Abstract

O câncer de ovário é uma doença maligna associada à inflamação com uma alta taxa de mortalidade. CXCR2 expressar cancros do ovário são agressivos com resultados mais pobres. Por conseguinte, investigada mecanismos moleculares envolvidos na progressão do cancro orientada por CXCR2 comparando linhas celulares de cancro do ovário positivas e negativas CXCR2. Estavelmente CXCR2 transfectadas células SKOV-3 teve uma taxa de crescimento mais rápido em comparação com células de controlo transfectadas com vector vazio. Em particular, o factor de necrose tumoral (TNF), abundantemente expresso no cancro do ovário, reforçada a proliferação celular através da diminuição da fase G0-G1 em células transfectadas CXCR2. TNF aumento da atividade nuclear fator-kB (NF-kB) a um maior grau de CXCR2 células transfectadas do que as células controlo, bem como proporcionou uma maior ativação do IkB. CXCR2 células transfectadas expressaram níveis mais elevados de seus ligandos pró-inflamatórias, CXCL1 /2 e aumentado mais a proliferação, migração, invasão e formação de colónias. células positivas CXCR2 também activado mais EGFR, o que levou a uma maior ativação da Akt. Reforçada a actividade de NF-kB em células positivas CXCR2 foi reduzido por um inibidor de PI3K /Akt, em vez de um inibidor Erk. CXCL1 adicionados a células positivas CXCR2 levaram a um aumento da ativação de IkB. CXCL1 também levou a um número significativamente maior de células invasivas em células transfectadas CXCR2, que foi bloqueado pelo inibidor de NF-kB, Bay 11-7082. Além disso, a proliferação celular aumentada em células positivas CXCR2 foi mais sensível ao anticorpo CXCL1 ou um inibidor de NF-kB. Finalmente, CXCR2 transfecção de células progenitoras aumentou a actividade do promotor CXCL1 através de um sítio de NF-kB. Assim, o aumento de quimiocinas pró-inflamatórias CXCL1 /2, ao potenciar a activação de NF-kB por meio Akt transactivado-EGFR, contribui para a progressão do câncer de ovário-driven CXCR2

Citation:. Dong YL, Kabir SM, Lee ES, Filho DS ( 2013) CXCR2-Driven do cancro do ovário Progressão Envolve regulação positiva de pró-inflamatórias quimiocinas através da potenciação de NF-kB Ativação via EGFR-transactivado Akt sinalização. PLoS ONE 8 (12): e83789. doi: 10.1371 /journal.pone.0083789

editor: Ichiro Aoki, da Escola de Medicina da Universidade de Yokohama, Japão

Recebido: 05 de junho de 2013; Aceito: 08 de novembro de 2013; Publicação: 20 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Dong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) Instituto Nacional de Ciências Médicas gerais (NIGMS) SC1 089.630 (EL) e Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) SC1AI089073 (DS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário, um dos vários tipos de cancro associadas à inflamação, é a quinta maior causa de morte por câncer entre as mulheres. É uma doença insidiosa porque é geralmente assintomática até tumores se espalharam muito além dos ovários [1]. O microambiente do tumor pró-inflamatória de câncer de ovário é clinicamente associada à disseminação do tumor peritoneal e ascite maciças, seguido por uma alta taxa de mortalidade. células cancerosas do ovário expressam níveis elevados de factor de necrose tumoral (TNF), indicando a importância potencial de TNF como um regulador do microambiente tumoral pró-inflamatório neste malignidade [2] – [4]. Particularmente, o TNF tem sido demonstrado que regulam redes de quimiocina em células de cancro do ovário, através da via de sinalização do factor nuclear-kB (NF-kB) [5] – [6]. As quimioquinas podem ser mediadores críticos de um microambiente do tumor, ao contribuir para a progressão e metástase de câncer [7] – [8]. Entre receptores de quimiocinas, as células de cancro do ovário frequentemente expressar CXCR2, o que fez com que o câncer de ovário progressão [9]. CXCR2 também é altamente expresso em certos outros tipos de células de cancro, tais como adenocarcinoma do pulmão [10], carcinoma de células escamosas da laringe [11], carcinoma do endométrio [12], cancro rectal [13], o carcinoma hepatocelular [14] e do cancro gástrico [15] . Devido a esta associação, pode ser capaz de servir como um marcador de prognóstico independente. Assim, ratinhos knockout CXCR2 têm uma carga tumoral significativamente reduzida no cancro da próstata [16], o cancro do pulmão de murino de Lewis [17] e modelos de tumores renais [18] quando em comparação com ratinhos de tipo selvagem CXCR2. Além disso, uma deficiência de CXCR2 profundamente suprimido tumorigénese-driven inflamação na pele e no intestino [19]. A ausência de CXCR2 no microambiente tumoral também impediu o crescimento de células do cancro do cólon [20]. Finalmente, CXCL1, um ligando CXCR2, foi inversamente associado com a sobrevida livre de recorrência em pacientes com câncer colorretal [21].

