Abstract

epitelial molécula de adesão celular (EpCAM), uma célula-tronco do câncer (CSC) marcador é mais expresso em cancros epiteliais e no retinoblastoma (RB ). Nós fabricado um EpCAM segmentação quimera aptâmero-siRNA e investigada a sua propriedade anti-tumoral e EpCAM domínio intracelular (EpICD) a sinalização mediada no cancro epitelial. A eficácia anti-tumoral de EpCAM aptâmero-siEpCAM quimera (EpApt-Siep) foi avaliada por qPCR, transferência de Northern e Western na linha de células Weri-Rb1- RB, as células tumorais RB primários e na linha de células de cancro da mama MCF7-. A actividade anti-tumoral de EpApt-Siep foi estudada

in vivo

usando câncer (MCF7) modelo de camundongos xenotransplante epitelial. O mecanismo e as vias envolvidas na actividade anti-tumoral foi adicionalmente estudado utilizando arrays de proteínas e qPCR. EpApt-Siep quimera foi processado

in vitro

pela enzima dicer. O tratamento das células weri-Rb1 e MCF7 com EpApt-Siep revelou regulação estatisticamente significativa para baixo de expressão de EpCAM (P 0,005), e a concomitante redução na proliferação celular. Em células RB primárias cultivadas a partir de tumores RB, EpApt-Siep silenciados EpCAM, inibiu significativamente (P 0,01) a proliferação celular e a citotoxicidade induzida. Knockdown de EpICD expressa em tumores primários RB levaram à repressão dos marcadores de pluripotência, SOX2, OCT4, NANOG, e CD133.

In vivo

estudos mostraram regressão do crescimento tumoral completa sem qualquer toxicidade em animais (P 0,001) e tecidos tumorais mostrou regulação negativa significativa (P 0,05) de EpCAM, MRP1, ABCG2, stathmin, survivina e regulação positiva de ATM ( P 0,05) que conduz à apoptose por via intrínseca com alteração menor na citocinas. Nossos resultados revelaram que EpApt-Siep potencialmente erradicada EpCAM positiva células cancerosas através da supressão marcador CSC e apoptose, enquanto poupadores EpCAM células normais adjacentes negativos

Citation:. Subramanian N, Kanwar JR, Kanwar RK, Sreemanthula J, Biswas J , Khetan V, et al. (2015) Metas EpCAM Aptamer-siRNA Quimera e regridem cancro epitelial. PLoS ONE 10 (7): e0132407. doi: 10.1371 /journal.pone.0132407

editor: Vittorio de Franciscis, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), ITÁLIA

Recebido: 08 de outubro de 2014; Aceito: 14 de junho de 2015; Publicação: 15 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Subramanian et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão disponíveis no papel. Além disso, as imagens-primas utilizadas para a montagem de figuras são depositados em Figshare. (Link: figshare.com/s/cb264ee0178b11e5be5906ec4b8d1f61)

Financiamento: Este trabalho foi apoiado pelo BARC-2010/35/19 /BRNS e em parte do suporte-subvenção /Indo-Aus /06/08/2011 e COE-Grant BT /01 /CE1B /11 /-programa de 16 BT /V Departamento de em biotecnologia Indo-australiana sobre RB

Conflito de interesses.: os autores declaram que não existem interesses conflitantes.

Introdução

molécula de adesão celular epitelial (EpCAM) é uma célula-tronco do câncer conhecido (CSC) marcador expressa na superfície celular e considerado como um tumor antígeno associado [1]. EpCAM é sobre-expressos em tumores epiteliais, tais como câncer de mama e câncer de olho na infância, tais como retinoblastoma (RB) [2-4]. EpCAM está associada com aumento da proliferação, migração e invasão, tanto câncer de mama e RB [5, 6] proteína .EpCAM é diferenciado em domínio extracelular (EPEX), domínio transmembrana (EPTM) e domínio intracelular (EpICD). Ela desempenha um papel vital na sinalização oncogénica por proteólise de EpCAM e EpICD translocação para o núcleo, [7, 8] .Proteolysis de EpCAM leva EpICD para formar withFHL2 complexo, β-catenina e LEF1. Este complexo liga-se a theLef1 local de ligação dos genes alvo e modulam a sua transcrição [7] .EpICD é conhecido para ocupar a região do promotor e regular positivamente SOX2, OCT4 e NANOG que contribui para a auto-renovação e pluripotência das células cancerosas [9].

