Abstract

O cetuximab, um anticorpo monoclonal quimérico desenvolvido para a segmentação do Fator de Crescimento Epidérmico Receptor (EGFR), tem sido intensamente usado para tratar pacientes com câncer com câncer colorretal metastático e câncer de cabeça e pescoço. anticorpo intacta de imunoglobulina G (IgG) como cetuximab, no entanto, tem algumas limitações, tais como alto custo de produção e baixa taxa de penetração da vasculatura em massa tumoral sólida, devido ao seu grande tamanho. Na tentativa de superar essas limitações, nós engenharia cetuximab para criar fragmentos variáveis ​​de cadeia única (scFv-CH3; minicorpo) que foram expressas no sistema bacteriano. Entre três minicorpos modificados, verificou-se que MI061 minicorpo, a qual é composta da região pesada variável (V

H) e leve (V

L) unidas por um ligante peptídico de 18 resíduos, exibe uma maior solubilidade e uma melhor extracção Propriedades de lisado bacteriano. Além disso, nós validado que purificado MI061 interfere significativamente a ligação do ligando a fosforilação do EGFR e bloqueia de EGFR. Ao utilizar um composto de microarray da proteína 16,368 proteínas humanas originais abrangendo em torno das proteínas associadas 2400 da membrana plasmática tais como receptores e canais, que também demonstraram que MI061 só reconhece o EGFR, mas não outras proteínas, em comparação com o cetuximab. Estes resultados indicaram que tanto Engineered MI061 retém especificidade de ligação e afinidade para o EGFR de cetuximab. Embora tivesse uma meia-vida relativamente curto no soro, foi mostrado ser altamente significativo efeito anti-tumor por inibição da via da ERK em modelo de xenoenxerto de A431. Tomados em conjunto, nosso presente estudo fornece evidências convincentes de que engenharia minicorpo é mais eficaz e agente promissor para o

in vivo

segmentação de tumores sólidos

Citation:. Kim YP, Parque D, Kim JJ, Choi WJ, Lee SH, Lee SY, et ai. (2014) Abordagem terapêutica eficaz para o cancro principal e por um Engineered minicorpo Segmentação do EGFR receptor. PLoS ONE 9 (12): e113442. doi: 10.1371 /journal.pone.0113442

editor: Shaida A. Andrabi, Johns Hopkins University, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de julho de 2014; Aceito: 23 de outubro de 2014; Publicação: 01 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa em Ciência Básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência, TIC Planejamento Futuro (No. 2011-0030043 2012-R1A1A1013558). Este trabalho também foi apoiado em parte por uma bolsa da National R D programa de Controle do Câncer, Ministério da Saúde e Bem-Estar, Coreia (131.280). Sinil Pharmaceutical Company forneceu apoio sob a forma de salários para os autores YPK, SHL, WC, e JL. YL também recebeu salário da Samsung Instituto Avançado de Tecnologia (SAIT). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista. YPK, SHL, WC, e JL são funcionários da Sinil Pharmaceutical Company e recebeu o salário deles. YL é funcionário da Samsung Instituto Avançado de Tecnologia (SAIT) e também recebeu salário da SAIT. Não há produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) é uma das família ErbB de tirosina-quinases de receptores [1]. EGFR mediada pelo ligando de sinalização, como seja a PI3K /AKT ou via Ras /ERK regula diversos processos celulares, incluindo a sobrevivência celular, morte, crescimento, proliferação, e motilidade [2]. A desregulação do EGFR por sua sobre-expressão ou mutação leva ao desenvolvimento de uma ampla gama de cancros epiteliais, v.g. cancro da mama, cólon, cabeça e pescoço, rins, pulmão, pâncreas, próstata e [3] – [5]. Esta é uma razão para o desenvolvimento de interferente EGFR como agentes anti-tumorais no terapia do cancro [5]. Na década passada, duas principais classes de inibidores de EGFR foram desenvolvidos para atingir o EGFR. A primeira classe, os inibidores da tirosina quinase incluindo gefitinib e erlotinib, atua de forma competitiva a ligação para o bolso ATP de EGFR. A segunda classe, anticorpos monoclonais tais como o cetuximab e panitumumab, pode interferir ligação do ligando de EGFR [6], [7]. Ambas as classes de agentes exibem uma actividade antitumoral significativa numa gama de modelos de xenoenxerto de ratinho dependente de EGFR [7], [8]. Especialmente, cetuximab, um anticorpo monoclonal de segmentação de EGFR, tem sido intensivamente estudada como um agente anti-cancro aprovado pela FDA para o tratamento de cancro da cabeça e pescoço [9].

