Abstract

Os mediadores inflamatórios no microambiente do tumor promover o crescimento tumoral, desenvolvimento vascular e permitir a evasão da resposta imune anti-tumorais, desativando infiltrando dendrítica células. No entanto, os componentes do microambiente do tumor que influenciam directamente a maturação de células dendríticas e função não estão bem caracterizados. O nosso objectivo era identificar os mediadores inflamatórios associados a tumores que influenciam a função de células dendríticas. meios condicionados de tumor obtidos a partir de tecido de explante de tumor colo-rectal de cultura continha níveis elevados da CCL2 quimiocinas, CXCL1, CXCL5 Além de VEGF. Pré-tratamento de células dendríticas derivadas de monócitos com este meio condicionado do tumor inibiu a sobre-regulação de CD86, CD83, CD54 e HLA-DR em resposta ao LPS, aumentando IL-10, enquanto reduz a secreção de IL-12p70. Examinamos se os componentes individuais específica do suporte tumor condicionado (CCL2, CXCL1, CXCL5) pode modular a maturação de células dendríticas ou secreção de citocinas em resposta a LPS. VEGF foi também avaliada uma vez que tem um efeito supressor sobre a maturação de células dendríticas. Pré-tratamento de células dendríticas imaturas com VEGF induzida por LPS inibiu a regulação positiva de CD80 e CD54, enquanto CXCL1 inibida HLA-DR. Curiosamente, o tratamento de células dendríticas com CCL2, CXCL1, CXCL5 ou VEGF suprimiu significativamente a sua capacidade para segregar IL-12p70 em resposta a LPS. Além disso, as células dendriticas tratadas com uma combinação de VEGF segregada CXCL1 e menos IL-12p70 em resposta a LPS em comparação com pré-tratamento com citocina, quer sozinho. Em conclusão, a mídia tumor condicionado influencia fortemente a maturação de células dendríticas e função

Citation:. Michielsen AJ, Hogan AE, Marry J, Tosetto M, Cox F, Hyland JM, et al. (2011) Tumor Tissue Microenvironment pode inibir a maturação de células dendríticas no câncer colorretal. PLoS ONE 6 (11): e27944. doi: 10.1371 /journal.pone.0027944

editor: Francesco Dieli, Universidade de Palermo, Itália |

Recebido: 30 de maio de 2011; Aceito: 28 de outubro de 2011; Publicado: 18 de Novembro 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Michielsen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado pelo Conselho de Pesquisa irlandês para a Ciência, Engenharia e Tecnologia e da Fundação Gibbons Darren. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

As células dendríticas (CDs) são células apresentadoras de antigénios potentes capazes de activar as células T ingénuas. DCs estão presentes em tecidos em um estado imaturo e apresentar baixos níveis de maturação ou marcadores co-estimuladores tais como CD83, CD80 ou CD86. Imaturo DCs (iDCs) reconhecer e capturar antígenos específicos, incluindo antígenos tumorais. DCs sofrer um processo de maturação funcional em resposta a mediadores inflamatórios, tais como IFN-α ou agonistas do receptor de tipo Toll (TLR). Como DCs maduras que ganhar o potencial de apresentar o antigénio às células T e activar uma resposta específica das células T anti-tumor [1], [2]. DCs que secretam altos níveis de bioativo IL-12p70 induzir imunidade anti-tumoral ideal, como eles têm uma maior capacidade para melhorar a atividade das células natural killer, inclinar a resposta Th1 e privilegiada tumor específico CD8

+ T células [3], [ ,,,0],4].

no entanto, muitos tumores evadir a resposta imune através da secreção de citoquinas e outros factores que inibem a diferenciação DC ou a maturação de DC se infiltram no tumor. [1]. Um dos elementos, estes “pró-tumorais”, Factor de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) é conhecida para sustentar o crescimento do tumor através das suas propriedades angiogénicas mas também podem provocar um efeito inibidor sobre a diferenciação DC e maturação, aumentando a sobrevivência do tumor [1], [5] , [6], [7], [8]. O VEGF tem sido alvo de sucesso do anticorpo monoclonal humanizado, bevacizumab (Avastin) [9], no entanto, as taxas de resposta são de aproximadamente 40% e muitos doentes desenvolvem resistência a este tratamento. Portanto, é crucial para explorar o potencial de outros mediadores inflamatórios presentes no microambiente tumoral que podem inibir a maturação de CD, uma vez que estes podem também ser alvos terapêuticos potenciais.

