Abstract
Purpose
metástases cerebrais (BM) de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é relativamente comum, mas identificar quais pacientes irão desenvolver metástases cerebrais tem sido problemática. Nossa hipótese é que variantes genotípicas na via de sinalização TGF-β pode ser um biomarcador preditivo de metástases cerebrais.
Pacientes e Métodos
Foram genotipados 33 SNPs a partir de 13 genes na via de sinalização TGF-β e avaliadas as suas associações com risco de metástases cerebrais usando DNA a partir de amostras de sangue de 161 pacientes com NSCLC. A análise de Kaplan-Meier foi utilizado para avaliar o risco de metástase cerebral; análises de risco de Cox foram utilizados para avaliar os efeitos de várias características do paciente e da doença sobre o risco de metástases cerebrais.
Resultados
A idade média dos 116 homens e 45 mulheres no estudo foi de 58 anos; 62 (39%) tinha estágio IIIB ou IV da doença. Dentro de 24 meses após o diagnóstico inicial de câncer de pulmão, metástase cerebral foi encontrada em 60 pacientes (37%). Destes 60 pacientes, 16 apresentaram com a BM no momento do diagnóstico. A análise multivariada mostrou o genótipo GG do
SMAD6
: genótipo rs12913975 e TT da
INHBC
: rs4760259 para ser associado com um risco significativamente maior de metástases cerebrais em 24 meses de acompanhamento (hazard ratio [ ,,,0],HR] 2.540, 95% intervalo de confiança [IC] de 1,204-5,359,
P
= 0,014; e HR 1.885, IC 95% 1,086-3,273,
P
= 0,024), em comparação com o GA ou CT /CC genótipos, respectivamente. Quando analisamos subgrupos combinados, esses índices apresentaram maior para aqueles que têm tanto o genótipo GG do
SMAD6
: rs12913975 eo genótipo TT de
INHBC
: rs4760259 (HR 2.353, 95% CI 1.390- 3.985,
P
= 0,001)
Conclusões
Nós encontramos o genótipo GG do
SMAD6
:. rs12913975 e genótipo TT de
INHBC
: rs4760259 a ser associada com o risco de metástases cerebrais em doentes com NSCLC. Esta descoberta, se confirmada, pode ajudar a identificar pacientes com alto risco de metástase cerebral
Citation:. Li Q, Wu H, Chen B, Hu G, Huang L, Qin K, et al. (2012) SNPs do TGF-β via de sinalização estão associados com risco aumentado de metástases cerebrais em pacientes com não-pequenas células do cancro do pulmão. PLoS ONE 7 (12): e51713. doi: 10.1371 /journal.pone.0051713
editor: Todd W. Miller, Dartmouth, Estados Unidos da América
Recebido: 13 Agosto, 2012; Aceito: 05 de novembro de 2012; Publicação: 17 de dezembro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi financiado pelo National Natural Science Foundation (concessão 81.071.832), um projeto-chave de concessão Hubei Provincial Escritório de Saúde (JX5A01), e um projeto de Wuhan Planejamento da Ciência e Tecnologia concessão (201.161.038.339-07). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Mais de 150.000 pacientes com câncer são diagnosticados com metástases cerebrais a cada ano [1], com o pulmão é o sítio primário mais comum para a BM secundário [2], [3]. técnicas de RT melhoradas e aumento do uso de terapia de modalidade combinada reduziram metástases distantes e melhorou significativamente a sobrevida. No entanto, tem mostrado estar associado com o aumento das taxas de falha total do cérebro [4]. O resultado do diagnóstico de metástases cerebrais é sombrio. Mesmo para pacientes jovens com bom estado geral e doenças extra-craniana controlado, o tempo médio de sobrevivência para os pacientes após o desenvolvimento da BM é apenas cerca de sete meses [5]. Meios de prevenir o desenvolvimento da BM são, portanto, urgentemente procurado. Por exemplo, a irradiação craniana profilática (PCI) tem um papel bem definido no tratamento de pacientes de alto risco com leucemia linfocítica aguda e os pacientes com cancro do pulmão de células pequenas (SCLC) [6]. Estes são tumores radiossensíveis onde doses moderadas de radiação podem ser empregues e resultar em melhorias significativas no controle intracraniana em adição a sobrevivência global, e, por conseguinte, é considerado PCI padrão de cuidado. Talvez os pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), bem. , ensaios anteriores randomizados controlados e vários estudos prospectivos sem cérebro pontos finais primários e estudos retrospectivos avaliando PCI para NSCLC têm mostrado consistentemente um decréscimo e /ou atraso na BM com PCI [4], [7], [8], [9]. Mas PCI não se tornou parte da administração padrão para LA-NSCLC por causa da preocupação com a toxicidade a longo prazo ea falta de um benefício de sobrevivência comprovado. Não está claro se este é secundária à insuficiência de identificar a coorte mais adequado para a prevenção. Os autores deste trabalho a hipótese de que entre os pacientes com NSCLC de fase I-IV pode existir um grupo de pacientes com alto risco de apresentar BM. Este grupo deve ser identificado, a fim de servir como alvo para futuros estudos de aplicação PCI em NSCLC e evitar efeitos colaterais para aqueles que com baixo risco de apresentar BM.