EpCAM é considerada como um alvo terapêutico ideal para o tratamento de cancro devido à diferença na sua distribuição espacial entre células normais e cancerosas. EpCAM é sobre-expresso na superfície apical das células tumorais [10] e minimamente na superfície basolateral de células epiteliais normais e as mutações não tenham sido descritas em EpCAM [11] medida em células cancerosas. Vários anticorpos anti-EpCAM como edrecolomab e adecatumumab foram gerados para alvejar o cancro e estudado em ensaios clínicos [12]. Para melhorar ainda mais o potencial terapêutico de segmentação de EpCAM, aptâmeros com maior especificidade e afinidade mais elevada foram procurados [13].

Os aptâmeros são oligonucleótido sintético (ARN /ssDNA) ou de moléculas de péptidos que se ligam a um alvo específico com elevada afinidade devido às suas estruturas tridimensionais [14]. Eles são sintetizados a partir de vastas bibliotecas moleculares por um processo de seleção chamada “evolução sistêmica de ligantes por enriquecimento exponencial» (SELEX) [15, 16]. Ambos os aptâmeros de ARN e ADNcs foram desenvolvidos contra a EpCAM superfície da célula [13, 17]. Desde EpCAM ARN aptâmero foi demonstrado que são internalizadas por endocitose, seria capaz de entregar siRNA na célula após a quimerização. Várias estratégias quimeriza�o aptamer-siRNA foram estudados para alvejar as células cancerosas. aptâmeros de ARN contra marcadores de superfície tais como o PSMA, EGFR, BAFF-R, integrinas e aptâmero de ADN contra a nucleolina foram relatados para a entrega de siRNA em vários modelos de cancro (resumidos em S1 Tabela).

A funcionalidade de aptâmero siRNA quimérico construções poderiam ser explicados em três passos, tais como (i) de ligação e internalização, (ii) o processamento Dicer e silenciamento (iii) ARNi mediado [18]. Anteriormente, demonstramos o direccionamento específico de RB usando aptâmero-doxorrubicina (EpDT3-DOX) que se liga EpCAM superfície celular para entregar doxorrubicina [19]. Aqui, pela primeira vez, nós construímos RNA EpCAM aptâmero-EpCAM siRNA quimera (EpApt-Siep) para atingir alvo silenciamento de genes EpCAM em células positivas EpCAM. Nós também relatam pela primeira vez que EpICD é sobre-expresso em RB, e derrubando EpCAM leva à diminuição da regulação de marcadores CSC como SOX2, OCT4 e expressão NANOG. Também realizamos

in vivo

estudos utilizando modelo de xenoenxerto em ratinhos nu com linha de células do cancro da mama MCF7, como uma prova de conceito para cancros epiteliais sólidos que expressa EpCAM. alta atividade anti-tumoral foi alcançada usando o nosso construção quimérica EpApt-Siep sem toxicidade. Além disso, estudamos o mecanismo envolvido na morte celular e inibição da proliferação celular nos xenoenxertos tumorais, investigando as moléculas apoptóticos e citocinas completas utilizando matrizes de proteína.

Métodos

Fabricação de construção quimérica e

In vitro

dicer clivagem ensaio

EpApt-Siep foi construído como descrito no Dassie

et

.,

al

. 2009 [20]. A estrutura secundária do construto foi estudada pela estrutura de ARN v5.3 [21] e o software MFOLD [22]. As construções concebidas foram comercialmente sintetizados por Dharmacon Inc. (Life Sciences GE, Lafayette, CO).

In vitro

ensaio Dicer foi realizada para mostrar que EpApt-Siep quimera está a ser processada pela enzima Dicer para a libertação de siRNA do aptâmero quimérico utilizando kit recombinante dicer (recombinante Humana dicer Enzyme kit Cat no: T510002) seguindo as instruções do fabricante. Os produtos reagiram foram submetidas a electroforese e analisadas por transiluminador UV (protocolo detalhado fornecido no arquivo S1).