várias citocinas e quimiocinas estão presentes em níveis elevados no microambiente do tumor, em comparação com tecidos normais, tais como CCL2 (MCP-1), CXCL1 (GROa) e CXCL5 (ENA-78) [10], [11], [12]. CCL2 é conhecido para atrair monócitos, células T e células dendríticas [10], [13], enquanto que a função principal da CXCL1 e CXCL5 é o de atrair e activar os neutrófilos [14], [15]. Para além das suas funções quimioatractivas, CCL2, CXCL1 e CXCL5 também desempenham um papel importante na angiogénese [15], [16], [17], demonstrando a natureza multifuncional destas quimiocinas. Sabe-se que as DCs mielóides humanas expressam CCR2 e CXCR2, os receptores para CCL2 e CXCL1 e CXCL5, respectivamente [18], [19]. No entanto, o efeito destas quimiocinas na maturação e função DC não foi previamente investigado.

Neste estudo, foram utilizados explantes tecido de cancro colorectal humano para modelar o microambiente do tumor [20]. tecidos de explante a manter a estrutura 3D complexo do tumor, incluindo o estroma, permitindo, assim, a produção de muitos factores diferentes associados a tumores, que imita de perto a meio inflamatório do tumor

In situ

. Estudos anteriores demonstraram que os sobrenadantes de linhas celulares tumor pode inibir a maturação DC [21], [22], contudo, a importância dos factores segregados por todo o tumor sobre a maturação de células dendríticas não foi examinada anteriormente.

Demonstramos tumor que meio condicionado (TCM) a partir de tumores de cancro colorrectal cultivadas LPS inibiu significativamente a maturação induzida por DC, aumentando marcadamente a IL-10, enquanto diminui a secreção de IL-12p70 em resposta a LPS. Descobrimos que o TCM continham quantidades significativas do CCL2 quimiocinas, CXCL1 e CXCL5 Além de VEGF. Níveis de CCL2, CXCL1 e CXCL5 no TCM correlacionada com a expressão CD83 e secreção de IL-12p70 de DCs tratadas com TCM. Individualmente, todos estes mediadores inflamatórios significativamente inibidas por LPS induzido secreção de IL-12p70, mas a IL-10 permaneceram inalterados secreção. Curiosamente, os efeitos do VEGF e CXCL1 sobre a inibição induzida por LPS de IL-12p70 secreção pelas DCs foram aditivos. Além disso, CXCL1 também teve um efeito inibidor marcado no LPS induziu aumento da regulação do HLA-DR.

Resultados

media tumor condicionado inibe a secreção de maturação DC e IL-12p70, enquanto aumenta a IL-10 secreção em resposta a LPS

DCs derivadas

monócitos obtido a partir de 2 voluntários saudáveis ​​foram incubadas com diferentes volumes de TCM a partir de pacientes com cancro colorectal 4 durante 4 horas antes de LPS simulação durante mais 18 horas, para determinar a concentração óptima de TCM. Foi examinado o efeito do TCM sobre a capacidade de DC a secretar IL-10 e IL-12p70 em resposta à estimulação por LPS. A secreção de IL-12p70 por DCs aumenta e dirige a expansão e diferenciação de respostas Th1 específicos do tumor, enquanto altos níveis de secreção de IL-10, preferencialmente, leva à expansão de células T reguladoras imunossupressores. O tratamento de DCs com uma diluição de 1 para 2 do TCM mostrou ter o efeito mais potente sobre a IL-10 e aumento de IL-12p70 de inibição (p = 0,028) em resposta ao LPS (Figura 1). Não foi observada nenhuma diferença significativa da expressão de CD80, CD86, CD54, CD83 e HLA-DR (MHC II), marcadores associados a de maturação de DC, entre as diferentes diluições de TCM (dados não mostrados). Por conseguinte, utilizou-se uma diluição de 1 em 2 de TCM para análise posterior.

monócitos células dendríticas derivadas imaturo (iDCs) (n = 2) foram tratadas durante 4 horas com 01:02, 01:04 e 01:10 Meios de diluições tumor condicionado (TCM) obtidos por cultura dos explantados tumores de pacientes com cancro colorectal 4

in vitro

durante 72 horas. Foi adicionado LPS (1 ug /ml) e as células foram cultivadas durante mais 18 horas. Os sobrenadantes foram recolhidos a partir das células cultivadas tal como descrito acima, e os níveis de IL-10 e IL-12p70 secreção por as DCs foram medidos por ELISA. As diferenças estatísticas foram determinadas pelo teste de Mann-Whitney.