A definição do grupo de pacientes de alto risco é difícil, porque é dependente de relatórios que muitas vezes têm resultados conflitantes. fatores de pré-tratamento que predizem por altas taxas de BM incluem histologia, extensão da doença e idade jovem. No entanto, nem todos os estudos têm mostrado uma correlação significativa [10], [11], [12]. Os níveis de três genes de expressão,
CDH2
(N-caderina),
KIFC1
, e
FALZ
, foi encontrado em um estudo a ser altamente preditivos da BM no início e câncer de pulmão avançado [13]. Os níveis de expressão dos genes pode ser efeito por outros fatores e não tão preciso, que limita seriamente esta abordagem para predição de risco. Raramente estudar abordar a questão sobre a associação entre polimorfismos e insuficiência cerebral. Além disso, a heterogeneidade genética e complexidade do NSCLC tornam improvável que um único SNP seria suficiente para conferir o risco da BM. Em vez disso, estudar vários SNPs nas vias de sinalização que regulam a proliferação e migração celular pode ser uma maneira mais poderosa de identificar os genes e polimorfismos envolvidos em conferir risco de BM. Uma tal via é a do factor de crescimento transformante-β (TGF-β).
O TGF-β compreende superfamília TGF-p, proteínas morfogenéticas ósseas, activinas, e proteínas relacionadas. vias de sinalização de TGF-β ter diversos efeitos sobre a proliferação celular, a morfogénese, a migração, a produção da matriz extracelular, e a apoptose. Em particular, o TGF-β suprime o desenvolvimento de tumores em estádio inicial em virtude da sua potente efeito inibidor do crescimento, mas torna-se um factor pró-oncogénica que estimula o crescimento de células tumorais e invasão em fases posteriores da tumorigénese [14], [15]. As células tumorais podem escapar dos efeitos antiproliferativos de TGF-β através da aquisição de mutações no componentes de vias de sinalização ou interrompendo selectivamente a sinalização de TGF-β. A transição epitelial-a-mesenquimal (EMT) está associado com a aquisição da motilidade celular e invasivos propriedades que promovem a formação de metástases distantes [16]. Uma variedade de outros mecanismos, incluindo as alterações na expressão de moléculas de adesão célula-célula e a secreção de metaloproteinases, também contribuem para o processo metastático [17].
Dado o importante papel da via de TGF-β na manutenção celular função e o efeito de sua interrupção em metástases à distância, as variações genéticas comuns nesta via pode surgir como potenciais preditores de risco BM. Neste estudo, testou-se a hipótese de que as variantes genéticas comuns na via de TGF-β estão associados com risco BM, e uma tentativa para identificar subgrupos de doentes com NSCLC, que estão em risco particularmente elevado de desenvolver BM.