Esses fatos indicam que uma via de sinalização mediada por CXCR2 está intimamente associada com a progressão do câncer. Embora várias vias tais como a apoptose, a activação do EGFR e a angiogénese está envolvida na sinalização mediada por CXCR2 [9], [16] – [20], ainda existe uma grande diferença em mecanismos moleculares que ligam entre CXCR2 e seus múltiplos caminhos. No nosso estudo anterior, as linhas de células de cancro do ovário altamente expresso CXCL1-3 e CXCL8 [5] – [6], que têm uma elevada afinidade para CXCR2 [22]. Mesmo que estes ligantes CXCR2 são regulados por NF-kB sinalização [5], [23], não está claro como CXCR2 e NF-kB são mecanicamente envolvidos na progressão do câncer de ovário. Aqui utilizou-se linhas celulares de cancro do ovário parentais e células transfectadas estáveis ​​CXCR2 gerados, bem como as células de controlo transf ectadas com vector vazio. Nós, então, definido o impacto da NF-kB de sinalização, uma das principais vias pró-inflamatórias, sobre a contribuição potencial do CXCR2 a progressão do câncer de ovário.

Materiais e Métodos

Reagentes

recombinante TNF humano, CXCL1 e um anticorpo específico CXCL1 /2/3 bandeja por neutralização foram obtidos a partir de R D Systems (Minneapolis, MN). Um CXCL1 /2 ELISA kit humano foi adquirido a partir de Pepro Tech (Rocky Hill, NJ). PD98059 foi adquirido a Merck Chemicals Inc. (Gibbstown, NJ), AG-1478 foi de Enzo Life Sciences International, Inc., (Plymouth Meeting, PA) e Bay11-7082 e LY294002 a partir de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Os anticorpos foram adquiridos da seguinte forma: CXCR2 (E-2, SC-7304) e β-actina foram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) e IkB, IKK, EGFR, ERK1 /2, Akt e as suas formas fosforiladas, tal como IkB (Ser32 /36), EGFR (Tyr1173), ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), IKK (Ser176 /180) e AKT (Ser473), foram de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Lipofectamine 2000, G418 e todos os meios de cultura líquidos foram adquiridos a partir de Invitrogen (Grand Island, NY). Uma matriz de PCR personalizado para a rede de quimiocinas, array PCR define para genes relacionados com o ciclo celular, uma mistura SYBR® Verde Mestre, e shRNAs para controle e CXCR2 veio SABiosciences em Qiagen (Frederick, MD). kits de detecção quimioluminescente eram de GE Healthcare (Piscataway, NJ). Anti-sentido e de sentido oligonucleótidos foram obtidos de Operon Eurofins MWG (Huntsville, AL). CXCR2 vector de expressão foi gentilmente fornecido pelo Dr. Ann Richmond (Universidade de Vanderbilt, Nashville, TN), enquanto que o vector de luciferase de NF-kB veio da BD Biosciences (Palo Alto, CA). Os ARNsi para o controlo e Akt1 foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Finalmente, o sistema de ensaio de luciferase repórter,

Renilla

-Glo ™ Luciferase Assay System e pRL-TK do vector foram obtidos da Promega (Madison, WI).

CXCR2 Estável linha celular que expressa e culturas de células

a linha de células de cancro do ovário humano SKOV-3 foi adquirido da American Type Culture Collection (Manassas, VA). CXCR2 que expressam linhas celulares foram geradas por transfecção de forma estável de CXCR2 ou vectores vazios em células de cancro do ovário SKOV-3 parentais e seleccionando os clones resistentes a G418. Resumidamente, as células subconfluentes foram transfectadas com vectores de CXCR2 ou vazias utilizando Lipofectamina 2000 e, em seguida, tratada com G418 para seleccionar os clones resistentes a drogas. As células tratadas foram alteradas com novos meios de comunicação a cada 3 dias até clones resistentes a G418 apareceu. A expressão da proteína de CXCR2 nos clones seleccionados foi confirmada por transferência de Western e análise de imagem confocal. Porque expressão de CXCR2 em Skov-3 células é controversa (5, 9), que confirmou a ausência ou, no máximo expressão traço de CXCR2 em níveis de mRNA e proteína em células parentais utilizando matriz de PCR, qRT-PCR, Western blot e análise de imagem confocal . A linha celular positiva CXCR2 foi denominado SKCXCR2, e a linha celular de controlo negativo CXCR2, SKA. células cancerosas do ovário (cerca de 5 × 10

