Abstract

Fundo

neurite pâncreas é uma característica histopatológica da neuropatia pancreático e se correlaciona com abdominal sensação de dor neuropática em adenocarcinoma do pâncreas (PCA) e pancreatite crônica (CP). No entanto, os subtipos de células inflamatórias que compõem neurite pâncreas e sua correlação com a síndrome de dor neuropática em APC e CP são ainda desconhecidas.

Métodos

As células inflamatórias em lesões neurite pancreáticas de pacientes com PCA (n = 20) e PB (n = 20) foram immunolabeled e colorimetricamente quantificada com o marcador CD45 pan-leucócitos, com CD68 (macrófagos), CD8 (linfócitos T citotóxicos), CD4 (linfócitos T auxiliares), CD20 (B-linfócitos ), NCL-PC (células plasmáticas), elastase de neutrófilos, PRG2 (eosinófilos), célula anti-mastro triptase (MC) e correlacionados com a sensação de dor. subtipos de mastócitos perineurais foram analisados ​​por imunomarcação dupla com MC quimase. Expressão e imuno neural ativado por protease do receptor de tipo 1 (PAR-1) e tipo 2 (PAR-2) foram analisados ​​em APC e CP e correlacionada com estado de dor dos pacientes.

Resultados

Em APC e CP, os nervos foram predominantemente infiltrado por linfócitos T citotóxicos (PCA: 35% de todas as células inflamatórias perineurais, CP: 33%), macrófagos (PCA: 39%, CP: 33%) e MC (PCA: 21%, CP: 27%). Em ambas as entidades, a sensação de dor neuropática foi associada a um aumento específico de perineural MC (PCA sem dor: 14% vs. APC com a dor: 31%; CP sem dor: 19% vs. CP com a dor: 34%), não afetando a frequência de outros subtipos de células inflamatórias. A grande maioria destes MC continha MC quimase. PAR-1 e expressão PAR-2 ​​não se correlacionou com a sensação de dor dos pacientes APC e CP.

Conclusão

neurite pâncreas no PC e CP é composto por linfócitos T citotóxicos, macrófagos e MC. O enriquecimento específico de MC em torno dos nervos intrapancreáticos na dor neuropática devido a APC e CP sugere a presença de hipersensibilidade visceral induzida por MC no pâncreas. Portanto, neuropatias pancreáticas e entéricas parecem partilhar um tipo similar de interação neuro-imune na geração de dor visceral

Citation:. Demir IE, Schorn S, Schremmer-Danninger E, Wang K, Kehl T, Giese NA, et ai. (2013) Células Perineural mastro são especificamente enriquecido no pâncreas neurite e dor neuropática no cancro do pâncreas e pancreatite crônica. PLoS ONE 8 (3): e60529. doi: 10.1371 /journal.pone.0060529

editor: Anthony WI. Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 15 de dezembro de 2012; Aceito: 27 de fevereiro de 2013; Publicação: 28 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Demir et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a inflamação e câncer estão interligados na geração, é claro e os resultados das neoplasias humanas. Um subtipo específico e único da inflamação relacionada ao câncer é encontrado em torno dos nervos em tumores pancreáticos, especialmente no câncer de pâncreas (PCA) e no tumor cabeça do pâncreas inflamatória associada a pancreatite crônica (CP). De facto, ambos estes tumores contêm frequentemente aglomerados de células inflamatórias focais ao redor de nervos intrapancreática [1], [2]. Em seu estudo seminal elétron-microscópica de nervos na CP, Dale Bockman informou sobre a presença de danos severos em tais nervos que foram especificamente infiltrada por células inflamatórias [3]. Estudos posteriores feitos a contribuição decidir relacionada com a importância dessa infiltração de células imunes neural alvo denominado

pancreático neurite

em pacientes APC e CP: aumento da frequência e gravidade de neurites pancreático foram mostrados para suportar uma grande correlação com a gravidade da sensação de dor abdominal e alterações de neuroplasticidade em APC e pacientes com PC [1], [4], [5].