A terapia alvo utilizando IgG intactos como cetuximab tem nomeadamente melhorou mau prognóstico ea sobrevida global em pacientes com câncer [10]. No entanto, apesar da sua elevada eficácia anti-tumor, a utilização de IgG inteiras intactas para a terapia do cancro é limitada, devido aos custos de produção elevados, devido à exigência de um sistema de expressão de mamífero, e a taxa de penetração pobre em tecidos tumorais [11]. Daí, a necessidade imperiosa de anticorpo modificado produzido a partir de sistema bacteriano foi aumentado e um grupo de estudos introduziram várias estruturas de base de minicorpo projetada sobre a diversidade de IgG intacta [11], [12].

Para superar questões atuais, geramos fragmentos variáveis ​​de cadeia única (scFvs) expressa em

E.coli

baseado em anticorpo parental, cetuximab. Os scFvs modificados tem não só o fim do domínio de V

H e V

região L mas também ligante polipeptídico flexível composto por 18 resíduos de aminoácidos entre V

H e V

domínios L para a produção efetiva e estabilidade. O (a seguir minicorpo) região scFv estava conectado com C

H3

via e região da dobradiça. No presente estudo, o minicorpo engenharia (V

H-18Linker-V

L-dobradiça-C

H3) foi caracterizada

in vitro

e comparados com cetuximab por sua

in vivo

aplicação no modelo de xenotransplante.

Materiais e Métodos

Construção de MI045, MI053 e MI061 vetores de expressão

Para construir o MI045 (VL-ligante-VH ), os fragmentos de ADN que codificam domínio VL e VH foram sintetizados com base nas sequências de aminoácidos (1o-107o aa) da cadeia a do fragmento Fab Cetuximab (GenBank n. 1YY8_A) e as sequências de aminoácidos (aa 1o-119a) da cadeia B do fragmento Fab Cetuximab (de acesso do GenBank. 1YY8_B), respectivamente. As clássicas (G4S) 3 (sequências GGGGSGGGGSGGGGS) foram utilizados como um ligante [13]. A MI053 foi criado por um método similar com excepção de que o comprimento e as sequências do ligante, consistiu de 18 AA (GSTSGSGKPGSGEGSTKG) derivada de M218 Whitlow ligante [14]. A MI061 tem a mesma estrutura, em comparação com MI053 excepto fim domínio de VH e VL. O fragmento de ADN que codifica um domínio da dobradiça-CH3, também foi sintetizado com base nas sequências de aminoácidos de IgG-1 humana. A sequência de dobradiça foi modificado para 15 aa (EPKSPKSADKTHTAP). Os códons foram otimizados para

E. expressão coli

. Cada fragmentos de ADN scFv foram digeridos com

BamHI

e

HindIII

ea dobradiça-C

fragmento de DNA H3 digerido com

HindIII

e

XhoI

foram inseridos em pET26b. Estas construções continha a sequência líder pelB a extremidade N-terminal para a expressão periplasmática em BL21 (DE3), e continha resíduos de 6-histidina na extremidade C-terminal para a purificação por afinidade.

Expressão e purificação de minicorpo

Cada construção codifica para MI045, MI053 e MI061 foi transformado em

e. coli

BL21 (DE3). colónias que cresceram foram cultivados a 37 ° C durante a noite com agitação vigorosa, e, em seguida, 1 ml desta pré-cultura foi inoculada em 1 L fresco caldo LB. A expressão de proteínas foi induzida pela adição de IPTG a uma concentração final de 0,4 mM quando a densidade óptica a 600 nm atingiu 0,5-0,6. As culturas foram colhidas e ressuspensas com 100 ml de tampão PBS contendo 1 mM de PMSF, 0,2 mg /ml de ADNase I, e de 0,2 mg /ml de RNase A, e em seguida rompidas por sonicação. Os extractos de proteínas solúveis foram obtidas por centrifugação a 20.000 rpm durante 20 min a 4 ° C e incubou-se com o NI