monócitos DCs derivados obtidos a partir de 6 dadores saudáveis ​​foram tratados com 1 em 2 TCM de 21 doentes com câncer colorretal durante 4 horas antes do tratamento com LPS durante mais 18 hora e, curiosamente, as DCs tratadas TCM segregados níveis significativamente mais elevados de IL-10 em resposta ao LPS (p 0,0001), mas os níveis significativamente mais baixos de IL-12p70 (p 0,0001) (Figura 2A). Além disso IL-12p70 mostraram uma correlação negativa com a expressão de CD83 de Spearman r = -0,71, p . 0,001 (dados não mostrados), sugerindo ainda que o TCM DCs tratadas com o aumento da expressão de CD83 têm a diminuição dos níveis de secreção de IL-12p70

iDC (n = 6) foram tratados com o TCM de 21 pacientes com cancro colorectal de 4 horas antes da adição de LPS; as células foram cultivadas durante mais 18 horas. Os níveis de IL-10 e IL-12p70 secreção por as DCs foram medidos por ELISA. As diferenças estatísticas foram determinadas por análise de variância. (A) Expressão dos marcadores de maturação seguintes: CD80, CD54, CD86, HLA-DR, CD83 e foram avaliadas por citometria de fluxo. Uma experiência representativa de seis é mostrado (B). A mudança Fold em M.F.I. de cada marcador foi calculada em relação ao iDCs não estimuladas por células tratadas com LPS ou LPS + TCM. A significância estatística foi calculada utilizando o teste de classificações de Wilcoxon assinado. (C). *

p

0,05, **

p Art 0,01 e ***

p

. 0,001

Tratamento de DCs com maturação DC induzida por LPS TCM também inibiu significativamente, com redução da expressão de CD54 (

p Art 0,0001), CD86 (

p

= 0,0035), HLA-DR (

p

= 0,0474) e CD83 (

p

= 0,0018) observado (Figura 2B C). O tratamento de DCs com meios condicionados feita a partir de tecido normal adjacente ao tecido tumoral (NCM) não inibiu a maturação induzida por LPS ou secreção de citocinas a partir de DC (Figura 3).

meios condicionados normal (NCM) de 5 cancro colorectal pacientes foi utilizado para tratar DCs derivadas de monócitos antes de adicionar LPS. A expressão de CD80, CD54, CD86, HLA-DR e CD83 foi medida por citometria de fluxo. Não foi observada diferença estatisticamente significativa. A análise estatística foi realizada utilizando o teste de Wilcoxon.

Os níveis de CCL2, CXCL1 e CXCL5 presente no TCM correlacionar com a expressão CD83 e secreção de IL-12p70 de DCs

TCM obtido a partir de 21 pacientes com cancro colo-rectal foram analisados ​​por ELISA para a vários factores associados a tumores conhecidos. Os níveis de CCL2, CXCL1 e CXCL5 foram consistentemente mais elevados do que aqueles do VEGF (um alvo terapêutico actual em cancro colorrectal) em todos os pacientes examinados. Descobrimos que os níveis de CCL2 (Spearman r = 0,59,

p

= 0,0053) CXCL1 (Spearman r = 0,50,

p

= 0,0202) e CXCL5 (Spearman r = 0,50,

p = 0,0199

) presente no MTC positivamente correlacionada com a expressão de CD83 em DCs tratadas com o TCM (Figura 4A). Isto implica que, com níveis crescentes de CCL2, CXCL1 e CXCL5 presente no TCM, expressão CD83 é elevado em DCs tratadas com TCM. Apesar de VEGF está presente em níveis detectáveis ​​no TCM, ele não mostrou correlação com a maturação DC. Além disso verificou-se que a IL-12p70 secreção das DCs tratadas com TCM negativamente correlacionada com CCL2 (Spearman r = -0,64,

p

= 0,0019), CXCL1 (Spearman r = -0,59,

p

= 0,0049) e CXCL5 (Spearman r = -0,57,

p

= 0,0075) (Figura 4B). Isto sugere que, com níveis crescentes de CCL2, CCL1 e CXCL5 na secreção TCM, IL-12p70 de DCs diminui. Não houve correlação significativa entre os quatro citocinas e outros marcadores DC, CD80, CD54, CD86 e HLA-DR, e IL-10 secreção.