Mecanismos de neurite pâncreas continuam a ser elucidado. Em relação aos mediadores inflamatórios envolvidos em neurite pancreático, interleucina-8 (IL-8), o fractalcina quimiocina neuronal e seu receptor CX3CR1 foram mostrados para ser sobre-expresso em nervos em tecidos CP, e aumento da presença fractalcina endoneural foi detectada a correlacionar-se com a gravidade de neurite pâncreas, tecido infiltração de macrófagos e sensação de dor [6] – [8].

os subtipos exatos e características das células do sistema imunológico que se infiltram nervos pancreáticos ainda são desconhecidas. No único estudo relacionado a esta pergunta, Keith et al. demonstrada de forma semi-quantitativa o aumento da presença de eosinófilos em torno dos nervos em CP ea associação entre a sensação de dor e a extensão da infiltração eosinofílica perineural [9].

Uma melhor compreensão das características do infiltrado celular inflamatório perineural em APC e CP é susceptível de permitir um profundo conhecimento sobre os mecanismos de neurite pancreático. Portanto, no presente estudo, que visa proporcionar uma caracterização quantitativa sistemática de grupos de células inflamatórias associadas a neurite pancreáticas em APC e CP. Para este efeito, quantificamos leucócitos peri e endoneurais no pâncreas humano normal (NP), APC e CP. Além disso, investigou-se a distribuição quantitativa de um grande painel de marcadores de leucócitos subconjunto em APC e tecido CP, incluindo CD68 (macrófagos), CD8 (linfócitos T citotóxicos), CD4 (linfócitos T auxiliares), CD20 (linfócitos B), NCL-PC (células plasmáticas), elastase de neutrófilos, proteogylcan 2 /PRG2 (eosinófilos) e celular anti-mastro triptase (MC) e quimase nos agrupamentos inflamatórios neurais. Finalmente, correlacionou a quantidade desses subconjuntos de células inflamatórias neurais, ea expressão de dois receptores potenciais (protease-ativados por receptores /PAR-1 e PAR-2) para proteases MC-derivados para a sensação de dor neuropática do CaP e pacientes com PC .

Materiais e Métodos

Ética declaração

o estudo foi aprovado pelos comitês de ética da Technische Universität München, Munique, Alemanha e da Universidade de Heidelberg, Alemanha.

pacientes e tecidos

amostras de tecido pancreático para imuno-histoquímica foram coletadas de pacientes após ressecção da cabeça do pâncreas para câncer de pâncreas (PCA, n = 20; masculino /feminino = 8/12, idade mediana = 66 anos ) e pancreatite crônica (CP, n = 20; masculino /feminino = 13/7, idade média = 51 anos). Todos os pacientes foram informados e consentimento escrito foi obtido para a recolha de tecidos. De acordo com a classificação internacional da UICC (2009), todos os pacientes tiveram fase IIb câncer pancreático. A etiologia da CP foi alcoólica em todos os pacientes. Devido à frequentemente observado processo inflamatório concomitante nas margens de ressecção de amostras de tecido pancreático, amostras de tecido pancreático normais foram obtidos de doadores de órgãos saudáveis ​​(NP, n = 10; masculino /feminino = 6/4, idade média = 38 anos) sempre que havia nenhum receptor adequado para o transplante disponíveis. A coleta de tecido foi aprovado pelos comitês de ética da Technische Universität München, Munique e Universidade de Heidelberg, Alemanha. As amostras de tecido pancreático ressecados foram divididos em partes que foram imediatamente fixados em paraformaldeído a 4% seguido de parafina-incorporação, conforme descrito anteriormente [1], [10].

A dor abdominal

Em todos pacientes APC e CP, o estado de dor individual (dor vs. no Pain) eo escore de dor individual (intensidade da dor e frequência) foram prospectivamente registada antes da operação, como descrito anteriormente [2]. A intensidade da dor foi graduada utilizando uma escala curta: 0 = nenhum, 1 = leve, 2 = moderada e 3 = dor forte. frequência da dor foi classificada como 3 = diária, 2 = semanalmente e 1 = mensal. Para calcular a intensidade da dor, a intensidade da dor e frequência da dor de cada indivíduo foram multiplicados. De acordo com a pontuação final da dor, os pacientes foram divididos em três subgrupos: Dor I (0), representando o grupo de pacientes sem dor, dor II (1-3) pacientes que sofriam de dor leve e dor III (4-9), com dor moderada a grave