2 + -NTA coluna de resina (GE Healthcare Life Science, EUA) de acordo com o manual do fornecedor. A coluna foi lavada com 30 volumes de coluna de PBS contendo 50 mM de imidazole, e, em seguida, as proteínas ligadas foram eluídas com 10 volumes de coluna de PBS contendo imidazole 400 mM. As proteínas purificadas foram analisadas por 12% SDS-PAGE. As concentrações de proteína foram determinadas pelo método do ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL, EUA)

Proteína humana microarray

proteoma Microarray HuProt humano foi adquirido a partir de laboratórios CDI (http: //. www.cdi-lab.com). O chip inclui 16,368 full-length proteínas únicas humanos recombinantes em duplicado, juntamente com várias proteínas de controlo, tais como IgG, GST, a BSA-biotina, e histonas, como descrito anteriormente [15]. Antigen especificidade de ambos minicorpo e cetuximab ligação (Erbitux, Merck, Darmstadt, Alemanha) foram medidos usando Alexa-Fluor 546 anticorpo, ou 647 de IgG anti-humano conjugado (Invitrogen, Carlsbad, CA). anticorpo monoclonal anti-GST de rato (Invitrogen) foi utilizado como controlo. Resumidamente, o chip de proteína foi incubado primeiro com tampão de bloqueio (BSA a 5% em PBS com 0,05% (v /v) de Tween 20) durante 30 min à TA e depois minicorpo (32 nM), cetuximab (32 nM) ou anti-rato anticorpo monoclonal GST foram ainda incubadas sob a lifterslip (Thermo Scientific, EUA) durante 1 h à TA. Depois de se lavar três vezes com 1x de PBS contendo 0,05% de Tween 20, por agitação suave durante 10 min cada, a micromatriz foi incubada com anticorpo conjugado com Alexa Fluor. Subsequentemente, o micro-arranjo foi lavado três vezes e, em seguida, os valores de sinal de sonda foram obtidos utilizando um software GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

cultura celular e reagentes

O A431 células (KCLB, Seul, Coreia) foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco, Karlsruhe, Alemanha) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, Logan, UT, EUA), 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina ( Sigma, St. Louis, MO, EUA). As células foram cultivadas a 37 ° C, 5% de CO

2 numa atmosfera humidificada.

análise citométrica de fluxo para a ligação do anticorpo de ensaio

Para confirmar cetuximab, MI053 e MI061 ligação a EGFR , citometria de fluxo foi realizada utilizando a linha celular A431, que expressa elevados níveis de EGFR. Um total de 1 × 10

5 as células foram incubadas com cetuximab, MI053 ou MI061 a 2 ug /ml durante 30 minutos em gelo e lavadas duas vezes com tampão de coloração (1% de BSA /PBS), seguida por uma incubação de 30 minutos com 4 ug /ml de uma cabra marcado com FITC anti Fc mAb humano (Sigma). As células foram analisadas por um citómetro de fluxo Accuri C6 (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA).

O ensaio de ligação competitiva

As células A431 foram ajustadas para 1 x 10

5 células /tubo e incubou-se ligando EGF contendo 6 nM marcado com FITC (Molecular Probes, Leiden, Holanda), mais os competidores frios relevantes, que são cetuximab e MI061 (2 ug /ml) durante 30 min a 4 ° C. A seguir lavou-se três vezes para remover os materiais não ligados, as células foram analisadas por um citómetro de fluxo Accuri C6 (BD Biosciences) para determinar a quantidade relativa de EGF marcado com FITC ligado.

Imunoensaio

Os 96 poços imunoplaca (SPL, Seoul, Coreia do Sul) foram revestidas com sEGFR (Fitzgerlad Industries International, MA, EUA), reconstituída em na 200 mM

2CO

3 (pH 9,6). A placa foi bloqueada com 200 ul /poço de solução de bloqueio 1X (Sigma), selados e armazenados a 4 ° C até à sua utilização. As diluições do cetuximab (a partir de 2 mg /ml) foram preparadas numa gama de 1:10-1:4096000 por diluição em série com PBS para a curva padrão. Para imunoensaio de actividade minicorpo, o plasma diluído (01:50) foi adicionado a cada poço e a incubada à temperatura ambiente durante 1 h. Em seguida, cada poço foi lavado três vezes com PBS-T (solução salina tamponada com fosfato com 0,05% de Tween 20) e 100 ul /poço de anticorpo de ratinho anti-1:100 IgG humana (C

domínio H3) (Thermo Scientific, Rockford , IL, EUA) foi adicionado. A cada poço foi incubado durante 1 h e, em seguida, foi adicionada IgG anti-ratinho de HRP de anticorpo secundário (Sigma). Para avaliar a concentração no plasma minicorpo, a cada poço foi lavado três vezes com PBS-T e anticorpos específicos de coelho anti-IgG humana de Fab (Sigma) foi incubado durante 1 h, juntamente com anti-coelho de IgG HRP (Sigma) secundário. Após lavagem com PBS-T, com 100 uL /​​poço de substrato de TMB (Sigma) foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 10 min à temperatura ambiente. A reacção foi interrompida por 1 MH