As linhas celulares e cultura e células RB primária aptâmero estudo captação

linha RBcell Humano (Weri-Rb1) , linha de células de cancro da mama (MCF7) comprado de banco de células Riken, RIKEN Bioresource Center (Ibaraki, Japão) foi incluído no estudo. As linhas celulares estavam livres de contaminação por micoplasma, como foi verificado pela procura de Mycoplasma kit (Sigma Aldrich, Bangalore). MCF7 células andWERI-Rb1 foram cultivadas em modificação do meio de Eagle (DMEM) e Rosewell estacionar memorial media Institute (RPMI-1640) mediarespectively com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Gibco, Life Technologies, Bangalore, Índia) de Dulbecco. Todas as linhas celulares foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera de 5% das amostras de tumor de CO2 incubator.RB de bolas do olho enucleados foram recolhidas como parte da terapia e utilizado para fins de pesquisa de forma anónima. A autorização escrita geral foi obtido dos pais /responsáveis ​​da enucleação paciente submetido. O estudo foi realizado em conformidade com a Declaração de Helsinki, na Fundação Vision Research, depois de obter a aprovação de Ética Sub-Comité (Institutional Review Board) do hospital de olhos Sankara Nethralaya [apuramento Ética. não. 240-2010-P]. células de tumor RB primários obtidos a partir dos olhos enucleados foram dissociadas por trituração manual e cultivadas em meio RPMI contendo 20% de FBS. RPMI e meio DMEM foram adquiridos da Sigma Aldrich (Sigma Aldrich, Bangalore). Captação de FITC EpApt-Siep por MCF7 e as células Weri-Rb1 foi estudada usando citometria de fluxo e microscopia seguindo o protocolo fluorescente fornecida no arquivo S1.

Em

eficácia in vitro de EpApt-Siep na célula linhas

A eficácia da EpApt-Siep foi avaliada

in vitro

usando MCF7 e linhas celulares weri-Rb1. Resumidamente, 2×10

5 as células foram tratadas com EpApt-Siep ou transfectadas com siEpCAM durante 48 horas, isolamento de ARN, seguida por transferência de Northern, qPCR para a análise ARNm e transferência de Western para os níveis de proteína (S1 do ficheiro).

Quantitative PCR em tempo real, norte e oeste blotting

Para analisar o efeito da siEpCAM e EpApt-Siep na expressão EpCAM, qPCR e transferência northern foi realizada utilizando RNA total. qPCR foi realizado através da normalização do gene alvo a p-2-microgloublin (B2M) pelo método baseado SYBR verde usando as sequências iniciadoras como listado em S2 Tabela. Northern blotting foi realizado por electroforese o RNA total em gel de agarose formaldeído, transblotted utilizando tampão SSC, sondadas com anti-sentido sonda de ARN EpCAM marcado com biotina e desenvolvidos utilizando o método de quimioluminescência. Western blot foi realizada para analisar o nível de proteína EpCAM utilizando o protocolo padrão com anti-EpCAM (c-10) anticorpo (protocolo detalhado fornecido no arquivo S1).

Imunohistoquímica

A imuno-histoquímica (IHQ) foi realizada utilizando Novolink sistema de detecções de polímero (biossistemas Leica, Bangalore, Índia), seguindo as instruções dadas pelo fabricante, utilizando seções de-parafinado tecido RB humano. Resumidamente, a recuperação de antigénio foi realizado utilizando o método de panela de pressão, em seguida, o bloqueio da peroxidase tecido e bloqueio primária foi realizada seguindo-se incubação com o EpICD anti-anticorpo (Imgenex, India). detecção de base polimérica usando DAB cromogénio foi feito, lâminas secas foram montados e marcou para os níveis de expressão (protocolo detalhado fornecido no arquivo S1).

proliferação celular MTT ensaio

número igual de MCF7 e Weri células -Rb1 (10.000 por poço) foram semeadas, respectivamente, em uma placa de 96 poços. Depois de 24h, as células foram tratadas com 400 nM quimera aptâmero siRNA. As células também foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (LifeScience Invitrogen, Bangalore) com 200 nM de EpCAM siRNA (Qiagen, Alemanha). As células tratadas foram incubadas durante 48hat 37 ° C em 5% incubadora de CO2. Depois de 48h, o MTT (Sigma Aldrich, Bangalore) em meio fresco foi adicionado às células e incubou-se durante 4h. Os cristais formados foram dissolvidos em DMSO e absorbância foi lida a 570 nm usando espectrofotômetro SpectraMax.