imunohistoquímica imunofluorescência dupla marcação

3 uM consecutivos secções de amostras de NP, o PCA e PC, embebidos em parafina foram analisadas para o pan-neuronal marcador de proteína do gene do produto 9,5 (PGP 9.5) e de marcadores inflamatórios da superfície celular, incluindo aglomerado de diferenciação 45 (CD45) como marcador pan-leucócitos, células CD8 como um marcador de linfócitos T citotóxicos, de células CD4 para marcar os linfócitos T auxiliares, CD68 como marcador de macrófagos, elastase de neutrófilos (NE) por granulócitos neutrófilos, CD20 para linfócitos B, NCL-PC para o plasma células, PRG2 de eosinófilos e de células anti-mastro triptase (MC) e anti-MC quimase para identificar os mastócitos. O tipo de protease-activated receptor 1 (PAR-1) e tipo 2 (PAR-2) foram immunolabeled em secções consecutivas adicionais. As secções foram incubadas com os anticorpos primários nas diluições indicadas durante uma noite numa câmara húmida a 4 ° C (Tabela 1). Os controlos negativos foram incubadas com os mesmos anticorpos IgG ou IgM não imunizados subclasse. diluições de anticorpo primário foram realizadas com soro de cabra normal. Todos os antígenos foram detectados através da DAKO Envision System-HRP (Hamburgo, Alemanha) ou por Alexa Fluor

® 488 e 594 anticorpos (Invitrogen, Alemanha) para as espécies correspondentes. DAB foi usado como cromogénio. imagem digital foi realizada com o sistema Keyence Biorevo BZ-9000 (Keyence, Neu-Isenburg, Alemanha).

A análise quantitativa da distribuição de células inflamatórias em torno dos nervos

A fim de determinar a quantidade de subtipos de células inflamatórias ao redor nervos intrapancreática, a área imunologicamente ocupada por cada subtipo de células dentro de grupos de células inflamatórias neurais foi medida através do software ImageJ (1.36b ImageJ, Wayne Rasband). Para este efeito, a partir de cada secção de um paciente, entre três a cinco nervos que demonstram neurite pancreático foram primeiro identificadas e subsequentemente fotografado com a ajuda de uma secção corada-PGP9.5 consecutiva e uma secção corada com hematoxilina-eosina-consecutivo. neurite pâncreas foi histologicamente definido e identificado como “um aglomerado de células inflamatórias neurais que está em contacto com o perineuro e /ou endoneurium e claramente podem ser delineados a partir do infiltrado celular inflamatório geral do tecido remanescente”. Após a conversão da imagem de RGB para uma imagem de 8-bit, a função de limiar foi utilizado para definir uma fase com a ajuda de um limiar pré-estabelecido que rotula exclusivamente a área ocupada pelas células inflamatórias neurais imunocoradas, e o software determinado automaticamente o absoluto e por a área cento desta fase em cada imagem, como também descrito anteriormente [10]. As áreas absoluto medido em cada imagem para a imunorreactividade de CD8, CD4, CD68, CD20, NCL-PC, PRG2, NE, anti-MC-triptase e -chymase foram então relacionada com que para CD45 como marcador pan-leucócitos para determinar a distribuição de subpopulações de células inflamatórias na população de células de pâncreas neurite. O fotografando e posterior análise quantitativa foi realizada por três observadores (SS, IED e ESD) cegos aos dados clínicos e imuno-histoquímica, como descrito anteriormente [1].

em tempo real Luz Cycler® Quantitative-Polymerase Chain- reacção (qRT-PCR)

Extracção do ARNm a partir de tecido pancreático foi preparado usando TissueLyser II e o mais RNeasy kit (Qiagen /Hilden) de acordo com as instruções do fabricante. Subsequentemente, a quantidade e a pureza do RNA foi determinada utilizando Nanodrop ND1000 (Peqlab /Erlangen). a síntese de ADNc de primeira cadeia foi efectuada com o kit transcriptor-First-Strand cDNA Synthesis (Roche /Mannheim) de acordo com as instruções do fabricante. Expressão de activado pela protease do receptor de tipo 1 (PAR-1, GeneBank, GeneID: 2149), activado pela protease do receptor de tipo 2 (PAR-2, GeneBank, GeneID: 2150) e do gene de manutenção referência ciclofilina-B (CYPB , GeneBank, GeneID: 5479) foram medidos com a Roche LightCycler-480 kit real-Time PCR System e LightCycler-480 SYBR Green I Mestre. Em conformidade com o método Pfaffl [11], expressão relativa foi baseado no ponto de passagem desvio médio entre as 3 amostras normalizadas para o ponto de passagem significativo desvio para o gene de referência, após a correcção de eficiência das reacções de PCR. A expressão relativa de PAR-1 e PAR-2 ​​em amostras foi então normalizados para o nível de pâncreas humano normal (NP). Todos os iniciadores foram obtidos da Sigma-Aldrich.