2SO

4 e a placa foi então lida num leitor de placas a 450 nm.

Para determinar a meia-vida de MI061, as amostras de sangue foram recolhidas a 1 , 3, 6, 24 e 48 horas após a injecção inicial (ip, 0,3 mg /rato) e amostras de plasma heparinizadas foram separadas imediatamente através de centrifugação (13000 rpm durante 5 min a 4 ° C). A concentração de minicorpo foi estimada usando métodos não compartimentais com a BA Calc 2007 (KFDA, Seul, Coreia do Sul).

ensaio de fosforilação

ensaios de fosforilação foram realizados em células A431 na presença de qualquer um cetuximab Fab (30 ug /ml) ou minicorpo (30 ug /ml). Após cultura durante 8 horas, as células foram estimuladas com 10 ng /ml de EGF durante 20 min a 37 ° C. As células foram lisadas e os níveis de proteína de EGFR fosforilados foram medidos utilizando o sanduíche PathScan fosfo-receptor de EGF (Tyr845) ELISA Kit (sinalização celular) de acordo com as instruções do fabricante.

modelo de xenoenxerto

Six para atímicos macho de sete semanas de idade camundongos (nu /nu) foram adquiridos de Nara biotecnologia (Seul, Coréia). Os ratos foram alojados em condições livres de patógenos em gaiolas microisolator com comida de laboratório e água disponível

ad libitum

. xenoenxertos A431 foram estabelecidas por s.c. injectar entre 5 × 10

6 células /100 ul de PBS no flanco esquerdo de ratinhos atímicos. O volume do tumor foi calculado a cada 2-3 dias com um calibrador digital e utilizando a seguinte fórmula: Volume = comprimento x largura x altura. Os tumores foram deixados crescer para um volume de 100 milímetros

3, e os ratinhos foram divididos aleatoriamente em grupos de seis animais cada. Os ratinhos foram tratados com solução salina Q3D, cetuximab a 0,25 mg /rato (Q3D), cetuximab Fab a 0,25 mg /rato (Q3D), e MI061 a 0,25 mg /rato (q7d). Todos os medicamentos foram administrados por injecção i.p. injecção. O tratamento dos animais foi mantida durante a duração do estudo. No final de cada ponto de tempo, os ratos foram sacrificados com CO

2 asfixia. A análise estatística do crescimento do tumor para cada um dos estudos foi determinada por um

Student

‘

s o teste t

utilizando o programa de computador SigmaStat (Jandel, San Rafael, CA, EUA). Os ratos foram mantidos de acordo com as políticas do Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Konkuk (IACUC). O estudo aqui realizado foi aprovado pela University IACUC Konkuk (Aprovação No .: KU14024).

Immunohistochemisry (IHC)

tecidos tumorais extraídos foram preservados em formalina a 10% tamponada neutra para a coloração IHC. procedimentos de coloração IHC para EGFR total foram como se segue: A parafina foi esgotado de uma corrediça e incubadas com solução de pepsina durante 15 min a 37 ° C. As secções de tecido foram cobertas com 3% H

2O

2 para bloquear a peroxidase endógena durante 10 min à temperatura ambiente. As lâminas foram incubadas com anticorpo anti-EGFR em 1:100 (Cell Signaling Technology, IL, EUA) durante 18 horas a 4 ° C. Após a lavagem com TBS, as lâminas foram incubadas com um anticorpo secundário (DAKO Japão, Quioto, Japão) durante 30 min à temperatura ambiente. coloração de tecido foi visualizado utilizando uma solução de substrato cromógeno DAB (3,3’diaminobenzidine). coloração IHC para a proteína EGFR fosforilado foi realizada como se segue: Após o mesmo pré-tratamento de anticorpo anti-EGFR tal como descrito acima, as secções de tecido foram bloqueadas com bloco de proteína para evitar reacções não específicas durante 10 min à temperatura ambiente sem soro. As lâminas foram incubadas com anticorpo primário de p-EGFR (Tyr845) a 1:50 (A sinalização celular) durante 18 hrs a 4 ° C. As lâminas foram então incubadas com o anticorpo secundário (DAKO Japão) durante 15 min à temperatura ambiente. coloração de tecido foi visualizado utilizando uma solução DAB substrato cromogénio. As lâminas foram então contrastadas com hematoxilina, desidratadas, e montado.