In vivo

eficácia anti-tumoral de EpApt-Siep no epitélio de xenoenxerto de cancro modelo

para estudar o

in vivo

eficácia de EpApt-Siep, MCF7, modelo de cancro epitelial foi escolhida uma vez que o

in vitro

eficácia foi melhor do que a linha de células Weri-Rb1. Este estudo foi realizado nas instalações da Syngene International Pvt. Ltd., comercialmente. Todos os animais foram tratados de forma a minimizar ou eliminar a dor eo sofrimento, usando anestesia baseada isoflurano. cuidados com os animais estava em conformidade com as recomendações da Comissão para efeitos de controlo e supervisão de experiências com animais (CPCSEA), Governo da Índia e de Associação para Avaliação e Acreditação do Laboratório de Animal Care International (AAALAC). O “Formulário B ‘para a realização de experiências com animais foi analisado e aprovado pelo Syngene International Pvt. Ltd., o Comitê de Ética em Experimentação Animal Institucional (AICE Protocolo de homologação: Syngene /IAEC /430 /10-2013). Os animais foram mantidos em condições controladas e assépticas e equipados com espigas de milho, RO água esterilizada ad libitum e com ciclo de luz /escuro de 12 horas cada um. MCF7cells foram suspensos a uma concentração de 5×10

6cells em 200 ul de meio isento de soro contendo 50% de Matrigel e injectadas subcutaneamente na parte de trás de atímicos nu-Foxn1

nuovariectomized ratinhos fêmea de 7-8 semanas de idade implantados com 17β- pelotas estradiol. Uma vez que os tumores se tornaram palpáveis, os animais foram agrupados aleatoriamente com base no volume do tumor (TV≈80mm

3) e a dosagem foi iniciada. O esquema de tratamento seguido é dada em S3 Tabela. O peso corporal e volume tumoral foram medidos uma vez a cada três dias e foi calculada a% de alteração no peso corporal. Durante o sacrifício, o sangue foi recolhido sob anestesia isoflurano de todos os grupos para avaliação clínica da função hepática (TGO, TGP) função renal (BUN, Urea), esfregaço de sangue periférico para a contagem diferencial de leucócitos. tecidos e órgãos dos tumores foram excisados ​​e analisados ​​histo-patologicamente por haemotoxylin e eosina.

array de proteínas para os marcadores apoptóticos e citocinas

proteoma perfis foi realizada para estudar o mecanismo de EpApt-Siep construir Mediada actividade e para estudar o seu efeito sobre a latência de apoptose e resposta inflamatória anti-tumoral. As matrizes humanos proteína de matriz apoptose, catálogo # ARY009 e do rato do painel de matriz citocina Um catálogo # ARY006 (R D Systems, Abingdon, UK) foram realizadas seguindo as instruções do fabricante. O rato de xenoenxerto (controlo tratado com veículo com água estéril para injecção e EpApt-Siep tratada) Os tecidos lisados ​​de proteína e de soro foram preparadas através da normalização da concentração de proteína e utilizados na matriz. As matrizes foram realizadas a uma condição idêntica e desenvolvido simultaneamente para ambos os grupos de controle e tratamento usando XRS chemidoc

+ instrumento (BioRad) utilizando mesma exposição. Background normalização do sinal foi realizada e densidade de pixel integrada foi medida usando software ImageJ com o plugin perfil microarray. Foram utilizadas as diferenças entre os pontos duplicados para o cálculo do desvio-padrão e expressa como barra de erro nas parcelas do histograma.

A análise estatística

A análise estatística para o

in vitro

análise de aptâmero quimera em linhas celulares foi realizada com unpaired

t

-teste. Os experimentos foram realizados em triplicata e repetiu três vezes. Para a avaliação do significado estatístico de inibição do tumor, não emparelhado

t

-test foi realizada utilizando Graph Pad Prism V5. Os estudos de inibição de tumor foram realizadas em ratinhos de xenoenxerto com n = 8. Os valores de p inferior a 0,05 indica diferenças estatisticamente significativas entre os grupos. valor P na gama (0,01-0,05) é indicado com “*”, os valores no intervalo (0,01-0,001) com “**” e menos do que 0,001 é indicada com “#”.