A quantificação da imunoreactividade neural para o PAR-1 e PAR-2 ​​

Em cada secção, a imunorreactividade neural significativo para PAR-1 e PAR-2, foi determinada através de colorimetria baseado no ImageJ, como também mostrado anteriormente [10]. Resumidamente, os nervos imunomarcadas com neurite pâncreas de cada seção com PCA ou CP foram fotomicrografados e submetido à função limiar do software após a conversão em uma imagem de 8 bits. A percentagem de área imunocoradas em cada nervo foi determinada pelo software depois de estabelecer um limiar definido em nervos como regiões de interesse para cada coloração (isto é, PAR-1 e PAR-2) e correspondeu a imunorreactividade neural. A imunorreatividade média de cada paciente foi calculada pela determinação da immunoreactivitiy neural média de todos os nervos com neurite pâncreas em cada paciente.

A análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando o GraphPad Prism 5 Software (La Jolla, CA, EUA). Para comparações múltiplas e devido à interdependência das áreas subconjunto de células medidos e percentagens dentro de uma dada população neurite, teste de Friedman seguido do teste post hoc de Dunn foi utilizado. Em particular, aplicou-se este teste para a comparação dos domínios imunorreactivos de subconjuntos de células inflamatórias, e também para a comparação da sua porção relativa (por cento) em cada população neurite. Para a análise do PAR-1 e PAR-2 ​​expressão entre NP, APC e CP, e para a correlação de invasão neural com infiltração de células perineural mastro, Kruskal-Wallis-Test em conjunto com teste post hoc de Dunn foi utilizado. Para comparação de imunorreactividades de cada subtipo de células inflamatórias, e de PAR-1 e PAR-2 ​​neuro-imunorreactividades e os níveis de expressão entre os pacientes com dor e pacientes sem dor, de Mann-Whitney U Test foi aplicado. Para estas análises dor com dois grupos, o teste t desemparelhado foi utilizado adicionalmente para confirmar as diferenças observadas. Para a análise subconjunto de mastócitos envolvendo frequência co-localização triptase-quimase, foi utilizado o teste exato de Fisher. Os resultados são expressos como mediana (mínimo; máximo), excepto para a expressão de ARNm de dados que foram apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). Dois lados valores p foram sempre calculado, e um efeito foi considerado estatisticamente significativo em um

p

-valor ≤ 0,05.

Resultados

nervos intrapancreática em APC e CP são predominantemente infiltrado por linfócitos T citotóxicos, macrófagos e mastócitos

Como o objetivo principal do presente estudo, foram quantificadas a quantidade de leucócitos e subpopulações de leucócitos no neurite pancreático. Para este efeito, a área ocupada por cada subtipo de leucócitos foi quantificada através de análise colorimétrica e expressa em ^ M

2. Na APC, a população de células imunes neurite pancreático foi composta principalmente de CD68

+ macrófagos [39,87% (10,15; 64,88) de todas as células inflamatórias perineurais, 2545 mm

2 (665,9; 22012)], seguido de CD8

+ T citotóxicas [33,20% (21,06; 54,11), 2,623 mm

2 (586,5; 21092)] e mastócitos [MC, 14,46% (0,28; 52,10), 1106 ^ m

2 (21.51; 16090), a Figura 1A-C]. É importante ressaltar que todas as outras grandes populações de células inflamatórias estavam presentes em quantidades dificilmente detectáveis ​​[CD20

+ Linfócitos B: 0,79% (0,10; 13,84) e 76,84 mm

2 (3,06; 2598); CD4

+ T células auxiliares: 1,61% (0,39; 28,45) e 83,03 mm

2 (13.55; 2962); NCL-PC

+ células plasmáticas: 1,87% (0,01; 10,54) e 140,9 mm

2 (0,31; 986,9); PRG2

+ eosinófilos: 0,49% (0,10; 19,77) e 38,71 mm

2 (9,93; 888,8); A Figura 1A-C)]. A distribuição por cento de subpopulações de leucócitos no pâncreas neurite em PCA é representada na Figura 1C.