As concentrações de CCL2, CXCL1, CXCL5 e VEGF no tumor condicionado media de 21 doentes com cancro colorectal foram medidos por ELISA. As concentrações de CCL2, CXCL1 e CXCL5 correlacionada com a expressão de CD83 em DCs tratadas com o TCM (A). CCL2, CXCL1 e CXCL5 inversamente correlacionados com a secreção de IL-12p70 de células dendriticas tratadas com o TCM (B). foi utilizado o teste de correlação de Spearman.

Efeito da CCL2, CXCL1, CXCL5 e VEGF em DC expressão maturação marcador e secreção de citocinas em resposta a LPS

Tendo estabelecido que TCM inibe DC maturação em resposta a LPS e que TCM contém altos níveis de CCL2 quimiocinas, CXCL1 e CXCL5 nós próxima determinado se estes componentes individuais tiveram um efeito direto sobre DCs. Expressão induzida por LPS VEGF recombinante inibiu significativamente de maturação DC marcadores CD80 (

p

= 0,0391) e CD54 (

p

= 0,0078) e CXCL1 inibiu significativamente a regulação positiva de HLA-DR (

P

= 0,0156) (dados não mostrados). Embora CCL2 e CXCL5 mostrou uma redução de maturação induzida por LPS de DCs, esta não atingiu significado estatístico (dados não mostrados). Embora o pré-tratamento de DCs com CCL2, CXCL1, CXCL5 ou VEGF não conseguiu aumentar a IL-10 da secreção induzida por LPS, foi observada uma diminuição significativa nos níveis de induzida por LPS de IL-12p70 secreção: CCL2 (

p

= 0,048), CXCL1 (

p

= 0,0068), CXCL5 (

p

= 0,0255), VEGF (

p

= 0,0402) (Figura 5). IL-1β, TNF-α, IL-8 e IL-6 por DC em resposta a LPS na ausência ou na presença de pré-tratamento com VEGF, CCL2, CXCL1 ou CXCL5 também foram medidos; No entanto não houve diferenças significativas nos níveis destas citocinas determinados sob essas condições (dados não apresentados). O tratamento de DCs com CCL2, CXCL1, CXCL5 e VEGF não afectou a sua capacidade para induzir a proliferação de células T ou a produção de IFN-y (dados não apresentados).

Os sobrenadantes das DCs cultivadas na presença de CCL2, CXCL1 , CXCL5 e VEGF (n = 8) foram colhidas e as concentrações de IL-10 e IL-12p70 determinada por ELISA. A significância estatística foi determinada pelo teste de Mann-Whitney. * P 0,05, ** p . 0,01

Além disso, nós investigamos se CCL2, CXCL1, CXCL5 e VEGF poderia afetar a migração DC. CCL19 foi usada como um controlo positivo, uma vez que é conhecido por se ligar ao receptor de quimioquinas CCR7, que é expresso por DC [23]. Verificou-se que eles não aumentam a migração em comparação com CCL19 (dados não mostrados).

CXCL1 e o VEGF tem um efeito inibitório aditivo na secreção de IL-12p70 por DC em resposta a LPS

O TCM tem um efeito inibitório potente sobre a maturação DC e função, mas CCL2 e CXCL5, que estão presentes em níveis elevados em TCM, não têm um efeito significativo sobre a expressão do marcador de maturação de células dendríticas, enquanto CXCL1 única significativamente inibida HLA-DR e VEGF significativamente inibida CD80 e CD54 (dados não mostrados). Por isso, nós investigamos se a combinação das citocinas recombinantes pode ter um efeito mais potente sobre a maturação de células dendríticas. Foram examinados sete combinações diferentes das quatro citocinas: CCL2 + CXCL1, CCL2 + CXCL5, CCL2 + VEGF, CXCL1 + CXCL5, CXCL1 + VEGF, CXCL5 + VEGF, CCL2 + CXCL1 + CXCL5 + VEGF. A combinação de CXCL1 e VEGF não inibiu significativamente a expressão de maturação marcador induzida por LPS por DCs (CD80

p

= 0,0625, CD54

p

= 0,6, CD86

p

= 0,6, HLA-DR

P

= 0,1, CD83

P

= 0,8) (Figura 6A). No entanto, combinando CXCL1 e VEGF reduziu significativamente induzida por LPS de IL-12p70 (