resultados

quimeriza�o de EpApt com siEpCAM;

in vitro

dicer transformação mediada e celular captação

EpCAM aptamer siRNA quimera foi fabricado seguindo as estruturas anteriormente otimizadas de PSMA aptamer siRNA construção quimérica [20]. No estudo anterior, caule e quimera circuito aptâmero com troca vertente exibiu melhor silenciamento em comparação com as outras formas quiméricas. Por isso, no presente estudo, nós fabricados aptâmero quimera, estendendo a sequência aptâmero com a sequência de siRNA na sua extremidade 5 ‘e extremo 3’. O fabricada EpApt siRNA realizada siRNA alvejando EpCAM. A estrutura de haste e laço foi desenhado manualmente através da incorporação de sequência siRNA alvejando EpCAM. Além disso, o aptâmeros siRNA realizada modificação resistentes a nuclease (2’F) nas pirimidinas. A extremidade 5 ‘do aptâmero foi marcado na extremidade com FITC para monitorar a ligação aptâmero e a captação pelas células e extremidade 3’ do aptâmero conteve duas saliências de uridina que auxilia no reconhecimento e carregamento de enzima Dicer [23]. O EpApt e estruturas quiméricas aptâmeros construídos foram previstas usando RNA estrutura v5.3 e MFOLD e apresentado na Figura 1A e 1B. As ajudas EpApt em ligação a EpCAM, internalização e liberação no citoplasma da célula. O EpApt-Siep sob a influência de dicer, siRNA generates21bp que carrega no complexo RISC, orquestra inibição da tradução pela clivagem mRNA EpCAM.

A. EpCAM aptâmero previsão da estrutura secundária de MFOLD on-line. B. EpCAM aptamer siRNA construção quimérica carregando o EpCAM alvo siRNA (EpApt-Siep) é dobrado usando MFOLD on-line e o aptâmero é indicado na caixa azul eo siRNA dentro da caixa vermelha. C. EpCAM aptâmero siARN construção quimérica foi incubada com a enzima Dicer recombinante a 37 durante 18 h. As reacções foram realizadas sem Dicer como reacção de controlo. electroforese em gel de poliacrilamida das reacções com e sem enzima Dicer foram corridos em gel de 15% e coradas com EtBr. Foram observados o siRNA 21bp processados ​​e construção não transformados. D. EpCAM aptâmero siARN construto quimérico foi adicionado a células weri-Rb1 e MCF7 em tampão de ligação e analisadas por citometria de fluxo. O gráfico sobreposição mostra a retenção do aptâmero quimérico. trama E. dispersão que mostra a absorção de EpApt-Siep pela linha de células RB, weri-Rb1 e células de tumor primárias RB. F. EpCAM aptâmero siARN construto quimérico foi adicionado a células RB primárias em meio sem soro durante 2 horas a 37˚C seguido por lavagem com 1X PBS. As imagens microscópicas foram tomadas em 20X, nos termos da fase e FITC canais de células controle sozinho e células com EpApt-Siep. Os dados representam média ± SD. As experiências foram repetidas 3 vezes, independentemente, com resultados semelhantes. ** P valor da ,01-0,001; * P valor da ,05-,01.

Para a funcionalidade do sintetizados EpApt-Siep, o reconhecimento dicer é necessário. Isto foi testado através da realização de

em

ensaio in vitro dicer clivagem. A construção EpApt-Siep foi incubada com Dicer humano recombinante durante 18 h e, subsequentemente, a electroforese em gel de agarose. Os resultados revelaram 21bp e 19merproducts correspondentes ao siRNA e aptâmeros respectivamente (S1 figura). Isto foi ainda confirmado pela execução de uma página não desnaturante, foram obtidos fragmentos clivados de ~ comprimento 20-22bp (Fig 1C). Nós mais procurados para examinar a estabilidade da construção em condições que imitam fisiológicas. A construção resultou na degradação mínima ( 10% de degradação) até 72 horas em meios com e sem FBS a 10%, respectivamente. A construção em 100% de FBS foi estável até 96 horas, embora, uma ligeira degradação era evidente a duração 48h. Assim, as construções poderiam ser estável sob condições imitam fisiológicos até 72h (S1A Fig).

A captação celular estudos de EpApt-Siep são necessários para comprovar a internalização de aptâmero através de endocitose mediada pelo receptor. O aptâmero EpCAM (EpDT3 /EpApt) já foi elucidado pela endocitose mediada receptor [13] estudos .Earlier e estudo utilizou aptâmero EpCAM corrida (ScrApt), com modificação 2’OMe no backbone EpApt dificulta 13 a ligação para EpCAM [ , 19]. Semelhante ao EpApt-Siep, ScrApt quimera (ScrApt-Siep) foi construído. O ScrApt-Siep sobre quimeriza�o resultou em específico não vinculativo para as células MCF-7 (S1B FIG) e não investigada. Foi encontrada uma maior captação celular de EpApt-Siep construir em MCF7 que Weri-Rb1cells (Fig 1D). As células RB primários e a linha de células Weri-Rb1 mostrou absorção de quimera. As células RB primários foram encontrados para exibir uma maior eficiência de ligação de linhas de células, devido aos níveis mais elevados de expressão de EpCAM nas tumores (Figura 1E). A partir dos estudos microscópicos 75% das células RB primários mostrou captação do EpApt-Siep (Fig 1F).