(A) neurite pâncreas foi identificado por meio de uma secção contrastadas com hematoxilina-se que com o immunolabeled PGP9 marcador pan-neuronal. 5, ou por meio de um hematoyxlin-eosina (H e) -stained secção. As células inflamatórias que compõem neurite pancreático foram identificados através de imunomarcação com o marcador CD45 pan-leucócitos, com CD68 (macrófagos), CD8 (linfócitos T citotóxicos), CD4 (linfócitos T auxiliares), CD20 (linfócitos B), NCL- PC (células plasmáticas), elastase de neutrófilos, PRG2 (eosinófilos), anti-triptase de mastócitos (MC-T) e correlacionado com a sensação de dor. (B-C) Na APC, macrófagos CD68 +, + linfócitos T CD8

citotóxicos e mastócitos (MC) dominar a população de células inflamatórias neural. “N” representa o nervo identificado. Entre três a cinco nervos com neurite pâncreas foram analisados ​​a partir de cada paciente. Todas as imagens em aumento de 200x. Barras de escala indicam 50 mm.

Na CP, a distribuição dos subtipos de células inflamatórias perineurais assemelhava fortemente que no CaP. Também aqui, CD8

+ linfócitos T citotóxicos [34,17% (12,27; 78,97) e 2064 ^ m

2 (142,7; 11334)], CD68

+ macrófagos [34,40% (1.562; 54,22) e 1.852 mm

2 (126,9; 11667)] e mastócitos [24,16% (1,78; 56,63), e 2339 ^ m

2 (221,1; 10155)] foram as mais prevalentes nas lesões pancreáticas neurite (Figura 2A-C). Os restantes subtipos de células inflamatórias foram apenas ocasionalmente detectado em torno dos nervos intrapancreática [CD20

+ Linfócitos B: 0,57% (0,07; 3,19) e 21,93 mm

2 (1,27; 293,9); CD4

+ T células auxiliares: 0,56% (0,16; 6,22) e 27,77 mm

2 (5,38; 1325); NCL-PC

+ células plasmáticas: 1,20% (0,05; 17,44) e 121,3 mm

2 (2,08; 474,3); PRG2

+ eosinófilos: 0,61% (0,13; 6,24) e 23,33 mm

2 (2,41; 1384); A Figura 2A-C]. A distribuição por cento de subpopulações de leucócitos no neurite pancreático em CP é mostrada na Figura 2C.

Na pancreatite crônica, neurite pancreático mostrou uma composição semelhante ao câncer de pâncreas, compreendendo macrófagos CD68 +,

+ linfócitos T citotóxicos CD8 e mastócitos (MC). “N” representa o nervo identificado. Entre três a cinco nervos com neurite pâncreas foram analisados ​​a partir de cada paciente. Todas as imagens em aumento de 200x. Barras de escala indicam 50 mm.

A dor neuropática em PCA é associado com especificamente aumento da infiltração de mastócitos em torno dos nervos intrapancreática

Um dos principais objectivos deste estudo foi comparar a distribuição de as subpopulações de leucócitos acima mencionados entre os pacientes APC com e sem dor abdominal. Olhando para toda a quantidade de leucócitos nos infiltrados de células inflamatórias neurais, os pacientes APC com a dor não demonstrou qualquer diferença no tamanho da população de células inflamatórias por nervo [7574 mm

2 (3121; 36358)] quando comparados com CaP pacientes sem dor [7320 mm

2 (1155; 33793)]. A análise dos subtipos de células inflamatórias revelou que houve uma mudança na distribuição de apenas um único subconjunto de células inflamatórias entre pacientes APC com a dor: A quantidade de mastócitos perineurais foi aumentado especificamente entre os pacientes APC com a dor [PCAP, 30,96% (10,75; 52,10) e 3081 mm

2 (21.51; 16090)] do que entre os pacientes sem dor [PCAN, 13,41% (6,64; 26,29) e 777,6 mm

2 (69.93; 3228),

p

0.05 A Figura 3A-C]. Todos os outros subtipos de células inflamatórias não demonstrou qualquer variação significativa com o estado de dor dos pacientes CaP [