P

= 0,0028), mas não alterou os níveis de IL-10 (Figura 6B). IL-1β, TNFa, IL-8 ou IL-6 secreções não foi alterada (dados não apresentados). Nenhuma outra combinação teve um efeito directo sobre a induzida por LPS DC maturação ou a secreção de citoquinas das DCs em resposta a LPS quando comparado com as citocinas individuais (dados não mostrados). Em adição a inclusão de anticorpos neutralizantes do CXCL1 e VEGF, combinação isoladamente e em, não corrigiu TCM de alteração induzida de maturação de DC, a IL-10 ou IL-12p70 secreção de DCs em resposta ao LPS (dados não mostrados).

iDCs (n = 5) foram tratados com uma combinação de CXCL1 recombinante (100 ng /mL) e VEGF (20 ng /mL), durante 4 horas antes da adição de LPS (1 ug /ml). As células foram então cultivadas durante mais 18 horas e os níveis de CD80, CD54, CD86, HLA-DR e CD83 foram avaliadas por citometria de fluxo. Os resultados são apresentados como vezes de alteração na M.F.I. em relação ao iDCs não tratados. A significância estatística foi determinada pelo teste de Wilcoxon (A). Os sobrenadantes foram removidos a partir das células tratadas tal como descrito acima e a concentração de IL-10 e IL-12p70 foi determinada por ELISA. A significância estatística foi calculada pelo teste de Mann-Whitney U (B). * P 0,05, ** p . 0,01

Discussão

Neste estudo nós mostramos pela primeira vez que a mídia tumor condicionado a partir de explantes de tumores de cancro colorrectal pode inibir significativamente LPS maturação induzida de monócitos derivados DCs. Além disso, o tratamento de DCs com estimulação TCM antes de LPS aumentou significativamente a produção de IL-10, uma citocina anti-inflamatória que inibe uma resposta Th1 [24], enquanto que diminuindo a secreção de IL-12p70, uma citocina pró-inflamatória necessário para respostas Th1: um fenótipo DC associadas com a tolerância. Subsequentemente, verificou-se que CCL2, CXCL1 CXCL5 e foram expressos em níveis elevados em comparação com o TCM VEGF, e determinou-se se estes mediadores inflamatórios poderiam alterar a função de DCs. O VEGF foi incluído na nossa análise, uma vez que tinha sido previamente demonstrado para inibir a maturação de DC [8], [22]. A adição de VEGF recombinante para iDCs teve um efeito inibidor sobre a supra-regulação induzida por LPS de CD80 e CD54, enquanto a adição de CXCL1 recombinante para iDCs diminuição da expressão de HLA-DR a seguir ao tratamento com LPS.

No entanto, o tratamento de iDCs com humanos CCL2 recombinante, CXCL1, CXCL5 ou VEGF, em doses, de acordo com outros estudos [13], [22], [25], [26], resultou em níveis significativamente reduzidos de secreção de IL-12p70 em resposta à estimulação com LPS. Estes dados sugerem que os mediadores inflamatórios presentes no microambiente tumoral reduzir a capacidade de DC local a secretar IL-12p70 e, assim, a indução de uma resposta anti-tumoral eficaz.

Descobertas similares foram reportados num estudo que investigou o efeito de meio condicionado tiradas a partir da linha celular de cancro pancreático BxPC-3 (BxCM), em que a diferenciação e maturação de DC foi inibida por BxCM. O estudo mostrou que BxCM reduzida a expressão de CD83, CD1a, CD1c, CD80 e CD86 por DC em resposta ao TNF. Consistente com os nossos resultados, este estudo encontrou um aumento significativo em IL-10 e uma redução na produção de IL-12p70 em resposta à estimulação com TNFa após o tratamento BxCM [27]. No entanto, o tratamento de DCs com sobrenadante de CCR-10 (células de carcinoma de célula renal), resultou numa redução da expressão de marcadores de maturação, mas não afecta a produção de IL-10 em resposta à estimulação com TNFa, IFNa e poli I: C [22]. Estes estudos, em conjunto com os dados aqui apresentados, indicam que muitos tipos de tumores segregam mediadores inflamatórios que podem inibir a funcionalidade de DCs; mas que não é provável que seja variação no meio inflamatório e o efeito resultante sobre a função DC de acordo com o tipo de tumor e fase. Embora tivesse sido interessante avaliar e isolar os níveis reais de infiltração DC no tecido de explante de tumor, esta não poderia ser realizada devido à limitação do tamanho do explante que recebeu de uma cirurgia. Os nossos resultados indicam que a NCM não afecta significativamente de maturação de DC ou secreção de citoquinas, indicando que o tecido normal adjacente pode ter a imunidade funcional. Não havia nenhuma evidência de um efeito de campo imunossupressora.