pacientes e métodos
População de pacientes
sujeitos deste estudo foram selecionados de um total de 201 doentes com cancro do pulmão que tinham sido tratados, quer ao Tongji Hospital cancer Center ou o Tumor Hubei Provincial Hospital, em 2008-2009, que também tiveram amostras de sangue disponíveis para análise. Todos os participantes do estudo forneceram consentimento informado antes de amostras de sangue foram coletadas. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Tongji Medical College de Ética. Destes 201 pacientes, 190 tinham a documentação ter sido submetido a estadiamento da doença completo, e 161 tinham confirmado patologicamente NSCLC. Estes 161 pacientes foram a base desta análise. Os dados clínicos foram obtidos a partir de arquivos dos pacientes. Doença tinha sido encenada em termos do sistema de tumor /node /metástase no sexto (2002) edição do American Joint Committee on manual de estadiamento do câncer. O diagnóstico da BM foi baseada em tomografia computadorizada ou registros de ressonância magnética. O tabagismo inclui atual, anterior, ou nunca fumante. Ex-fumantes foram definidos como indivíduos que tinham deixado de fumar por pelo menos 1 ano no momento da inscrição estudo. Nunca fumantes foram definidos como indivíduos que tiveram 20 cigarros no total durante a sua vida [18]. O tempo para BM foi o intervalo a partir da data do diagnóstico de NSCLC à data de diagnóstico BM. O tempo de seguimento foi o intervalo entre o diagnóstico NSCLC à morte ou à última visita hospital.
métodos de genotipagem
Os procedimentos utilizados para seleccionar SNPs na via de TGF-β foram descritos anteriormente [19]. Resumidamente, foram utilizados bancos de dados Gene Oncologia (https://www.geneontology.org) e do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) da base de dados Gene (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) e literatura relacionada para identificar todos os polimorfismos funcionais individuais (SNPs) dos genes de TGF-β vias de sinalização com uma frequência do alelo menor superior a 0,05 na população chinesa. Foram selecionados 33 SNPs em 13 genes relacionados com as vias de TGF-β que ou foram localizados no promotor da região não traduzida ou na região do gene que codifica ou tinham sido previamente relatados como estando associados com a sobrevivência, o cancro do pulmão, ou metástase geral (Tabela 1). O ADN genómico foi isolado a partir de linfócitos de sangue periférico usando o DNA QuickGene sangue total kit de S (Fuji Film) e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Trinta e dois dos SNPs foram genotipados utilizando MALDI-TOF espectrofotometria de massa para detectar os produtos de extensão de iniciadores específicos de alelo com a plataforma MassARRAY (Sequenom, Inc.). Os dados do ensaio foram analisados usando o software TYPER Sequenom (versão 4.0). O limiar de taxa de chamada individual foi de pelo menos 95%. A 33
rd SNP (
TGFB1:
rs1800470) foi genotipados utilizando o ensaio TaqMan [20]
Análise Estatística
Esta análise foi realizada. após todos os pacientes tinham sido potencialmente observada durante um período mínimo de 24 meses. Os pacientes foram agrupados de acordo com o genótipo. A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS (versão 16.0). Cox modelo de riscos proporcionais foi usado para calcular taxa de risco (HR) e intervalos de confiança de 95% (IC) para a sobrevivência análises multivariadas, enquanto o ajuste para sexo, idade, estágio da doença, histologia do tumor, índice de Karnofsky (KPS), e tabagismo. Gráficos de Kaplan-Meier e testes de log rank foram utilizados para estimar o efeito do genótipo sobre o risco BM. testes da razão de verossimilhança foram utilizados para cada regressão multivariada de Cox para avaliar o bem-of-fit. A
P valor
de ≤0.05 foi considerado para indicar significância estatística na frente e verso
t
testes.
Resultados
características do paciente
Características dos 161 pacientes (116 homens e 45 mulheres) são apresentados na Tabela 2. A idade média foi de 58 anos (variação de 32 a 80 anos); 61% tinham doença em estágio ≤IIIA; 60% tinham adenocarcinoma, e 54% tinham fumado tabaco (71,6% no sexo masculino e 8,9% no sexo feminino).
metástases cerebrais e genótipos
O tempo médio desde o diagnóstico NSCLC à detecção da BM foi de 7,5 meses (intervalo de 0 a 23 meses). O tempo mediano foi de 10 meses quando os pacientes que apresentavam BM foram excluídos. As associações entre-paciente e as características relacionadas com o tumor e BM por análises uni e multivariada são apresentados na Tabela 2. Como esperado, o estágio da doença foi associada com a BM, com pacientes com estágio IIIB ou doença em estágio IV em maior risco de BM (
P Art 0,010). E pacientes com adenocarcinoma foram associados com maior risco de BM de análises de risco de Cox (
P
= 0,032). No entanto, o tabagismo não tem nenhuma associação com o risco BM nesta população.