Western blot análise

Para a análise western blot de MI045 purificado (0,23 g /pista), MI53 (0,55 ug /pista) e MI061 (1,30 ug /pista), as amostras de proteína foram inicialmente separados em 12% de gel SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose (Thermo Scientific, EUA). A membrana foi imunotransferidas com anticorpo primário anti-C

anticorpo de domínio H3 A567H (Thermo Scientific, EUA) e cada proteína foi visualizada por incubação com anticorpo de IgG anti-ratinho secundário conjugado com HRP. Para verificar os níveis de expressão de EGFR, p-EGFR, p-AKT, ERK e p-ERK em células de tumor por análise de Western blot, massas tumorais foram removidos a partir do flanco dos ratinhos e homogeneizada. As amostras de proteínas que contenham a mesma quantidade de proteínas totais (40 ug /poço) foram extraídos e separados em 12% de gel de SDS-PAGE e depois transferidos para uma membrana de nitrocelulose. Os anticorpos primários, receptor de EGF (sinalização celular), receptor de fosfo-EGF (Tyr1068) (sinalização celular), AKT pS473 (Rockland), p44 /42 MAPK (/2 Erk1) (de sinalização celular) e fosfo-p44 /42 MAPK (ERK1 /2) anticorpo (Thr202 /Tyr204) foram usadas para imunotransf erência de acordo com a proporção recomendada do fabricante (1:1000). A membrana foi desenvolvido e visualizada utilizando Pierce ECL Além disso Western Blotting Substrato (Thermo Scientific, EUA).

Resultados

Expressão e caracterização de minibodies engenharia

Esta minicorpo consiste basicamente de o V

H e V

domínios L unidos por um ligante peptídico flexível, o que pode afetar a estabilidade e solubilidade do anticorpo, e eles estavam ligados a C

H3

via e região da dobradiça. Aqui, geramos três minibodies que compreendem comprimento diferente de ligante ou inversamente ordenou V

H e V

domínios L (Fig 1A). O primeiro minicorpo que tem relativamente curto ligante foi chamado MI045 e outro minicorpo foi nomeado MI053 que têm 15 ou 18 resíduos como um ligante, respectivamente. Último consiste em V trocou

H e V

domínio L, e nomeado MI061. Para explorar a natureza das três minibodies engenharia, expressão de cada minicorpo foi testado em

E. coli

como descrito por Hu et ai. [16]. fração solúvel da

E. coli

lisado aplicado a cromatografia de afinidade e resultou na recuperação de minicorpos altamente purificadas sem qualquer fragmentações no western blot (Fig 1B). Cada minicorpo mostrou o peso molecular estimado, e a taxa de recuperação de MI053 e MI061 mostrou 3.4 ou 4.4 dobras maior do que MI045, respectivamente. Estes dados indicam que 18 resíduos de ligante são de fato estruturalmente modelo adequado de 15 resíduos de reter solubilidade. Curiosamente, verificou-se que a eficiência de recuperação de MI061 é maior do que MI053 (Fig 1B). Estes dados indicam que o comprimento do ligante e da ordem de domínio variável de cadeia, que por sua vez afectam a solubilidade do anticorpo, estão associados com a natureza do minicorpo.

(A) Representação esquemática de construções que codificam cada minicorpo. (B) Purificação de His-marcado minicorpo de

E. coli

. As células BL21 (DE3) foram transformadas com cada construção e produção minicorpo foi induzida pela adição de IPTG. His-tag minicorpos foram purificadas utilizando uma coluna Ni-NTA. As proteínas eluídas foram resolvidas por 12% SDS-PAGE e visualizados por Coomassie Brilliant qualquer ensaio de imunotransferência azul (CBB) ou com um anticorpo anti-domínio CH3. Os números indicam taxa de recuperação em comparação com MI045. M; marcador de tamanho molecular, 1; extrato bruto, 2; proteínas solúveis, 3; pellet, 4; fluir através, 5; lavagem com imidazole 50 mM, 6; eluição com imidazole 400 mM, WB; western blot.