+ linfócitos T citotóxicos CD8 na PCAP: 32,22% (22,62; 42,07) e 2,802 mm

2 (116; 10933) vs . 39,57% (21,06; 54,11) e 2208 mm

2 (586,5; 21092) em PCAN; CD68

+ macrófagos: 38,74% (21,21; 64,88) e 2628 ^ m

2 (1214; 22012) em PCAP vs. 40,99% (10,15; 53,00) e 2,486 mm

2 (665,9; 8097) em PCAN; CD20

+ B linfócitos: 0,77% (0,23; 5,11) e 70,64 mm

2 (3,36; 2,598) em PCAP vs. 1,1% (0,10; 13,84) e 83,04 mm

2 (3,06; 418,8) em PCAN; CD4

+ T células auxiliares: 1,42% (0,39; 15,13) e 82,62 mm

2 (30.62; 562,9) em PCAP vs. 1,79% (0,41; 28,45) e 83,03 mm

2 (13.55; 2962 ) em PCAN; NCL-PC

+ células plasmáticas: 2,08% (0,01; 8,61) e 245,4 mm

2 (0,31; 986,9) em PCAP vs. 1,46% (0,20; 10,54) e 69,83 mm

2 (9,50; 597,9) em PCAN; PRG2

+ eosinófilos: 0,50% (0,14; 19,77) e 48,98 mm

2 (10,75; 888,8) em PCAP e 0,53% (0,10; 2,44) e 26,99 mm

2 (9,93; 156,6) em PCAN ; A Figura 3A-C). A distribuição por cento de subpopulações de leucócitos das neurites de pâncreas em pacientes APC com relação sem dor é mostrada na Figura 3C.

Status da dor em pacientes CaP não afetou a distribuição relativa da maioria dos subconjuntos de células inflamatórias perineurais em CaP , mas foi apenas mastócitos que foram especificamente enriquecido em torno dos nervos intrapancreática de pacientes APC com a dor quando comparados aos pacientes sem dor. “N” representa o nervo identificado. Entre três a cinco nervos com neurite pâncreas foram analisados ​​a partir de cada paciente. Todas as imagens em aumento de 200x. Barras de escala indicam 50 mm.

A dor neuropática na CP é caracterizada por aumento da infiltração de mastócitos perineural e supressão de linfócitos T citotóxicos perineurais em neurite pancreático

Embora a neurite pâncreas foi descrito pela primeira vez em CP por alguns estudos pioneiros [5], [9], a influência da dor na distribuição de subpopulações de células inflamatórias em neurite pancreático associado-CP são amplamente desconhecida. Quando comparamos a quantidade de leucócitos ao redor nervos intrapancreática em pacientes com PC com vs. sem dor, havia quantidades curiosamente menor de células inflamatórias perineurais entre pacientes com PC com dor [(CPP, mediana área CD45-imunorreativa perineural: 4333 mm

2 (1118; 10375)] do que entre os pacientes com PC sem dor [(CPN, mediana área CD45-imunorreativa perineural:. 9831 mm

2 (1687; 25685)] Esse encolhimento da célula inflamatória perineural se infiltrar no CPP foi acompanhada por uma aumento específico na proporção relativa de mastócitos neste proporção de células inflamatórias [CPP: 36,93% (10,92; 56,63) vs. CPN: 20,25% (1,78; 37,22)], mas não nas quantidades absolutas de células mastro perineural [CPP: 1546 mm

2 (455,8; 3129) vs. CPN:. 2.833 mm

2 (221,1; 7396)] Além disso, tanto o absoluto e a quantidade relativa de CD8

+ linfócitos T foram diminuídos na CP dolorosa [CPP: 22,35% (12,27; 78,97) e 768,6 mm

2 (142,7; 11334) vs. CPN: 37,32% (28,31; 48,09) e 3628 mm

2 (653,0; 7365)]. Não houve mais grandes alterações nos valores relativos ou absolutos de outros subtipos de células inflamatórias entre pacientes com PC com a dor [CD68

