próstata Singh.

Gráficos de dispersão que mostram correlação dos genes indicados no GSE6919 ( A) e Singh conjuntos de dados da próstata (B). O valor r indicou coeficiente de correlação.