Figura 1 ilustram as taxas de sobrevivência BM-livres cumulativos para todos os pacientes de acordo com o genótipo. Estas taxas permaneceram mais baixos para aqueles com qualquer genótipo GG do
SMAD6
: rs12913975 (
P
= 0,024, Figura 1A) ou o genótipo TT de
INHBC
: rs4760259 (
P
= 0,045, Figura 1B). Quando analisamos subgrupos combinados, esses índices apresentaram menor para aqueles que têm tanto o genótipo GG do
SMAD6
: rs12913975 eo genótipo TT de
INHBC
: rs4760259 (
P
= 0,003, Figura 1C). Outros 31 SNPs na via de TGF-β na Tabela 1 também foram analisados, mas nenhuma correlação significativa foi encontrada (
P
= 0,877, Figura 1D para
TGFB1
: rs4803455; data de outros 30 SNPs seleccionados não mostrado).
Os pacientes foram estratificados pelos genótipos. (A)
SMAD6
: rs12913975; (B)
INHBC
: rs4760259; (C) combinada; (D)
TGFB1
: rs4803455. O genótipo GG para rs12913975 eo genótipo TT para rs4760259 foram associados com significativamente menor do cérebro cumulativo sobrevida livre de metástases em comparação com os outros genótipos.
Tabela 3 e 4 lista os resultados de Kaplan-Meier análises de incidência BM acordo com o genótipo aos 24 meses de diagnóstico. Em geral, a BM desenvolveu mais frequentemente em pacientes com o genótipo GG do
SMAD6
: rs12913975 (43%) ou o genótipo TT de
INHBC
: rs4760259 (44%) em comparação com a GA ( 21%) ou genótipos /CC CT (27%). Estas associações entre o genótipo eo BM foram estatisticamente significantes para ambos os subgrupos. Quando analisamos subgrupos combinados, podemos ver com ambas GG (rs12913975) e TT (rs4760259) mostram uma maior probabilidade de BM (52% vs 28%,
P
= 0,003, Tabela 4). Na análise multivariada Cox de risco proporcional mostrou o genótipo GG do
SMAD6
: genótipo rs12913975 e TT da
INHBC
: rs4760259 para ser associado com um risco significativamente maior de metástase cerebral (HR 2.540, IC 95% 1,204-5,359,
P
= 0,014; e HR 1.885, IC 95% 1,086-3,273,
P
= 0,024, respectivamente), após o ajuste para estágio, histologia, idade e tabagismo . Ao analisar subgrupos combinados, esses índices apresentaram maior para aqueles que têm tanto o genótipo GG do
SMAD6
: rs12913975 eo genótipo TT de
INHBC
: rs4760259 (HR 2.353, 95% 1,390-3,985 CI ,
P
= 0,001). Além disso, quando repetiu a análise de exclusão dos pacientes que apresentaram com a BM no diagnóstico de NSCLC, a associação entre BM e dois genótipos permaneceu significativa (Tabela 3 e 4). Análises semelhantes de outros 31 SNPs selecionados não apresentaram associações entre qualquer outro genótipo e da incidência da BM (Tabela 5 e 6).
Discussão
neste estudo, nós sistematicamente avaliados associações entre um amplo painel de variantes genéticas em TGF-β de sinalização genes da via e risco BM. Descobrimos que SNPs em
SMAD6
: GG rs12913975 ou
INHBC
: rs4760259 TT foram associados com a incidência de BM. Para o melhor de nosso conhecimento, esta é a primeira evidência mostrando essa associação em pacientes com câncer de pulmão. Com a validação, este teste pode ser utilizado como um biomarcador preditivo para identificar pacientes em alto risco de desenvolver metástases cerebrais durante os primeiros 24 meses após o diagnóstico.