+ macrófagos: 34,40% (5,57; 54,22) e 1409 ^ m

2 (546,8; 4811) em CPP vs. 34,29% (1,56; 51,03) e 3129 mm

2 (126,9; 6613) em CPN; CD20

+ B linfócitos: 0,50% (0,07; 1,65) e 7,07 mm

2 (1.27; 40.86) no CPP vs. 0,76% (0,08; 3,19) e 61,42 mm

2 (2,57; 293.9) em CPN; CD4

+ T células auxiliares: 0,50% (0,16; 4,10) e 14,47 mm

2 (5,38; 208.3) no CPP vs. 0,87% (0,28; 6,22) e 46,73 mm

2 (21.97; 351,2 ) em CPN; NCL-PC

+ células plasmáticas: 1,06% (0,05; 6,32) e 49,05 mm

2 (2,08; 264,0) em CPP vs. 2,38% (0,45; 17,44) e 151,5 mm

2 (8,58; 474.3) em CPN; PRG2

+ eosinófilos: 0,42% (0,15; 5,48) e 16,22 mm

2 (2,41; 174,1) no CPP e 0,94% (0,13; 6,24) e 39,42 mm

2 (3,34; 1,384) em CPN ; Figura 4A-C)]. A distribuição por cento de subpopulações de leucócitos no pâncreas neurite em pacientes com CP sem contra dor está representado na Figura 4C.

Semelhante a APC, igualmente em PC, os pacientes com dor demonstraram possuir uma quantidade relativamente maior de mastócitos (MC ), os nervos em torno intrapancreática do que os pacientes sem dor. Além disso, este aumento na quantidade de MC perineural foi acompanhada pela diminuição da quantidade de citotóxico CD8

+ T linfócitos em torno dos nervos intrapancreática. “N” representa o nervo identificado. Entre três a cinco nervos com neurite pâncreas foram analisados ​​a partir de cada paciente. Todas as imagens em aumento de 200x. Barras de escala indicam 50 mm.

infiltração de mastócitos Perineural não se correlaciona a invasão neural no câncer de pâncreas

invasão Neural (NI) é uma das características histopatológicas da APC e é encontrado em até 100% de CaP espécimes [12]. Como observamos um aumento específico no montante de perineural MC em dolorosa APC, uma questão importante que surgiu neste momento era se perineural MC infiltração também se correlaciona com a invasão tumoral aumentada de nervos. Para este efeito, classificamos a gravidade da NI em CaP espécimes em três categorias ( “0 /nenhuma invasão”, “Eu invasão /peri-neural” e “II invasão /endo-neural” [1]) e correlacionou a gravidade NI a quantidade relativa de MC perineural. Aqui, não houve correlação entre perineural MC infiltração e aumento da severidade da NI em CaP [nenhuma invasão /Grau 0: 15,73% (3,08; 65,16), invasão peri-neural /Grau I: 14,79% (0,34; 51,71) e endo invasão neural /Grade II:. 37,67% (17,65; 60,05),

p

= 0,08, Figura 5]

nervos intrapancreática em tecidos CaP foram avaliados quanto à presença de invasão neural (NI) e classificados para o NI graus “0 /nenhuma invasão”, “invasão 1 /peri-neural” e “2 /invasão endo-neural). Em nossa coorte, os montantes de mastócitos perineurais relativos não diferiu entre os diferentes graus de NI em CaP humano. Os resultados são apresentados como mediana (mínimo; máximo)

Expressão e imuno neural do PAR-1 e PAR-2 ​​em APC e CP

Os neurônios podem ficar sensibilizados pela ação do. trombina sobre o tipo de receptor activado por protease 1 (PAR-1) ou de proteases MC-derivados (tais como triptase) sobre-activado de protease do receptor de tipo 2 (PAR-2) [13]. Como observamos quantidades de mastócitos significativamente elevados em torno de nervos intrapancreática em APC e CP, nós também quantificados os níveis de PAR-1 e PAR-2 ​​nestes tecidos e, adicionalmente, em nervos intrapancreática. Aqui, a comparação da expressão de mRNA por PAR-1 e PAR-2 ​​em NP, o PCA e PC não apresentaram qualquer diferença principal nos níveis desses receptores (Figura 6A). Da mesma forma, quando os pacientes APC e CP foram estratificados para o “No Pain” e grupos “Pain”, os níveis de mRNA destes receptores não foram diferentes entre os grupos (Figura 6B-C). Quando os imunoreatividades neurais desses receptores foram comparados entre pacientes com e sem dor, os pacientes APC com a dor tende a exibir um pouco maior imunorreatividade para PAR-1 [3.272% (0,20; 9,44)] do que aqueles sem dor [1,22% (0,14; 5,57), Figura 6D]. No entanto, não houve diferença na imunorreactividade de PAR-2 ​​em pacientes com CaP dor [11,06% (4,45; 17,23)] versus sem dor [11,90% (1,843; 28,64), (Figura 6D)]. Da mesma forma, o estado de dor dos pacientes com PC não teve influência sobre a imunorreatividade neural para PAR-1 ou PAR-2 ​​em nossa coorte (Figura 6E).