Atividade e especificidade de minibodies engenharia

Com base no rendimento de recuperação de cada minicorpo de ligado bacteriano, tanto MI053 e MI061 foram selecionados para o estudo adicional. Para medir a sua actividade dependendo da orientação de domínio de regiões variáveis, inicialmente avaliada sua actividade de ligação a EGFR. células A431 que expressam EGFR alto nível de foram incubadas com anticorpos, e a subsequente alteração do sinal de fluorescência foi medido por uma análise de citometria de fluxo de laser baseado. Por conseguinte, todos os anticorpos tratados provocou uma mudança no sinal de fluorescência maior do que a do controlo não tratado (Fig 2A). Entre eles, cetuximab apresentou a maior actividade de ligação a EGFR. Particularmente, constatou-se que MI061 e MI053 também retida elevada afinidade e eram capazes de ligação forte ao EGFR. A afinidade entre MI061and EGFR era mais forte do que a afinidade entre MI053 e EGFR. Estes dados indicaram que a ordem de domínio variável das cadeias está associada com afinidade de minicorpo. Uma abordagem alternativa para se obter a especificidade, o ensaio de competição foi realizado utilizando um ligando de EGF marcado com FITC com o conceito de que a interferência da interacção entre o EGFR e o EGF pode inibir a activação do EGFR e a sua via de sinalização a jusante. Como resultado, o cetuximab foi inteiramente competiu com o EGF, enquanto que o tratamento de MI061 parcialmente inibiu a ligação com o EGFR (Figura 2B). Para confirmar a capacidade inibidora de MI061, analisou-se a taxa relativa de fosforilação do EGFR (Fig 2C). taxa de fosforilação de EGFR induzida por EGF foi analisada em células A431 na presença de qualquer fragmento Fab cetuximab (CT Fab), EGFR regiões do cetuximab, ou MI061 vinculativo. O tratamento de EGF com CT Fab suprimida fosforilação relativa a cerca de 50%. Da mesma forma, o tratamento de EGF com MI061 também apresentaram o mesmo efeito, em comparação com o CT de Fab. Embora a sua afinidade de ligação e especificidade foram relativamente menor em comparação com o cetuximab, MI061 foi capaz de reconhecer o EGFR e fortemente suprimir a fosforilação do EGFR no sistema celular. Para validar a especificidade de ligação ao antigénio de MI061, utilizou-se o chip de microarray da proteína humana, que contém 16,368 únicas proteínas humanas de comprimento completo marcado com GST (Fig 3A). O chip de proteína foi tratado em paralelo com qualquer MI061 ou cetuximab em proporção molar igual durante 1 h à TA. As proteínas de ligação com o anticorpo foram detectados utilizando anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor. O chip foi então digitalizado usando um scanner GenePix 4100A. Para normalizar o sinal Alexa Fluor-, o chip de proteína foi então sondada com um anticorpo anti-GST, seguido por varrimento. No chip de microarray cada proteína, tanto MI061 e cetuximab mostrou padrão de ligação semelhante em duplicado com mesma intensidade, respectivamente (Fig 3B). Além disso, em uma visão elevada potência, eles só ligação às proteínas EGFR, exceto para as proteínas de controle tais como GST (Fig 3B, painel inferior).

(A) ensaio de ligação EGFR. Cada anticorpo foi incubado com A431cells overexpressed-EGFR e, em seguida, afinidade de ligação a EGFR foi analisada pela intensidade FL1-H utilizando citometria de fluxo ensaio de competição (FACS) (B) de EGFR. EGF marcado com FITC foi incubada com as células A431 e a sua actividade de ligação a EGFR foi monitorizada por FACS. Para o ensaio de competição, o EGF foi células incubadas juntamente com quer o cetuximab (painel da esquerda) ou MI061 (painel da direita). ensaio de fosforilação (C) de EGFR. A taxa de fosforilação relativa de EGFR induzida por cada anticorpo foi avaliada por ELISA, utilizando um anticorpo fosfo-anti-EGFR. O EGF foi usada como um controlo para a fosforilação do EGFR, tal como indicado. quantificados dados são expressos como média ± s. e. m.