4 células /mL) foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera saturada de água de 95% de ar e 5% de CO

2 em 24 ou 6-se placas com meio RPMI meio com penicilina /estreptomicina e 10% de FBS. Depois de uma cultura durante a noite para permitir a ligação celular para as placas, o meio foi removido e meio fresco sem FBS foi adicionado para remover quaisquer efeitos de ingredientes contidos nos soros. Os tratamentos com os diferentes agentes são descritos em detalhe nos resultados.

Western Blots

foram preparados lisados ​​celulares, fraccionado em geles de SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de nitrocelulose como anteriormente descrito [6]. O bloqueio de proteínas não específica foi realizada por incubação das membranas com 5% de leite em pó magro em solução salina tamponada com Tris Tween-20 (TBST) durante 2 h à temperatura ambiente. As membranas foram incubadas com anticorpos primários em 1:1,000 diluição em solução de bloqueio durante a noite a 4 ° C. As membranas foram lavadas 3 vezes com TBST, durante 10 min, seguido por incubação durante 1 h com anticorpo conjugado com peroxidase de rábano secundário (diluição 1:2,500) em 5% leite /TBST. As membranas foram então lavadas 3 vezes com TBST durante 10 minutos e as bandas visualizadas por quimioluminescência aumentada. Após remoção da membrana durante 10 minutos com metanol contendo 3% H

2O

2, β-actina foi detectado, a fim de servir como um controlo de carga interna de lisados ​​celulares.

Ensaios de Proliferação de Células

ensaios de proliferação celular foram realizadas utilizando a clivagem de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) num produto colorido. Após incubação numa placa de 24 poços, cada poço foi lavado duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e em seguida uma solução de MTT (1 mg /ml de fenol meio isento de vermelho: PBS = 04:01) foi adicionado. As placas foram incubadas durante 3 h com protecção da luz. A solução de MTT foi removido e 500 mL de isopropanol foi adicionado. As placas foram colocadas num agitador durante 10 min à temperatura ambiente para o dissolver completamente o produto cor de MTT. A densidade óptica foi medida a 595 nm utilizando um leitor de microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA). Os valores foram normalizados para os controlos não tratados.

citometria de fluxo

As células cancerígenas foram semeadas a densidades iguais e mantidas em cultura durante 24 h. As células foram então tratadas em triplicado com TNF (10 ng /ml) ou meio isolado como controlo durante 48 h. As células aderentes e não aderentes foram colhidas com PBS frio e coradas com iodeto de propidio [50 mg /ml em 0,1% (w /v) de citrato de sódio, 0,1% (v /v) de Triton X-100] durante a noite. Após incubação durante a noite, as amostras foram analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACScan (BD Biosciences) e a percentagem de células em G0 /G1, G2 /M e S fases quantificada utilizando software de Flojo (ár Inc., Ashland, OR).

transfecções transientes e de luciferase Ensaios

CXCL1 actividade do promotor foi realizada com vector gerado KC701LUC e os seus mutantes como anteriormente descrito [23]. células de cancro do ovário a cerca de 50% de confluência em placas de 24 poços foram lavados uma vez com meio fresco sem aditivos e, em seguida, transfectadas transientemente com vectores alvo ou Akt1 siRNA (concentração final: 10 nM) durante 24 h a 37 ° C utilizando Lipofectamina solução. As células transfectadas foram tratadas como descrito no Resultados e incubou-se durante 6 h. Após lavagem as células com PBS frio e a adição de tampão de lise (Promega, Madison, WI), foram utilizados os lisados ​​celulares para a determinação de actividade de luciferase usando um luminómetro de microplacas. A actividade de luciferase, expressa como unidades relativas de luz, foi normalizada para os níveis de proteína medido ou a actividade de cada controlo interno.