Um dos polimorfismos que encontramos a ser associada com o risco BM foi em
SMAD6
, que codifica uma proteína que se localiza ambos os núcleos e citoplasma. Smad6 Smad7 e actuam como Smads “inibidoras”, que inibem a família de TGF-β sinalização [21]. A indução da expressão de Smad7 Smad6 e pela proteína morfogénica do osso e sinalização de TGF-β representa um mecanismo de retroacção auto-inibidora na via de TGF-β [21].
SMAD6
é expressa na maioria dos tecidos humanos, incluindo o pulmão, mas a sua função na tumorigênese ainda não está estabelecida. Um estudo retrospectivo anterior mostrou que
SMAD7
superexpressão está ligada a uma menor incidência de metástases ósseas de melanoma e câncer de mama [22]. A semelhança estrutural entre as proteínas e SMAD6 Smad7 sugere que ambas as proteínas podem ser envolvidos em metástase por meio de mecanismos semelhantes. Variantes em
SMAD6
têm sido associados com o prognóstico no câncer de ovário [23], câncer de mama e carcinoma de pâncreas; polimorfismo no
SMAD6
também têm sido associadas com a sobrevivência em NSCLC [24]. Metástases, especialmente metástases cerebrais, é um importante fator associado com mau prognóstico, e SNPs em
SMAD6
podem contribuir para metástases, incluem metástases no SNC.
Também descobrimos
INHBC
: polimorfismos rs4760259 a ser associada com o risco de BM. O
gene INHBC
está localizado no cromossoma humano 12, região q13.1, e codifica uma proteína denominada βC, pertencente ao subgrupo inibina. proteínas inibina e activina, juntamente com vários de crescimento e factores de diferenciação, inibir Muellerian substância, e outras proteínas, pertencem à superfamilia de TGF-β. Ativinas tem muitos efeitos sobre a formação de mesoderme [25], a proliferação celular e a apoptose [26], a ramificação morfogénese [27], inflamação [28] e reprodução [29]. Uma α-subunidade e quatro isoformas subunidade p (pA, βB, βCand βE) foram encontrados em mamíferos e humanos [30]. O α activina, subunidades pA, e βB e seus homo- /heterodímeros foram bem caracterizadas; activina A (βAβA), por exemplo, é uma proteína pleiotrópica que afecta a apoptose, o controlo do ciclo celular, angiogénese e imunossupressão [31]. O papel exacto da subunidade βC, no entanto, não é claro. Activina βC subunidade ARNm foi detectada no rato e no pulmão do rato, epididimo, testículos, útero, baço, pituitária posterior, e glândula supra-renal, e em células de ovário humano, testículos, placenta, próstata e [31]. A activina βC subunidade ou seus dímeros podem opor-se à acção de Activina A. Em um estudo in vitro, a subunidade βC activina tem um efeito pró-apoptótico em linhas de células de fígado. Além disso, a subunidade βC activina foi regulada negativamente em linhas celulares prostáticas tumorais e fígado [32]. A transfecção da subunidade βC activina para a linha de células de cancro da próstata PC3 resulta em níveis diminuídos Activina A [33]. Um estudo recente mostrou polimorfismos em
INHBC
está associada a risco de cancro do ovário [34]. Outro estudo mostrou que ele seja fortemente associada com a sobrevivência em NSCLC [24]. Pode ser visto que a Activina subunidade βC é associado com tumorigênese e progresso, e as metástases é um passo importante na progressão do tumor, que fortemente associada com mau prognóstico, portanto, podemos acreditar SNPs em
INHBC
pode Contribuiç à BM.
um único SNP muitas vezes proporciona um efeito modesto ou indetectável que os efeitos amplificados de SNPs combinados na mesma via pode aumentar o poder preditivo. Analisou-se a associação com a BM em pacientes com ambos os dois genótipos. Uma tendência clara e significativa foi evidente para o maior risco com os subgrupos combinados. Estes resultados sugerem uma influência cumulativa por múltiplas variantes genéticas dentro da via de sinalização de TGF-β foram capazes de aumentar ainda mais a capacidade de previsão.