EpApt-Siep silencia EpCAM especificamente em linhas celulares e células tumorais RB primários

O alvo entrega específica, geração de siRNA e capacidade de silenciamento foram estudados utilizando linhas celulares MCF7 Weri-Rb1 e. Uma vez que o nível de EpCAM expressão é mais elevada em células MCF7 que weri-Rb1 [24], o construto quimérico foi avaliada em primeiro lugar para o silenciamento de EpCAM em células MCF7. Os resultados Northern blotting mostrou silenciamento de EpCAM cerca de 40% em EpApt-Siep células e cerca de 25% em células Siep transfectadas normalizados para ARNr 28S (Fig 2A e painel direito a ela) tratado. Uma análise quantitativa da expressão de mRNA por qPCR mostrou melhor inibição da expressão de EpCAM, -1,8 e -3,4 regulação negativa de dobragem (73% e inibição de 90% da expressão de mRNA) na linha celular MCF7 (P 0,01) e -1,4 e -1,0 dobra regulação baixa (63% e a inibição de 51% dos níveis de ARNm) na linha weri-Rb1cell (P 0,05) (Figura 2B). A infra-regulação de EpCAM também foi observada nos níveis de proteína (Figura 2C), células weri-Rb1 exibiu 47% e 43% e MCF7 exibiu 65% e 49% da regulação negativa da proteína EpCAM (P 0,05) (Figura 2D). Os borrões do norte e ocidentais não transformados são mostrados no arquivo S2.

A. Os níveis de ARNm de EpCAM foram detectadas a partir do ARN total de controlo, Siep e EpApt-Siep tratada células MCF7 por Northern blotting. O ARN total foi submetido a electroforese em gel de agarose formaldeído, apagados e desenvolvida por um método baseado quimioluminescência. EpCAM alvo siRNA foi usada para sintetizar sonda. Por sua direita, a análise de densitometria das bandas foram realizados utilizando o software ImageJ e plotados como um gráfico com a expressão de ARNm% contra os ARNr 28S. níveis B. O mRNA EpCAM foram quantificados pelo verde SYBR base qPCR do cDNA de controle, Siep e EpApt-Siep trataram células MCF7 Weri-Rb1 e. blotting C. de Western foi executada no Siep transfectadas e EpApt-Siep tratada células MCF7 weri-Rb1 e para o EpCAM e b-tubulina. EpCAM alvo siRNA foi usada para sintetizar sonda. D. A análise de densitometria das bandas de Western blotting foi realizado utilizando o software ImageJ e plotados como um gráfico com a expressão da proteína% (EpCAM) normalizada para p-tubulina. E. A proliferação celular percentual foi quantificada através da realização de um ensaio MTT, relativa ao controlo, Siep transfectadas, EpApt-Siep, EpApt e ScrApt tratada células MCF7 weri-Rb1 e. O gráfico mostra a proliferação de células% normalizada com células de controlo. Os dados representam média ± SD. As experiências foram repetidas 3 vezes, independentemente, com resultados semelhantes. ** P valor da ,01-0,001; * P valor da ,05-,01.

O efeito da construção quimérica foi testada em células de tumor primário RB para silenciar. O funcional /metabólica activityof células primárias wasevaluated bytransfecting plasmídeo pGFP. pós 24 horas de transfecção maior parte das células mostraram muito elevada expressão (S2A figura). Isto confirmou o estado metabolicamente ativo das células primárias, que, em seguida, procurou analisar o efeito de EpApt-Siep e Siep sobre essas células. As células de tumor primário mostrou a inibição da expressão de EpCAM por -0,5 dobra e -2,4 dobra em siRNA e células construto tratada quiméricos, respectivamente (S2B figura). A citotoxicidade celular como medido pelo ensaio de LDH mostrou 37% e 35% de aumento na actividade de LDH em cima do silenciamento de EpCAM utilizando siRNA e EpApt-Siep. O EpApt-Siep construir significativamente (P 0,01) regulada negativamente os níveis de mRNA de EpCAM e causou a citotoxicidade em células de tumor RB primário (S2C FIG). A proliferação de células como uma leitura de actividade metabólica foi medida pelo ensaio de MTT. células TheWERI-Rb1 e MCF7 mostraram inibição significativa da proliferação celular com EpApt-Siep, enquanto EpApt ou ScrApt sozinho não mostraram qualquer efeito na proliferação celular (Fig 2E)