análise de imagem confocal

As células (5000 células /250 uL) meios foram semeadas sobre lâminas de 8 câmaras e apego celular foi permitido durante a noite. As células nas lâminas de câmaras foram lavadas 3 vezes em PBS e fixadas com paraformaldeído a 4% durante 10 min à temperatura ambiente e bloqueada com BSA a 1% em PBS durante 30 min. O anticorpo primário foi aplicado durante 1 h à temperatura ambiente, e, em seguida, lavou-se com PBS durante 30 min. As lâminas foram lavadas 3 vezes com PBS e depois incubadas com o segundo anticorpo conjugado com Alexa Fluor 594 ou Alexa Fluor 488 (LI-COR Biotecnologia, Lincoln, NE) durante 1 h à temperatura ambiente. Finalmente, as lâminas foram lavadas 3 vezes com PBS, montado com meio contendo DAPI (Vector Laboratories, Burlingame CA) de montagem e observados com um microscópio de fluorescência (Nikon A1R de varredura a laser confocal de imagem).

Matriz PCR e qRT- PCR

Após o isolamento de ARN total e a eliminação do ADN genómico, a reacção RT foi realizada a 42 ° C durante 15 minutos seguido de 94 ° C durante 5 min. Um tempo real de reacção de PCR para os genes ou quimioquinas relacionadas com o ciclo celular foi realizada de acordo com as instruções do fabricante, utilizando uma coluna Bio-Rad CFX96 (Hercules, CA) e a sequência de duas etapas programa de ciclos: 1 ciclo a 95 ° C durante 10 min, e 40 ciclos a 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min. A análise dos dados foi realizada com base em uma matriz de PCR com base na Web Análise de Dados (https://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php) fornecido pelo SABiosciences em Qiagen (Frederick, MD). Os iniciadores utilizados em qRT-PCR eram como se segue: 5-TGC AGG GAA TTC ACC CCA AG-3 (para a frente) e 5-GGA TGC AGG ATT GAG ACG AG-3 (reverso) para CXCL1 e 5-GCA GGG AAT TCA CCT CAA G-3 (para a frente) e 5-GGG GTT GAG ACA AGC TTT C-3 (reverso) para CXCL2.

ligado a enzima ensaio imunoenzimático (ELISA)

CXCL1 atividade humana /2 era medido por um CXCL1 /2 ELISA kit humano (PeproTech, Rocky Hill, NJ) de acordo com as instruções do fabricante. Determinou-se a densidade óptica de cada poço, utilizando um leitor de microplacas fixado para 450 nm com correcção a 570 nm de comprimento de onda.

migração e invasão Assays

células de tumor (

5 2X10 células /ml em soro isento de meio RPMI-1640 com 1% de BSA) a ser utilizado para um ensaio de migração ou invasão foram semeadas em placas de inserção 24 bem-cultura de células Transwell (Greiner Bio-One) ou em Matrigel (BD Biosciences, 01:03 diluído com PBS) revestido Transwell sistema, respectivamente. A câmara inferior continha 0,5 mL de RPMI suplementado com soro bovino fetal a 10% como um quimioatractor. As células foram tratadas como indicado nos resultados e, em seguida, incubadas durante 24 h. As células que permaneceram no interior do inserto foram removidos com um cotonete de algodão; migram ou invadir as células sobre o filtro foram fixadas com formaldeído a 3,7% e coradas com violeta de cristal a 0,1% seguido de lavagem das células com PBS. O número de células que migram ou invasoras foi contado ao microscópio (400 X) usando 5 campos escolhidos aleatoriamente.

formação de colónias

As células foram suspensas em meio de RPMI contendo 0,4% de agarose em concentrações de 2 × 10

3 células por poço de uma placa de seis poços. As células em suspensão foram sobrepostos sobre uma camada inferior de 0,8% de agarose solidificadas em meio RPMI com 5% de FBS, e incubou-se durante 14 dias. Colónias foram coradas com 0,05% de violeta de cristal, fotografado, e quantificados.

Knockdown de CXCR2 por CXCR2 shRNA

células do cancro do ovário em cerca de 50% de confluência em placas de 24 ou 6 poços foram lavados uma vez com 1% de FBS meio fresco sem aditivos e, em seguida, transientemente transfectadas com Controlo CXCR2 ou shRNA (concentração final: 1 fig /mL) durante 72 h a 37 ° C utilizando Lipofectamina solução. As células transfectadas foram confirmados knockdown de proteína CXCR2 e tratada conforme descrito nos resultados de acordo com vários experimentos.