VEGF é estabelecido como um fator importante que contribui para o crescimento tumoral através da indução de angiogênese. O VEGF é um alvo terapêutico em vários cancros, incluindo o cancro colorrectal, em que o anti-VEGF humanizado mAb, bevacizumab (Avastin) é empregue. Estudos anteriores têm demonstrado que o VEGF inibe a de maturação de DC e capacidade para activar DCs células T [5], [8], [22]. Neste estudo, foi demonstrado que o VEGF inibe a expressão de CD80 e CD54, mas não de CD86 ou HLA-DR, dados consistentes com Alfaro

et ai.

[22]. Curiosamente, verificou-se que o VEGF tratado DCs secretadas reduziu significativamente os níveis de IL-12p70 em resposta ao LPS; uma descoberta que não foi anteriormente documentada. O uso de LPS para amadurecer as DCs, em relação ao cocktail de maturação consiste em TNF, IFNa e poli I: C usado por Alfaro

et ai

pode explicar as diferenças observadas no efeito de VEGF na maturação DC e IL. secreção -12p70. A nossa constatação de que a estimulação de VEGF de DCs não afecta a proliferação de células T e secreção de citoquina é consistente com Alfaro

et ai.

, No entanto encontraram um efeito inibidor do VEGF, quando presentes na fase de diferenciação de desenvolvimento DC, indicando que DCs diferenciadas pode ser menos sensíveis aos efeitos do VEGF [22]. Nosso estudo também mostrou que os nossos pacientes com câncer colorretal explante secretado altos níveis de CCL2, CXCL1 e CXCL5, em comparação com VEGF. Curiosamente, os níveis de CCL2, CXCL1 e CXCL5 em TCM correlacionada com a expressão CD83 no TCM tratada DCs. Esta é a primeira vez que foi observada esta correlação, e sugere que os doentes com níveis mais elevados de CCL2, CXCL1 ou CXCL5 pode ter aumentado os níveis de CD83 em DCs. CD83 é muito importante para células T ingênuo e activação de células B [28], [29], no entanto, também descobriram que a expressão aumentada de CD83 em DCs tratadas com TCM correlacionada com reduzida IL-12p70 secreção TCM tratada DCs. Foi anteriormente relatado que, enquanto diferentes estímulos pode amadurecer DCs para níveis semelhantes, com expressão semelhante de CD83, CD80 e CD86, o perfil de citocinas que segregam diferentes; estímulos, tais como IFN-γ pode resultar em IL-12, secretoras de CD83 + DCs que estimulam respostas de Th1, enquanto outros estímulos, como resultado da prostaglandina E2 em CD83 + DCs que secretam sem IL-12, mas eficientemente promover uma resposta Th2 [30].

Embora tenha sido relatado que CCL2, CXCL1 e CXCL5 são importantes para o crescimento do tumor, proliferação e angiogenese [31], [32], o efeito destas quimiocinas em DC não foi anteriormente documentada. CCL2, níveis CXCL1 e CXCL5 em TCM correlacionada inversamente com a IL-12p70 secreção, esta é a primeira vez que foi observada esta correlação, e sugere que com níveis crescentes de CCL2, CXCL1 e CXCL5 no TCM, IL-12p70 secreção de DCS é reduzido. CCL2 é um quimioatraente para monócitos, células T de memória e células dendríticas [26], [31]. CCL2 tem também sido previamente relatado para induzir a angiogénese [17], o que é importante para o crescimento de tumores e metástases. Ambos os efeitos pro- e anti-tumorais de CCL2 foram observados através do seu efeito sobre monócitos e macrófagos [31], enquanto que aqui mostram que CCL2 também pode influenciar a resposta imune anti-tumor, afectando a capacidade de DC a secretar IL-12p70 mas não de outras citoquinas incluindo IL-10, IL-1β, IL-6, IL-8 ou TNF-α em resposta à estimulação com LPS. Em contraste, a Braun

et ai.