EpICD em tumores RB principais:. regulamentação do tronco do câncer marcadores de células

EpCAM foi mostrado para ser sobre-expressos em células que iniciam câncer ou progenitor cancer /células (CPC /CSCs) [25-27]-tronco. O mecanismo por trás dessa propriedade foi regulamentada pela proteólise intramembranar de EpCAM levando à liberação EpICD e deslocando ao núcleo [7] .que relataram a presença de EpCAM no início de 2004 e no presente estudo procurou-se estudar a expressão de EpICD no ensino primário tumores RB [28]. Os resultados IHC mostraram coloração nuclear intenso e a intensidade da coloração nuclear variou entre os tumores estudados. Os tumores apresentavam 40-60% de células positivas e alguns casos mostrou 70-80% de células positivas para a coloração nuclear. A retina normais estudados não revelou qualquer coloração nuclear evidente (Fig 3A). A intensidade e a distribuição percentual das células positivas EpICD no tumor são apresentadas na Tabela 1.

. A imuno-histoquímica da secção normal de retina não mostrando nenhum EpICD evidente no núcleo, secções de tecido RB mostrando coloração intensa do núcleo. A expressão de EpICD foi majoritariamente observada no núcleo das células tumorais, como mostrado pelas setas brancas. B. A mudança vezes nos níveis de ARNm de SOX2, OCT4, Nanog, CD44s, CD133 e Survivina (BIRC5) foram quantificadas por verde SYBR baseado qPCR do Siep e EpApt-Siep células tratadas weri-Rb1 e normalizada para p-2-microglobulina como gene housekeeping. C. A mudança vezes nos níveis de ARNm de SOX2, OCT4 e Nanog foram quantificados por verde SYBR baseado qPCR do Siep e EpApt-Siep tratada células MCF7 e normalizada para p-2-microglobulina como arrumação gene.Data representa a média ± DP. As experiências foram repetidas 3 vezes independentemente com resultados semelhantes ** valor P de 0,01-0,001.; * P valor da 0,05-,01.

O EpICD lançado forma complexo de proteína nuclear, interagindo com o FHL2, β-catenina e LEF1 medeia transcrições de genes e ajuda na proliferação celular. A regulamentação da EpICD na expressão de marcadores de pluripotência foram relatados anteriormente [9] e estávamos interessados ​​em estudar a modulação da EpCAM por trás da expressão de OCT4, SOX2, NANOG, CD133, CD44s. Nós, adicionalmente, estudou a expressão dos níveis de survivina mediante silenciamento de EpCAM na linha de células RB, Weri-Rb1. silenciamento EpCAM utilizando a transfecção siRNA ou EpApt-Siep apresentaram maior regulação negativa de SOX2, OCT4 e NANOG em siRNA células transfectadas em comparação com o EpApt-Siep, ao passo que a CD133, CD44s e níveis de survivina foram mais regulados negativamente em células transfectadas EpApt-Siep (Fig 3B ). Nós, adicionalmente, estudou a expressão de SOX2, OCT4 e NANOG em células MCF-7 e encontrou downregulation de SOX2 e NANOG, mas não OCT4 sobre silenciar EpCAM utilizando siRNA ou EpApt-Siep construção (Fig 3C). Assim fomos capazes de elucidar a regulação dos marcadores de células tronco por EpCAM através EpICD

EpApt-Siep regredir o câncer de mama:.