Análise Estatística

Os dados foram analisados ​​pela emparelhado de Student

t

-teste e one-way análise de variância (ANOVA), conforme apropriado. Se uma significância estatística (p≤0,05) foi determinada por análise de variância, os dados foram analisados ​​por comparações de pares de Tukey para detectar diferenças específicas entre os tratamentos.

Resultados

CXCR2 Células positivas ter um crescimento mais rápido taxa e são mais sensíveis à proliferação celular estimulada por TNF comparação com CXCR2 células negativas

Geramos CXCR2 positivo (SKCXCR2) e (SKA) linhas celulares negativas por transfecção estavelmente CXCR2 ou vetores vazios em parental câncer de ovário SKOV-3 células (Figuras 1A e 1B). As taxas de crescimento em células SKCXCR2 e SKA foram semelhantes para as primeiras 24 h de cultura, mas por 48 e 72 h, as taxas de crescimento celular SKCXCR2 foram aproximadamente o dobro em comparação com células SKA (Figura 1C). Uma vez que o TNF é bem conhecido por ser uma citocina pró-inflamatória abundantemente expresso no cancro do ovário [2] – [4], que testou os efeitos de TNF sobre a proliferação celular em células SKA e SKCXCR2. Os resultados mostraram que o TNF aumentou significativamente a proliferação celular em células SKCXCR2, mas não teve nenhum efeito sobre a proliferação de células SKA (Figura 1D). Com base na análise por FACS, as células SKCXCR2 tinha uma fase G0-G1 reduzida e um aumento da fase S (com um ligeiro aumento na fase G2-M) em comparação com células SKA (Figura 1E). O TNF, por si só, no entanto, diminuiu claramente SKCXCR2 fase G0-G1 (com um ligeiro aumento nas fases S e G2-M), ao passo que não tinha efeitos na SKA células (Figura 1E).

(A) CXCR2 a expressão da proteína em SKA contra células SKCXCR2. Os lisados ​​celulares totais foram preparados e manchas de Western realizada usando anticorpos específicos para CXCR2 e β-actina como um controlo de carga. (B) coloração de imunofluorescência Representante da SKA contra células SKCXCR2, indicando os níveis de expressão de proteína CXCR2 (em verde). (C) Comparação de taxas de crescimento em SKA contra células SKCXCR2. As células foram incubadas durante 0, 24, 48 e 72 horas e as taxas de crescimento normalizadas para 0 h densidades em cada linha celular. As experiências foram realizadas em triplicado e todos os dados são apresentados como média ± E.P. * E ** (p≤0,05) em cada grupo de comparações de pares de ANOVA e Tukey. # (P≤0,05) entre as células SKA e SKCXCR2 pela emparelhado Estudante de

t

-teste. (D) Efeito de TNF sobre a proliferação de células na SKA contra células SKCXCR2. As células foram incubadas com veículo (controle) ou de TNF (10 ng /ml) durante 48 h. Um ensaio de proliferação celular foi realizado utilizando MTT e os valores normalizados para os controlos não tratados. As experiências foram realizadas em triplicado e todos os dados são apresentados como média ± E.P. * (P≤0,05) pelo estudante de

t

-teste. (E) os efeitos de TNF no ciclo celular fases G0-G1, S e G2-M em SKA contra células SKCXCR2. As células foram tratadas com veículo (controle) ou de TNF (10 ng /ml) durante 48 h. A citometria de fluxo ensaios foram realizados para determinar a% de células em cada fase. histogramas representativos são mostrados. As experiências foram realizadas 5 vezes independentes e de dados em cada molde de inserção são apresentados como média ± E.P. letras azuis e vermelhas indicam significância (p≤0,05) em relação ao controle SKA e tratamento TNF, respectivamente, pela

t

-teste.

Além disso, nós testamos os efeitos do Estudante de TNF no ciclo celular relacionados com genes em células contra SKA SKCXCR2. células SKCXCR2 tinha acima diminuição de 50% da ciclina B1 (0,49), ciclina F (0,38), G2 ciclina (0,47) e p21 (0,25) quando comparado com células SKA. TNF não teve nenhum efeito significativo sobre os genes relacionados com o ciclo celular em células de controlo SKA, mas resultou em 2 vezes de aumento de células no GADD45α SKCXCR2 (Tabela S1). GADD45α foi demonstrado ser um mediador de apoptose retinóide sintético induzida em células de carcinoma do ovário [24]. Assim, a interrupção de GADD45α foi mostrado para promover a formação do tubo e a migração de células endoteliais [25]. A migração celular e capacidade invasiva foram de facto muito maior em fibroblastos embrionários de ratinho deficiente em GADD45α [26]. Com base nessas características funcionais de GADD45α, um aumento induzido por TNF em GADD45α é improvável de ser associada com a proliferação celular aumentada em células SKCXCR2.