(A) Expressão do PAR-1 e PAR-2 ​​foi comparação entre o normal pâncreas humano (NP), CP e tecidos PCA através de qRT-PCR e não diferiu entre estas três entidades. Expressão foi normalizado pela primeira vez ao gene housekeeping ciclofilina B e depois para NP. (B) Em APC, os níveis teciduais de PAR-1 e PAR-2 ​​não diferiu entre pacientes com dor contra pacientes sem dor. (C) Similarmente, também em CP, não havia nenhuma diferença nos níveis de mRNA de tecido de PAR-1 e PAR-2 ​​em pacientes com dor nenhuma relação com a dor. (D) os nervos intrapancreáticos na CaP foram analisadas quanto à imuno-reactividade para o PAR-1 e PAR-2 ​​e correlacionados com o estado de dor dos pacientes. Aqui, a sensação de dor não foi associada com as diferenças na imunorreactividade de nervos intrapancreática por PAR-1 ou PAR-2. (E) Em analogia com o APC, também no CP, pacientes com dor exibiu imunoreatividades semelhantes em nervos para PAR-1 e PAR-2, como pacientes sem dor.

neuropáticas células perineural mastro associado à dor em APC e CP são MC

TC-tipo mastócitos

nos seres humanos, MC podem ser classificados com base no seu teor de mediador em duas categorias: MC

T do tipo mastócitos que contêm heparina e triptase, e MC

mastócitos TC do tipo que contêm, adicionalmente, a enzima “quimase” proteolítica [14]. Para determinar o fenótipo de mastócitos prevalente em APC, CP e NP, realizamos rotulagem dupla imunofluorescência em tecidos pancreáticos contra triptase de mastócitos e quimase mastócitos. Em NP, mastócitos foram quase não detectável em todo nervos intrapancreática. Em todos os pacientes NP que foram incluídos na análise, só podemos encontrar três nervos que mostraram uma associação espacial próxima com células inflamatórias. A dupla imunomarcação destas mastócitos mostrou que todas estas células continham ambos triptase e quimase [100% (100; 100)], assim como classificando-MC

mastócitos do tipo TC (Figura 7A). Por outro lado, tanto na APC e CP,

mastócitos de tipo TC MC foram novamente o fenótipo das células mastro perineural predominante (81,7 ± 4,9% e 77,0 ± 4,0%, respectivamente), mas ambas as entidades de doença continha adicionalmente perineural MC

tipo T (triptase-only) mastócitos (18,3 ± 4,9% e 23,7 ± 4,0%, respectivamente). A análise de subgrupo considerando o estado de dor dos pacientes mostraram uma distribuição semelhante de perineural MC

TC e MC

mastócitos de tipo T em pacientes APC com a dor (MC

TC: 85,6 ± 6,4% e MC

T: 14,4 ± 6,4%) versus aqueles sem dor (MC

TC: 77,4 ± 7,4% e MC

T: 22,6 ± 7,4%, Figura 6A). Em contraste, pacientes com PC com dor apresentaram proporções significativamente maiores de perineural MC

TC-tipo mastócitos (MC

TC: 86,9 ± 4,4% e MC

T: 13,1 ± 4,3%,

p

0,0001) do que pacientes com PC sem dor (MC

TC: 62,9 ± 6,4% e MC

T:. 37,1 ± 6,4%; Figura 6A)

(A) tecido pancreático humano amostras de NP, APC e CP foram duplamente immunolabeled para perineural MC-triptase (vermelho) e MC-quimase (verde). Em todas as três entidades, a grande maioria dos perineural MC demonstraram imunorreatividade dupla (amarelo no overlay) para MC-triptase e -chymase. Na CP, houve significativamente maiores quantidades relativas de MC double-imunorreativa entre os pacientes com dor do que entre aqueles sem dor. As barras de escala indicam branco 100 um.