In vivo

xenotransplante estudo

O anti-tumoral efeito da EpApt-Siep foi estudada usando o cancro da mama

in vivo

modelo. As células MCF7 foram injectadas em ratinhos nus ovariectomizados bilateralmente suplementadas com estrogénio externo. A dosagem de EpApt-Siep foi realizada em dias alternados de day0 para dia14 e em day20, os animais foram doseados, 24h mais tarde, n = 4 foram sacrificados em cada grupo. A cinética de crescimento de tumor mostrou redução significativa (P 0,01) no volume do tumor, controlo de veículo apresentaram 584 milímetros

3, enquanto que o animal tratado mostrou 52 milímetros

3 significa o volume do tumor. O resto do n = 4 no grupo de controlo do veículo e grupo EpApt-Siep foram dosados ​​no dia22 e day24, mais estudada até day33. Os volumes de tumor médio no day33, para o grupo de controlo do veículo e EpApt-Siep foram 922 milímetros

3 e 64 milímetros

3, respectivamente. O perfil de crescimento do tumor para ambos os grupos durante este período é mostrada na figura 4A. foi encontrada a inibição do crescimento% tumoral (TGI) para o grupo EpApt-Siep ao nível de dosagem testado para ser 102% (Day33,

#indicates p 0,001). No day33, os ratinhos (Figura 4B) foram sacrificados e os tumores foram excisados ​​(Fig 4C), seguido de análise da expressão de marcadores de células EpCAM e haste do cancro, os fabricantes de apoptóticas e de proteínas resistentes à droga foram realizados.

cinética de crescimento do tumor de células MCF7 xenoenxerto tratado com EpApt-Siep. camundongos nu feminino (HSD: atímicos Nude-Foxn1

nu, ovariectomizados bilateralmente) alojados em gaiolas individualmente ventiladas (IVCS) foram utilizados para a presente investigação. A tumorigenicidade das células MCF7 em ratinhos é dependente de estrogénio. Vinte horas antes da injecção de células MCF-7, os animais foram implantados com pellets de 17p-estradiol (0.36mg /pellet; libertação de 60 dias; Innovative Research of America, Sarasota, FL) para a região omoplata dorsal de ratos usando trocarte. MCF-7 Células tumorais (5 X 10

6 células /animal) foram injectados por via subcutânea nos flancos dos animais. Depois de 7-10 dias após a injecção das células, os animais foram distribuídos aleatoriamente com base no volume do tumor (TV≈80mm3) e a dosagem foi iniciada. Gráfico mostrando a (A) O volume do tumor do grupo de controlo do veículo injectado com PBS por via subcutânea perto do local do tumor, EpApt-Siep injectados por via subcutânea perto do local do tumor em dias alternados. As setas laranja indicam as injeções EpApt-Siep dadas e o asterisco azul indica o dia do sacrifício. No dia 21 e 33, devido a razões experimentais e éticos animais de ambos os grupos foram sacrificados 50% em cada tempo. Fotografias dos ratos representativos (B) e os tumores excisados ​​(C) de controlo do veículo e os grupos tratados. D. Alterações na expressão de proteínas por transferência de Western de proteínas de extracção do tecido representativo dos ratinhos de controlo e ratinhos tratados com EpApt-Siep (0.6nmol) e terminadas aos 21 e 33 dias, respectivamente (no seu direito, gráfico que representa a expressão relativa calculada pela software ImageJ. E. gráfico que mostra as alterações na MCF7 do tumor de xenoenxerto de EpCAM tecido, os níveis de CD44s, CD24 e de ARNm de MRP1 após o tratamento com EpApt-Siep construir. o controlo do veículo foi utilizada para normalizar a expressão de dobragem e a microglobulina β-2 foi utilizado como controle interno. F. Gráfico que mostra as mudanças nos níveis de STMN, BIRC5, Bcl2, Bax e mRNA ATM após o tratamento com EpApt-Siep aptâmero construir normalização foi feito com tanto /não grupo de tratamento de controle do veículo. os dados representam média ± sE para a

in vivo

experimento (n = 8) e média ± SD para outros experimentos experimentos foram realizados em triplicatas ea significância foi calculado pelo teste t # P .. 0.001; ** valor P de ,01-,001; * valor P de 0,05-0,01.

o efeito da EpApt-Siep construir sobre a expressão de EpCAM e outros marcadores CSC foram estudadas entre o controle do veículo e grupo tratado (n = 2) secções de tumor coletadas de day21 e day33 respectivamente. Para verificar o efeito do silenciamento EpCAM induzida por EpApt-Siep construir, a expressão de EpCAM foi analisada por Western blot no nível de proteína, além de proteínas ABCG2 foi incluído. A análise de densitometria revelou 55% e 60% da regulação negativa da proteína EpCAM no grupo day33 day21and, enquanto a proteína ABCG2 mostrou 60% e 85% de baixa regulação dos day21 e day33 respectivamente em EpApt-Siep amostras tratadas em comparação com controlo de veículo (Fig 4D). H