* P 0,05. n.s, não significativo.

(A) Ilustração esquemática do processo de microarray da proteína. (B) Os chips de proteína foram incubadas com MI061 ou cetuximab, e interacções antigénio-anticorpo foram detectados utilizando anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor. Após a lavagem, cada chip foi verificada pelo GenePix Scanner a 532 nm (Cy3) e 635 nm (Cy5). Cada valor dos sinais da sonda foi obtido usando o software GenePix Pro 6.0. sinal vermelho indica intensidade ligação ao antígeno de ambos MI061 e cetuximab. Todas as proteínas de fusão GST foram detectados por anticorpos anti-GST e visualizados por fluorescência verde como indicado. retângulos brancos indicam a área de ampliação para painel inferior.

efeito antitumoral de minicorpo engenharia

Para avaliar e caracterizar as farmacocinética plasmática (PK) de MI061, parâmetros farmacocinéticos foram examinados em xenotransplante animal. Após a injecção intraperitoneral (ip) de MI061 com 0,3 mg /injecção, o C (no máximo), t (max), a área sob a curva (AUC) e t

1/2 foram medidos quanto 14,4 mg /L, 1 hr , 24,8 mg • h /L e 4,3 horas, respectivamente (Fig 4A). De acordo com os dados de PK MI061, o efeito antitumoral de MI061 foi monitorizada no modelo de xenoenxertos A431. Cada um dos ratos foi tratado durante 22 dias a partir de 13

th pós-transplante dia através i.p. injecção com cetuximab, CT Fab por cada 3 dias, ou MI061 por uma base diária sobre a atividade PK. A injecção de anticorpos não afectar o ganho de peso corporal de ratinhos xenoenxertados com tumores A431 (Fig S1C). O tamanho do tumor foi medido com compassos de calibre de abordagem superfície. O tamanho do tumor no grupo tratado com veículo exibiram um aumento linear ao longo do período de 22 dias e o tamanho atingiu cerca de 1,200 milímetros

3 (Figura 4B). A injecção de cetuximab ou MI061 suprimiu o crescimento de tumores de 300 mm

3. Embora MI061 foi injectado mais vezes do que outros anticorpos, que mostrou um efeito anti-tumoral significativa como cetuximab. Cada massa tumoral aumentada de xenoenxerto foi extraído a partir dos ratinhos para medir o volume relativo do tumor (Figura 4C). Curiosamente, a injecção de ratinhos xenoenxertados MI061 em notavelmente suprimida do volume do tumor a 25% em comparação com o grupo tratado com veículo (Fig 4D). Assim, MI061 mostrou efeito anti-tumoral semelhante em comparação com o grupo de cetuximab tratar

in vivo

. No geral, estes dados suportada que MI061 purificada a partir do sistema bacteriano pode ser usada para a aplicação clínica como um agente anti-tumoral.

(A) Farmacocinética de MI061 minicorpo. As amostras de sangue para a farmacocinética de MI061 foram recolhidas a 1, 3, 6, 24 e 48 horas após a injecção intraperitoneal inicial (i.p., 0,3 mg /rato) e a sua concentração foi estimada utilizando métodos não-compartimento. (B) o tempo de curso da alteração do tamanho do tumor. ratinhos nus atímicos foram tratados com veículo ou com cetuximab ou com cetuximab Fab a cada 3 dias, ou com minicorpo por dia durante 10 dias, por injecção i.p. (0,25 mg /ratinho). O tratamento foi iniciado quando o tamanho do tumor atingiu 100 mm

3 após xenotransplante. O tamanho do tumor foi medido com compassos de calibre durante os dias da experiência. (C) resultados representativos de massas tumorais A431. (D). o volume relativo do tumor. O tamanho de massas tumorais A431 removidos de ratinhos atímicos tratada cada anticorpo foi medido com compassos de calibre, e foi indicado como volume relativo em comparação com o grupo tratado com cetuximab. quantificados dados são expressos como média ± s. e. m.