CXCR2 Células positivas Enhance A activação de NF-kB seguido de um aumento de CXCR2 Ligandos (CXCL1 e 2), em comparação com células negativas CXCR2

como NF-kB é a principal via de sinalização para as funções de TNF, que, por conseguinte, investigado se a proliferação celular induzida por TNF em células SKCXCR2 envolvida a sinalização de NF-kB. Ambos os níveis basais e induzida por TNF da actividade do promotor de NF-kB foi mais elevada em células SKCXCR2 (Figura 2A). coloração de imunofluorescência revelou que as células tinham SKCXCR2 IkB mais fosforilado, em comparação com células SKA (Figura 2B). Por outro lado, a expressão de IkB foi maior na SKA células, em comparação com células SKCXCR2 (Figura 2B). A análise de transferência de Western demonstrou que as células que expressam CXCR2 tinha IKK mais fosforilada e IkB (como um efeito a jusante directa de IKK) em ambos os seus estados basal bem como em resposta ao TNF ao longo do tempo (Figura 2C). activação de NF-kB mediada por CXCR2 podem envolver ligandos de quimiocina que contêm locais kB nos seus promotores [5] – [6], [23]. Por isso, comparou os perfis de rede de quimiocinas em células SKA e SKCXCR2 usando uma matriz de PCR. Os resultados mostraram que as células SKCXCR2 tinha a . Aumento de 2 vezes na quimiocinas pró-inflamatória e CXCL1 CXCL2 quando comparado com as células SKA (Figura 2D)

(A) Efeito de TNF sobre as actividades da luciferase de NF-kB na SKA e células SKCXCR2. Após a transfecção utilizando NF-kB de luciferase vector durante a noite, as células foram tratadas com TNF (10 ng /ml) durante 4 h. As experiências foram realizadas em triplicado e os dados são apresentados como média ± E.P. * E # (p≤0,05) quando comparado com células de controlo e ska, respectivamente, pelo Student pareado

t

-teste. (B) coloração de imunofluorescência Representante de células SKA e SKCXCR2 indicando activação IkB e os níveis de expressão de proteína CXCR2 (em verde). (C) Efeito de TNF (10 ng /mL) ao longo do tempo (0-120 min) sobre a activação de NF-kB em células SKA e SKCXCR2. Os lisados ​​celulares totais foram preparados e manchas de Western realizada usando anticorpos específicos para IkB e IKK, bem como as suas formas fosforiladas (pIκB e pikk). β-actina foi utilizado como um controlo de carga. comparações do perfil (D) das quimiocinas em relação a células SKCXCR2 SKA. Após o isolamento de ARN total, realizou-se uma matriz de PCR quimioquina humana. A linha ponteada indica um aumento de 2 vezes; aqueles com aumento de 2 vezes e média dos limiares ciclo de 30 são reconhecidos como quimiocinas induzidas, e neste caso representam CXCL1 e 2 (*)

CXCR2 Células positivas Aumentar CXCL1 /2. , e estão envolvidos na proliferação celular e melhorar migração, invasão e de formação Colony comparação com CXCR2 células negativas

Nós confirmamos que as células SKCXCR2 produziu mais CXCL1 e CXCL2 do que as células SKA por qRT-PCR e ELISA ensaio (Figuras 3A e 3B). Embora as células SKCXCR2 tiveram um aumento maior em CXCL2 que CXCL1 ao nível do ARNm (Figura 3A), na medida em que a proteína total, houve mais de proteína total CXCL1 (Figura 3B) de CXCL2, provavelmente resultante de uma maior quantidade de ARNm CXCL1 (Figura 2D ). Com base na CXCR2-NF-kB-CXCL1 ligação presume /2, testou-se a sua CXCL1 ou proliferação de células de anticorpo afectado de forma diferente em células SKA e SKCXCR2. A adição de CXCL1 não teve nenhum efeito sobre a proliferação celular em células SKA, mas aumentou significativamente a proliferação de células SKCXCR2 (Figura 3C). Além disso, enquanto um anticorpo para a panela CXCL1 /2/3 não teve nenhum efeito sobre a proliferação celular em células SKA diminuiu significativamente a proliferação de células SKCXCR2 (Figura 3D). Além disso, confirmou que o anticorpo pan reduzida CXCL1 e mRNA CXCL2 em células SKCXCR2 (Figura 3E). Porque o eixo CXCL1-CXCR2 foi encontrado para promover a invasão do tumor gástrico [15], foram comparados os recursos de migração e invasão de células SKA e SKCXCR2. células SKCXCR2 tinha melhorado propriedades migração e invasão em comparação com células SKA (Figuras 3F e 3G). Com base no aumento da migração e invasão de células SKCXCR2, testou-se ainda mais a formação de colónias em agar mole para detectar se houve uma transformação maligna mais elevada em células SKCXCR2, e descobriram que as células SKCXCR2 produziram mais colónias do que as células SKA (Figura 3H).