Têm mostrado previamente que CCL2 pode inibir a produção de IL-12p70 de monócitos e esta é a toxina pertussis sensível, mas não se observou esta redução na secreção de IL-12p70 de células dendriticas tratadas com quer SAC + IFN-y ou CD40L + IFN-y [33]. Alternativamente, Omata

et ai., Achou DCs diferenciadas a partir de monócitos na presença de CCL2 tinha uma capacidade reduzida para secretar IL-12p70 após a estimulação com o ligando de CD40, um efeito não é sensível à toxina da tosse convulsa. Estes autores relataram nenhum efeito de CCL2 na diferenciação ou maturação das DCs. [34]. Portanto, o mecanismo exacto pelo qual a CCL2 exerce o seu efeito em DCs continua a ser completamente elucidados.

Enquanto o efeito do CXCL1 CXCL5 e na maturação DC e a secreção de citocinas não foi anteriormente investigados, a sua função conhecida é o de atrair e activar os neutrófilos [14], [15], que por sua vez têm sido implicados com crescimento de células de tumor, angiogénese e metástase [35]. Uma vez que as DCs expressam CXCR2 [19], que é o receptor para CXCL1 e CXCL5, não é surpreendente que CXCL1 CXCL5 e pode ter um efeito sobre a função DC. Quimiocinas, tais como CCL2, CXCL1 CXCL5 e sinalizar através de receptores acoplados à proteína G, que controlam os níveis de AMPc intracelular e um aumento dos níveis de cAMP correlaciona-se com a diminuição da produção de IL-12 [36]. No entanto, o mecanismo pelo qual estas quimiocinas reduzir a secreção de IL-12p70 de DCs não é conhecida, e será sujeito das nossas futuras investigações.

Curiosamente CXCL1 e o VEGF tem um efeito inibitório aditivo na secreção de IL-12p70. Eles agem em receptores diferentes que foram mostrados anteriormente para estar presente em DC [7], [19], por conseguinte, eles podem activar diferentes vias de sinalização, simultaneamente, ou podem activar a mesma via de forma mais eficaz. O VEGF tem sido mostrado para melhorar a fosfo-ERK1 ERK2 em DCs e esta via negativamente regula monócitos derivados DC maturação [7], [37]. Quais as vias de sinalização são activados por CXCL1 através CXCR2 em células dendríticas é ainda desconhecido, no entanto estudos em diferentes tipos de células, tais como células cancerosas, mostram que a sinalização de CXCR2 podem activar o NF-kB, STAT3 e as ERK [38], [39] , [40]. Assim, há uma variedade de potenciais mecanismos pelos quais os ligandos de CXCR2 podem inibir a secreção de IL-12p70 por DCs. No entanto, esgotando imunes quer destas citocinas isolados ou em combinação com anticorpos neutralizantes não reverteu o efeito inibidor do TCM. Isto prova que é, provavelmente, vários fatores diferentes agindo em conjunto que causa inibição DC. Isto é consistente com pesquisas anteriores mostrando que o bloqueio de um único fator, VEGF no sobrenadante de células RCC-10 não teve um efeito significativo sobre a activação DC [22].

Observamos que CCL2, CXCL1, CXCL5 e VEGF não bloqueie DC maturação, nem afectam a migração DC ou proliferação de células-T. Ao contrário de DCs tratadas com TCM, os mediadores inflamatórios individuais não aumentar a IL-10 no entanto todos inibiu a secreção de IL-12p70 eles; um efeito não foi anteriormente demonstrado para CCL2, CXCL1, CXCL5 e VEGF. Os tecidos tumorais explante secretam muitos fatores solúveis diferentes, e não é muito surpreendente que alguns fatores isolados por conta própria não tem um efeito comparável ao TCM. É muito provável que os muitos factores diferentes segregada para o TCM pelo acto de tumor explante juntos em inibir a maturação e função de DC. No entanto, a capacidade de CCL2, CXCL1, CXCL5 e VEGF para reduzir significativamente a IL-12p70 produção em DCs é importante, pois isso pode potencialmente resultar em uma resposta Th1 reduzida anti-tumor

in vivo

.