* P 0,05

O efeito da minicorpo engenharia na via de sinalização a jusante EGFR

Os níveis de EGFR e fosforilada-EGFR (p-EGFR) de expressão foram analisados ​​a partir A431 secções de tumores, como mostrado na Figura 5A. Em comparação com o grupo veículo, as intensidades de coloração de ambos o EGFR e p-EGFR foram notavelmente diminuída no anticorpo tratados todos os grupos. Para obter o efeito MI061 na via de sinal a jusante de EGFR, cada massas tumorais foram lisadas. Eles foram analisadas para o estado de activação de moléculas de sinalização a jusante, seguida por activação do EGFR. Semelhante à imuno-histoquímica de dados contra EGFR e p-EGFR, verificou-se que o nível de expressão de EGFR foi significativamente reduzida no grupo tratado tanto CT Fab ou MI061 (Fig 5B). Além disso, os níveis de ambos p-EGFR e p-ERK só foram completamente suprimidos no grupo tratado com MI061, mas não no outro grupo (Fig 5B). Em contraste, a CT de Fab única fosforilação de AKT inibida (Fig 5B). Estes dados sugerem que a TC MI061 Fab e pode estar envolvido na via de sinal a jusante, diferente, apesar de um efeito inibitório semelhante na fosforilação do EGFR

In vivo

. Tomados em conjunto, estes resultados demonstraram que a maior eficácia anti-tumor de MI061 comparação com cetuximab no modelo de xenoenxerto A431, suportando a relevância dos estudos adicionais para a utilização de MI061 para entregar agente anticancerígeno

In vivo

.

(A) A fosforilação do EGFR. O EGFR fosforilado de secção congelada de tecido de tumor A431 foi analisado por coloração imunohistoquímica utilizando p-EGFR (845 Tyr) anticorpo. Barra de escala = 200 um (B) EFGR via de sinalização a jusante em lisado de tumor foi analisada por Western blot utilizando cada um dos anticorpos, tal como indicado. β-actina foi usado como um controle de carga.

Discussão

terapias alvo-tumoral utilizando IgG inteira intacta têm sido intensamente estudadas para pacientes com câncer em inúmeras pesquisas e levou a uma onda de anticorpos aprovados pela FDA [6] – [10]. Assim, os resultados notáveis ​​foram alcançados na terapia do câncer, mas ainda existem algumas limitações ao uso IgG inteira ao tratamento em pacientes com câncer. Estes incluem custos extremamente elevados de produção e farmacocinética contra penetração nos tecidos [17], [18]. De modo a ultrapassar estas desvantagens, os investigadores têm sido tentados para reduzir o tamanho de anticorpo para a produção eficaz em sistema bacteriano e aumentar a taxa de penetração do anticorpo para a terapia eficaz [16], [19]. No presente estudo, nós também gerou três minibodies derivados de Cetuximab e examinou características e efeito anti-tumoral deles

in vitro

e

in vivo

.

Muitas tentativas foram empreendido para gerar anticorpos para utilização terapêutica humana em células de mamíferos. No entanto, as células de mamífero transfectadas não são preferidos como um sistema de expressão, devido ao baixo nível de expressão, o crescimento lento e meios nutrientes dispendiosos [20]. Estes problemas podem ser tratados utilizando uma

E. coli

sistema de expressão para a produção de grandes quantidades de proteína recombinante. Embora existam algumas limitações, como a acumulação intracelular, o potencial para a degradação do produto e produção de endotoxinas, tem sido amplamente utilizado para a produção de proteínas recombinantes devido à sua capacidade de crescer rapidamente, a uma densidade elevada em substratos de baixo custo e de manipulação relativamente simples [20] . produção Além disso, as várias técnicas recombinantes têm activada de fragmentos de anticorpos com vários tamanhos de [11], [16], [19], [21]. Minicorpo (scFv-C

H3), um deles, podem ser expressos em sistema bacteriano e seu pequeno tamanho e baixo peso molecular permitem a penetração do tecido fácil e rápido [22]. Apesar da tecnologia melhorada e pesquisa pesado, no entanto, ainda há limitações quanto a produtividade e a estabilidade térmica do minicorpo [22]. Geralmente, os scFvs apresentam baixa estabilidade térmica e tendem a desnaturar-se ou agregar-se sob as condições de utilização clínica devido ao relativamente fraco V

H-V

G interacção [22]. Para conquistar baixa estabilidade, alguns pesquisadores se concentraram em comprimento do ligador, alongamento do resíduo em vinculador ligeiramente maior estabilidade dos scFvs [23]. Também testámos a estabilidade térmica de ambos MI045 e MI053 e descobriram que MI053, que tem 18 resíduos como um agente de ligação, é mais estável, em vez de MI045 durante 48 horas (Fig. S1d e Materiais e Métodos S1).