No entanto, nenhum dos SNPs foram identificados como estando ligadas com BM está localizado na região de codificação , que sugerem que esses SNPs não pode afetar
SMAD6
ou
INHBC
função diretamente, mas sim podem alterar os níveis de expressão do gene através de estar localizado em regiões reguladoras ou através de ligação a outros SNPs que afetam a atividade do gene . Além disso, in vitro e in vivo são necessários estudos funcionais para confirmar o significado funcional da identificadas
SMAD6
e
INHBC
SNPs.
Além disso, descobrimos que 48% dos pacientes com ambos os alelos de alto risco não têm metástases cerebrais (Tabela 4), e 1,7% (1/60) dos pacientes com metástases cerebrais não carregam um dos dois genótipos de alto risco. Como a heterogeneidade e de complexidade genética NSCLC, especula-se que alguns outros factores e os SNPs em outras vias de sinalização que regulam a proliferação e migração celular pode também ser associado com o risco da BM. Futuras pesquisas são necessárias para aumentar ainda mais a capacidade de previsão.
PCI é considerado parte da terapia padrão para CPPC em estágio limitado, uma vez que até 80% desses pacientes desenvolvem BM [35], [36]. SLotman et ai. conduziram um estudo de 286 pacientes com SCLC extensa estágios que foram randomizados para receber ou PCI ou nenhuma PCI. A sobrevivência em 1 ano melhorou 13,3-27,1% [6]. Neste momento, quase todos os pacientes com SCLC deve ser oferecido PCI para reduzir a chance de BM e melhorar a sobrevida global. Actualmente, a intensidade do tratamento profilático para a leucemia linfoblástica aguda é ajustado para o risco de recidiva do sistema nervoso central (SNC) [37]. Anteriores randomizados e controlados [7], [8], [9] e foram publicados vários estudos prospectivos avaliando PCI para NSCLC. Estudos mostram significativamente que PCI administrado a doentes melhora o controle da doença intracraniana. No entanto, nenhum desses estudos já mostraram um benefício de sobrevivência com a aplicação de PCI. O julgamento RTOG mais recente (0214) avaliando o papel do PCI em LA-NSCLC infelizmente fechado mais cedo devido à má competência. Embora tenha havido uma diminuição resultados promissores em metástases intracraniana no grupo de tratamento, esta falha para resultar num benefício de sobrevivência [4]. Joseph A et al. análises, é claro se este é secundária à insuficiência de identificar a coorte mais adequado para a prevenção, a incapacidade de radiação para efetuar a prevenção de doenças intracraniana suficiente por causa de um tumor relativamente radio-resistentes, ou a necessidade de terapias sistémicas mais eficazes para controlar doença extracraniana para que a sobrevida dos pacientes é tempo suficiente para ver o benefício do PCI [1]. Uma vez que não existe um teste preditivo para identificar pacientes com alto risco de metástase cerebral, PCI tem sido dada unselectively para todos os pacientes. PCI poderia afetar negativamente a função neurocognitiva e qualidade de vida naqueles pacientes que não precisam PCI [4]. Se as descobertas do estudo são validados em um estudo com poder estatístico adequado prospectivamente, poderíamos usar os SNPs identificados neste estudo como um teste de pré-tratamento para selecionar pacientes que se beneficiariam com PCI, evitando PCI em pacientes que não precisam dele.
Nosso estudo teve algumas limitações. O pequeno número de pacientes aumenta a possibilidade de que alguns dos nossos resultados foram devidos ao acaso. Futuros estudos são necessários para significado funcional identidade das variantes genéticas que identificamos, assim como para confirmar ou externamente avaliar as associações em populações independentes.
Conclusões
Nós descobrimos que o genótipo GG de
SMAD6
: rs12913975 eo genótipo TT de
INHBC
: rs4760259 foram associados com a incidência da BM em pacientes com NSCLC. Estes resultados foram confirmados em ambos Kaplan-Meier e multivariada Cox análises de risco proporcional, este último ajustado para o estágio da doença, histologia do tumor, idade e tabagismo do paciente. Estes resultados podem ser úteis nos esforços futuros para identificar pacientes com alto risco de metástases cerebrais.