Em conclusão, descobrimos que TCM inibe DC maturação, e induz IL-10, enquanto inibindo IL-12p70 secreções das DCs. O TCM componentes CCL2, CXCL1, CXCL5 VEGF e parecem desempenhar um papel na modulação da resposta inflamatória através da inibição da secreção de IL-12p70 por DCs, possivelmente para proteger o tumor a partir de uma resposta imunológica potente contra ela. Além disso, o VEGF CXCL1 e actuar em conjunto na inibição da secreção de IL-12p70 de DCs. Embora CCL2, CXCL1, CXCL5 e VEGF estão presentes no TCM em níveis elevados, que não são os principais componentes do MTC que afectam a maturação e função de DC. Em conclusão, demonstramos a importância da mídia tumor condicionado na regulação da função das células dendríticas em pacientes com câncer colorretal, no entanto os mecanismos subjacentes ainda precisam ser elucidados.

Materiais e Métodos

Ex tumor vivo cultura explante

Todo o tecido foi obtido com o consentimento informado por escrito do paciente, eo protocolo foi aprovado pelo Comitê do Hospital Universitário de St. Vincent de Ética.

tecido tumoral do câncer colorretal cirurgicamente ressecado ( n = 21) e o tecido normal ( 10 centímetros a partir do tumor; n = 5) foi obtido a partir de pacientes do Centro de explante bio-banco de doença colorrectal no Hospital da Universidade de St. Vincent, Dublin (12 do sexo masculino, 9 fêmea, mediana idade 67, 1 Fase II, 5 Stage III, 15 de Stage IV câncer colorretal). O tecido explantado foi cortada em pelo menos 4 partes iguais de tamanho de aproximadamente 5 mm

3 e cultivadas como anteriormente descrito [20]. Resumidamente, os tecidos de tumor explantadas foram cultivadas durante 72 h (em placas de 24 poços) em 2 ml de RPMI 1640 contendo 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, 4? G /mL de Fungizona, 30 ug /gentamicina mL (Invitrogen; Carlsbad , Califórnia) e suplementado com 20% de soro fetal de bovino (Invitrogen). Após 72 horas em cultura, meio condicionado do tumor (TCM) e meios condicionados normais (NCM) foi recolhido e armazenado a -20 ° C até ser usado para análises.

isolamento de células dendríticas e cultura

As células humanas imaturas derivadas de monócitos dendríticas (iDCs) foram geradas a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) obtidas a partir de preparações de camada leuco-plaquetária (Centro Nacional de sangue, Hospital St. James, Dublin). Os monócitos foram isolados por selecção positiva utilizando pérolas CD14-magnética (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) e semeadas a uma densidade de 1 × 10

6 células /ml em placas de 6 poços em 3 ml de meio RPMI 1640 contendo 100 U /mL de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, 4? g /mL de Fungizone e suplementado com 10% definido Hyclone de soro fetal de bovino (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos humanos (GM-CSF; 50 ng /mL, Immunotools, Friesoythe, Alemanha), e IL-4 humana (70 ng /mL; Immunotools). As células foram alimentadas de três dias, substituindo metade do meio e adição de citoquinas frescas. No dia 6, as células exibiram um fenótipo DC imaturo (CD14

-, CD11c

+, CD86

-, CD54

baixo, CD83

-, CD80

– e HLA DR

baixo).

a estimulação dos monócitos derivados DC

recentemente isolado iDC foram semeadas em triplicado em placas de 96 poços a 1 × 10

5 células /200 mL em RPMI 1640 um meio suplementado com 10% definido Hyclone FBS (Thermo Fisher Scientific), e foram estimuladas com 1 em 2, 1 em 4 e 1 em 10 de diluição de tumor meio condicionado (TCM) a partir de 4 tecidos de explantes em cultura durante 4 horas antes da adição de 1 ug /mL

Escherichia coli

lipopolissacarídeo (LPS; Alexis Biochemicals, Lausen, Suíça) para determinar a melhor dose de TCM. Subsequentemente, as DCs foram tratados com um TCM 1 em diluição de duas todos os 21 tecidos de explantes de doentes durante 4 horas antes da adição de 1 ug /mL de LPS. Além disso, as DCs foram tratadas com uma diluição de 1 para 2 de NCM de 5 tecidos de explantes de doentes durante 4 horas antes de 1 ug /ml de LPS foi adicionado. Em experiências separadas 1 × 10

5 IDC /200 meios ul foram tratados com recombinante humano 50 ng /ml CCL2 (MCP-1), 100 ng /mL CXCL1 (GROa), 100 ng /mL CXCL5 (ENA-78)