(a) a confirmação da CXCL1 e expressão CXCL2 em células SKA e SKCXCR2 por qRT-PCR. Após o isolamento de ARN total, de qRT-PCR foi realizado utilizando os iniciadores para CXCL1 e CXCL2. concentrações (B) Cellular CXCL1 e CXCL2 na SKA células e SKCXCR2 ao longo de um período de 24 h. Os lisados ​​celulares totais foram preparados e ELISA realizado usando anticorpos específicos para CXCL1 e CXCL2 e os valores foram normalizados para proteína total. (C) Efeito de CXCL1 sobre a proliferação celular em células SKA e SKCXCR2 para 48 h de incubação. (D) Efeito de anticorpo pan para CXCL1 /2/3 sobre a proliferação celular em células SKA e SKCXCR2. As células foram incubadas com IgG normal (controlo) e anticorpo pan (1:100 diluição) durante 48 h. O ensaio de proliferação celular foi realizado utilizando MTT e os valores foram normalizados para os controlos não tratados. (E) Efeito do anticorpo para o pan CXCL1 /2/3 em CXCL1 e expressão em células CXCL2 SKCXCR2 por qRT-PCR. Após tratamento com anticorpo pan durante 24 h e, em seguida, isolar o ARN total, de qRT-PCR foi realizado utilizando os iniciadores para CXCL1 e CXCL2. (F) características migração entre células SKA e SKCXCR2. características (G) Invasão entre as células SKA e SKCXCR2. (H) Comparação de formação de colónias de células entre SKA e SKCXCR2. Todas as experiências foram realizadas pelo menos em triplicado e os dados são apresentados como média ± E.P. * E # (p≤0,05), calculado pelo aluno de

t

-teste.

CXCR2 Células positivas transativar EGFR a um grau mais elevado, resultando em Akt Activation que contribui para NF- Sinalização kB

Desde que foi mostrado que CXCL1 pode induzir a proliferação de células epiteliais do cancro do ovário por transactivação de EGFR [27], que em comparação transactivação de EGFR em células SKA e SKCXCR2. células SKCXCR2 teve um maior nível de EGFR fosforilada, resultando a uma maior ativação da Akt, mas houve pouco efeito sobre os níveis de privilégio (Figura 4A). imagem confocal revelou que as células tinham SKCXCR2 Akt fosforilada mais, em comparação com células SKA (Figura 4B). Desde Akt e Erk vias referem à sobrevivência celular e proliferação, verificamos os efeitos comparativos de inibidores de PI3K /Akt ou Erk sobre a proliferação celular em células SKA e SKCXCR2. Embora AG-1478, LY294002 e PD98059 atenuou a proliferação de células em ambas as células e SKCXCR2 SKA, os seus efeitos sobre a proliferação eram muito maiores em células SKCXCR2 (Figura 4C). Nós, então, determinado se EGFR inibidores jusante afetadas atividade do promotor NF-kB em células SKA e SKCXCR2. AG-1478, um inibidor de cinase de EGFR específico, não teve nenhum efeito significativo sobre a actividade do promotor de NF-kB em células SKA, mas atenuou a actividade em células positivas CXCR2 de um modo dependente da dose (Figura 4D). Apesar de LY294002, um PI3K altamente selectivo inibidor que bloqueia a activação de Akt, atenuou a actividade do promotor de NF-kB em ambos os tipos de células numa maneira dose-dependente, que tinha um efeito inibidor maior sobre esta actividade em células SKCXCR2. Curiosamente, PD98059, um inibidor específico de Erk, não teve nenhum efeito significativo sobre a actividade do promotor de NF-kB em qualquer tipo de célula (Figura 4D). Confirmou-se os efeitos de inibidores específicos de EGFR, Akt e Erk activação (Figura 4E).

(a) Comparação da activação do EGFR em células de SKA e SKCXCR2. lisados ​​de células inteiras foram preparados e Western blot realizada utilizando anticorpos específicos para EGFR, Akt, Erk e as formas fosforiladas (pEGFR, PAKT e Perk). As formas não fosforiladas foram utilizados como controlos de carga. (B) padrões de coloração de imunofluorescência representativas que indicam a activação da Akt e os níveis de expressão de proteína em células CXCR2 SKA e SKCXCR2. (C) Efeitos comparativos de AG-1478, LY294002 e PD98059 sobre a proliferação celular em células SKA e SKCXCR2. As células foram incubadas com veículo (controle), AG-1478 (AG, 2 | iM), LY294002 (LY, 2 ^ M) ou PD98059 (DP, 20 uM) durante 48 h. O ensaio de proliferação celular foi realizado utilizando MTT e os valores foram normalizados para os controlos não tratados. * E # (p≤0,05) quando comparados aos controles (C) e as células SKA, respectivamente, pelo estudante de

t

-teste. efeitos (D) Dose-dependentes de EGFR inibidores jusante sobre as actividades da luciferase NF-kB em células SKA e SKCXCR2. Após a transfecção com NF-kB vector de luciferase durante a noite, as células foram tratadas com AG-1478 (inibidor de EGFR, 0, 0,5, 1 e 2 | iM), LY294002 (inibidor da Akt, 0, 0,5, 1 e 2 | iM) ou PD98059 (inibidor Erk , 0, 5, 10 e 20? M) durante 4 h. * E # (p≤0,05) quando comparados aos controles (0 h) e células ska, respectivamente, por Student

t

-teste. Todas as experiências foram realizadas pelo menos em triplicado e os dados são apresentados como média ± E.P. (E) Confirmação de inibidores específicos sobre EGFR, Akt e ativação Erk em células SKA e SKCXCR2. As células foram tratadas com AG-1478 (2 | iM), LY294002 (2 uM) e PD98059 (20? M) durante 4 h. Os lisados ​​celulares totais foram preparados e uma transferência de Western foi efectuada utilizando anticorpos específicos para o EGFR, Akt, Erk e as suas formas fosforiladas (pEGFR, e pAKT PERK). formas não-fosforilados foram utilizados como controle de carga.

CXCL1 Melhora a NF-kB Ativação na CXCR2 células que expressam o que aumenta CXCL1 Promotor Atividade através de uma NF-kB site

Para esclarecer o envolvimento de NF-kB de sinalização no eixo CXCL1-CXCR2, testámos os efeitos comparativos de CXCL1 adicionado na activação do NF-kB em células SKA e SKCXCR2. CXCL1 produzido IkB mais fosforilada em células em comparação com as células SKCXCR2 SKA (Figura 5A). Além disso, um anticorpo CXCL1 /2/3 não teve nenhum efeito sobre a actividade do promotor de NF-kB em células SKA mas diminuiu significativamente esta actividade em células SKCXCR2 (Figura 5B). Baseado no envolvimento de NF-kB no eixo CXCL1-CXCR2, comparou-se os efeitos de Bay11-7082, um inibidor de NF-kB, específico sobre a proliferação celular em células SKA e SKCXCR2. Bay11-7082 não teve nenhum efeito sobre a proliferação celular em células SKA mas diminuiu significativamente a proliferação de células SKCXCR2 (Figura 5C). A inibição foi maior em células de SKCXCR2, provavelmente devido à maior activação de NF-kB nestas células (Figuras 2A-C). Além disso, comparou-se os efeitos de Bay11-7082 sobre uma invasão celular induzida por CXCL1. Embora CXCL1 teve um pequeno efeito sobre a invasão de células em células SKA, as diferenças não foram significativas (Figura 5D). Por outro lado, as células SKCXCR2 tinha pelo menos uma duplicação do número de invasão de células em resposta a CXCL1 comparação com os controlos (Figura 5D). Bay11-7082 também bloqueou a invasão celular induzida por CXCL1 em ​​células SKCXCR2 (Figura 5D), que indica o envolvimento de sinalização de NF-kB.

(A) Efeitos comparativos de CXCL1 na activação do NF-kB em células SKA e SKCXCR2 . As células foram tratadas com CXCL1 (100 ng /ml) e os resultados analisados ​​de um modo dependente do tempo. Os lisados ​​celulares totais foram preparados e manchas de Western realizada usando anticorpos específicos para IkB, fosforilado IkB (pIκB) e CXCR2. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. β-actina foi utilizado como um controlo de carga.